Il metodo che dimostreremo oggi fornisce una soluzione ad alto rendimento per valutare la sieroconversione degli anticorpi associati alle infezioni da COVID-19 o alla vaccinazione per le analisi di routine. È interessante notare che questo approccio ci consente di valutare più epitopi sullo stesso analita. Questo ha numerose applicazioni nelle scienze biologiche, compresi gli studi di segnalazione cellulare e il monitoraggio delle risposte immunitarie.
A dimostrare questa tecnica per voi oggi sarà il Dr.Imad Tarhoni, un borsista post-dottorato nel mio laboratorio. Per iniziare, selezionare tre diverse fiale delle microsfere magnetiche con regioni di perline univoche e registrare l'ID del tallone e le informazioni sul lotto per ogni fiala utilizzata. Quindi, ruotare il calcio della microsfera selezionato per 60 secondi e sonicare per cinque minuti.
Trasferire 1,0 volte 10 alle sei perline in un tubo microcentrifuga a bassa legante proteine da 1,5 millilitri e inserire il tubo in un separatore magnetico. per consentire la separazione per 60 secondi. Con il tubo ancora nel separatore magnetico, rimuovere con cura il surnatante senza disturbare il pellet di perline.
Rimuovere il tubo dal separatore magnetico, quindi risospesciare le perline con 100 microlitri di acqua e vortice di grado HPLC per 30 secondi. Ancora una volta, riposizionare il tubo nel separatore magnetico per 60 secondi e successivamente rimuovere il surnatante. Ripetere il protocollo di lavaggio due volte.
Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere il tubo dal separatore magnetico e risospese le microsfere lavate in 90 microlitri di tampone di attivazione, pH 6,2, per vortice per 30 secondi. Successivamente, trattare sequenzialmente le microsfere con 10 microlitri da 50 milligrammi per millilitro di anidride-sulfosuccinamide e 10 microlitri da 50 milligrammi per millilitro di soluzione EDC per vortice per 10 secondi. Successivamente, incubare le microsfere per 20 minuti a temperatura ambiente con un vortice delicato ogni 10 minuti.
Dopo l'incubazione, lavare le microsfere due volte con MES 50 millimolare o tampone di accoppiamento, pH 5,0, come descritto in precedenza. Ripetere il lavaggio due volte. Una volta fatto, rimuovere il tubo dal separatore magnetico e risospese le perline con 100 microlitri di buffer di accoppiamento tramite vortice per 30 secondi, seguito immediatamente aggiungendo la quantità desiderata di proteine al tubo.
Portare il volume totale a 150 microlitri con buffer di accoppiamento e mescolare la reazione per vortice per 30 secondi. Quindi, incubare il tubo per due ore ruotando a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, lavare le microsfere due volte con tampone di tempra PBS e risospescere le microsfere lavate in 100 microlitri di tampone di tempra contenente lo 0,05% di azide di sodio mediante vortice per 30 secondi.
Contare il numero di microsfere recuperate utilizzando un contatore cellulare automatizzato e registrare la concentrazione di perline osservata. Per le prestazioni del test, risospesere le microsfere accoppiate tramite vortice per 30 secondi e sonicare per 60-90 secondi. Quindi, rimuovere la quantità richiesta di ciascun colloide di perline dal rispettivo tubo e combinare i colloidi di perline in un nuovo tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri.
Quindi, inserire il tubo in un separatore magnetico e consentire la separazione per 60 secondi. Con il tubo ancora nel separatore magnetico, rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet di perline. Dopo aver rimosso le perline dal separatore, risospese le perline in 100 microlitri di tampone di saggio.
Vortice per 30 secondi prima di posizionare il tubo in un separatore magnetico per 60 secondi per separare le perline. Ripetere il lavaggio due volte. Quindi, regolare la concentrazione della miscela di microsfere funzionanti a tre plex aggiungendo un volume appropriato di tampone di saggio per generare una concentrazione finale di 100 microsfere per un microlitro per ciascun bersaglio.
Aliquota 25 microlitri della miscela di microsfere in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Diluire i campioni di plasma o siero 500 volte nel tampone di analisi e preparare campioni standard in base alla titolazione desiderata. Aggiungere 25 microlitri di tampone di dosaggio come campione bianco e aggiungere ciascuno dei campioni diluiti o standard in ciascun pozzetto designato di una piastra campione a 96 pozzetti.
Al termine, coprire la piastra con un sigillo di alluminio o un foglio per incubare per un'ora a temperatura ambiente su uno shaker a piastre impostato su 700 rotazioni al minuto. Preparare una soluzione di anticorpi anti-umani o soluzioni anticorpali secondarie a quattro microgrammi per microlitro con tampone di saggio come descritto nel manoscritto. Posizionare la piastra su un separatore magnetico per lavare rapidamente e quindi invertire con forza la piastra su un contenitore a rischio biologico per rimuovere il liquido dai pozzetti.
Con la piastra ancora invertita, picchietta con forza la piastra contro una spessa mazzetta di carta. Quindi, lavare ogni pozzetto con 100 microlitri di tampone di saggio e rimuovere il liquido mediante inversione forzata su un contenitore a rischio biologico. Ripetere il lavaggio due volte.
Dopo l'ultimo lavaggio, scartare tutti i batuffoli di carta usati in un contenitore a rischio biologico. Quindi, aggiungere 25 microlitri di soluzione di lavoro anticorpale secondaria a ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti e coprire la piastra con un foglio di alluminio per incubare su uno shaker a piastre a 700 rotazioni al minuto. Dopo 30 minuti di incubazione, lavare i pozzetti della piastra due volte con tampone di dosaggio come dimostrato in precedenza.
Quindi, aggiungere 100 microlitri di tampone di saggio in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti. Coprire la piastra con un foglio di alluminio e incubare per cinque minuti su uno shaker a piastre a temperatura ambiente. Analizzare un campione di 60 microlitri tramite l'analizzatore dello strumento in base al manuale del sistema.
Per ottimizzare il tempo di incubazione della cattura del campione, incubare le piastre per una durata di 30, 60 e 120 minuti. Dopo l'incubazione, analizzare 60 microlitri della miscela di analisi sull'analizzatore. Una curva standard a sette punti basata su una serie di diluizioni seriali 1:5 è stata valutata per lo spike S1, gli anticorpi di membrana e il nucleocapside.
Il test di precisione intra-test è stato eseguito sulla piastra per valutare la precisione del test calcolata come coefficiente percentuale di variazione, deviazione standard e media. Per la precisione tra i test, sono stati preparati tre lotti distinti dei set di perline per ciascun test. Sono state calcolate le variabili di precisione del test con i campioni di plasma standard e umani.
I valori medi medi di intensità fluorescente mediana a 120 minuti dall'incubazione erano ottimali per i titoli IgG per lo spike S1, la membrana e gli anticorpi nucleocapsidi, indicando una rapida cinetica di legame anticorpale primario. Le ottimizzazioni della concentrazione di anticorpi secondari nelle prestazioni a doppio canale hanno dimostrato un'ampia gamma di segnali nella misurazione lineare per tutte le concentrazioni. I segnali osservati da diverse incubazioni temporali degli anticorpi secondari e i dettagli sui cambiamenti del segnale per tutti i tempi di incubazione sono mostrati qui.
Nelle valutazioni di specificità per i saggi a doppio canale, è stata osservata una contaminazione trascurabile del segnale incrociato tra il canale vuoto e il singolo canale reporter. Nell'illustrazione degli eventi di sieroconversione a seguito della vaccinazione COVID 19, i valori di picco S1 IgA e IgM osservati erano circa 40 volte inferiori ai titoli di isotipo IgG. Questo metodo ha importanti implicazioni per il monitoraggio della risposta ai vaccini in individui immunocompromessi.
Ci permetterà di determinare se questi pazienti sono veramente protetti da quelle vaccinazioni.
