Questo lavoro è finanziato da sovvenzioni NSERC a BK e RG. Gli autori desiderano inoltre ringraziare Kehe Xie e Russell Hosain per la loro competenza colorazione Golgi-Cox.

Tutti gli esperimenti sono stati condotti in accordo con il Consiglio canadese della cura degli animali e approvati dalla University of Lethbridge, Comitato Animal Care. 1. Allevamento e tattile stimolazione <ol><li> Ordina ratte gravide da fornitori comuni animali o allevare cuccioli in casa utilizzando le procedure di allevamento standard di laboratorio. </li><li> Casa di tutti gli animali in una stanza a temperatura controllata di allevamento (21 ° C), ha mantenuto una luce 12:12 hr: ciclo di buio e di fornire l&#39;accesso a cibo e acqua ad libitum. </li><li> Quando i cuccioli sono nati, ratti individualmente con la loro prole casa femminili. </li><li> Per evitare ulteriore stress correlato al maneggio subito dopo la nascita, inizia la stimolazione tattile dei cuccioli a P3. </li><li> Stimolazione tattile deve essere effettuata tre volte al giorno (09:00, 01:00 e 16:00) a partire da P3-P21 e cuccioli devono essere svezzati dalle loro madri a P21. </li><li> Quando si utilizza un disegno cucciolata croce, la metà dei cuccioli from ogni cucciolata subirà stimolazione tattile con l&#39;altra metà serve come controlli. Assegna in modo casuale un numero uguale di cuccioli maschili e femminili di ogni gruppo. Per differenziare i cuccioli si sottopongono a stimolazione e controlli tattili, segnare un gruppo di cuccioli con un pennarello indelebile sulle zampe posteriori e la coda. Marcatura deve essere riapplicato ogni altro giorno. </li></ol> Stimolazione tattile <ol start="7"><li> Rimuovere dighe dalla loro gabbia a casa e metterli in una gabbia provvisoria con cibo e acqua. Mantenere la diga e la gabbia temporanea in camera allevamento / alloggio. </li><li> Pesare cuccioli di ratto come un gruppo prima della mattina seduta di stimolazione tattile (09:00). Per ogni sessione, trasporto ratto cuccioli loro gabbie a casa per una stanza prove distinte per la stimolazione tattile. Posizionare la gabbia di casa su una piastra elettrica che è impostato a 24 ° C. </li><li> Utilizzare una scheda rigida per dividere la gabbia a casa in due metà. Mettere cuccioli di ratto nelle tattili stimolazione gruppo uno e mezzo e di controllo cuccioli nell&#39;altra metà.Impostare un timer per 15 min. </li><li> Utilizzando un morbido piumino-like, spazzolare tutti cuccioli nel gruppo stimolazione tattile allo stesso tempo per 15 min consecutivi. I cuccioli di ratto (~ P3-P12) ususally si stringono insieme e sembrano entrare in un ciclo di sonno profondo che rende molto facile per stimolare tutti i cuccioli in una sola volta. Come l&#39;cuccioli di età, diventano più attivi, con alcuni cuccioli piedi e indagare durante la sessione. Lo sperimentatore deve continuamente muoversi cuccioli che vagano nel gruppo per garantire che ogni cucciolo riceve stimoli uguali. </li><li> Una volta che la sessione di 15 min è completa, trasportare i cuccioli torna alla camera allevamento e restituire la madre alla gabbia. </li><li> Ripetere questo processo tre volte al giorno per i 19 giorni di stimolazione tattile. Dopo l&#39;ultima sessione di stimolazione tattile a P21, i cuccioli devono essere svezzati dalle loro madri. Pups devono poi essere alloggiati in gabbie con 5 o 6 altri animali svezzati dello stesso sesso. </li><li> Se i ratti stanno subendo senza ulteriori test, dovrebbero essere lasciati ONUdisturbati, la luce normale: ciclo scuro con accesso al cibo e ad acqua libitm (oltre a regolare pulizia e movimentazione gabbia) fino a raggiungere circa 100 giorni di età. Se il sottoporsi a altre manipolazioni sperimentali, gli animali devono essere trattati o testati in conformità a tali protocolli di laboratorio. </li></ol> 2. Sacrificio e Golgi-Cox colorazione <ol><li> A circa P100, somministrare una dose eccessiva di sodio pentobarbital mediante iniezione IP ai topi e profumato intracardiaca con circa 100 ml di soluzione fisiologica 0,9%. </li><li> Estrarre i cervelli quando la perfusione è completa. Rimuovere il cervello dal cranio, tagliando il nervo ottico sotto con sforzo di mantenere intatto il cervelletto, i ricercatori possono scegliere di mantenere o rimuovere i bulbi olfattivi. Posizionare cervelli estratti in una bottiglia Nalgene opaco con 20 ml di soluzione Golgi-Cox 14. </li><li> Tenere il cervello in soluzione Golgi-Cox per 14 giorni. Dopo 14 giorni, sostituire il Golgi-Csoluzione bue con una soluzione di saccarosio al 30%. Tenere il cervello nella soluzione di saccarosio per 2-5 giorni prima di sezionamento. </li></ol> Nota: Se il cervello non possono essere sezionati entro 14 giorni il trasferimento alla soluzione di saccarosio, il ricercatore ha bisogno di sostituire il saccarosio con un nuovo stock di 30% di saccarosio. Il ricercatore può sostituire il saccarosio ogni due settimane per 4 mesi senza effetti negativi sulla colorazione. <ol start="4"><li> Al fine di sezionare il cervello, il cervello dovrebbe essere asciugate e fissato alla fase di taglio con colla cyanocacrylic. Per evitare strappi o taglio irregolare, il ricercatore deve essere prudenti e garantire che l&#39;intero cervello sia saldamente fissata al palco. </li><li> Il serbatoio vibratome deve essere riempito con una soluzione di saccarosio 6% ad un livello che copre la lama di taglio. Impostare i parametri vibratome ad una velocità ed ampiezza a 5, (il punto medio su entrambe le scale). Tagliate il cervello in 200 sezioni micron e posizionare le sezioni su un micro gelatinizzato 2%ambito diapositiva. Essere sicuri di mantenere i tratti bagnati durante il corso di sezionamento. </li><li> Quando tutte le sezioni di interesse sono stati raccolti, premere sezioni sui vetrini applicando pressione per i vetrini con la carta assorbente inumidita. Conservare i vetrini in un rack scorrevole nella camera umida fino a quando non sono pronti per essere macchiato. Essi dovrebbero rimanere nella camera umida per almeno 12 ore, ma non più di 4 giorni. Le diapositive devono essere umido e non dovrebbe essere consentito di asciugare. </li><li> Preparare il reggimento colorazione prima di iniziare il processo di colorazione. Etichetta dodici piatti di colorazione del vetro (10,7 x 8,5 x 6,8 centimetri) e di processo nel modo seguente: <ol><li> Acqua distillata - 1 min </li><li> Idrossido di ammonio - 30 min (al buio) </li><li> Acqua distillata - 1 min </li><li> Kodak Fix for Film - 30 min (al buio) </li><li> Acqua distillata - 1 min </li><li> 50% di alcool - 1 min </li><li> 70% Alcohol - 1 min </li><li> 95% Alcohol - 1 min </li><li> 100% alcohol - 5 min </li><li> 100% Alcol - 5 min </li><li> Soluzione (1/3 cloroformio, 1/3 HemoDe, 1/3 100% alcool) - 15 min </li><li> HemoDe - 15 min </li></ol></li></ol> * Xilene può essere utilizzato in sostituirlo di HemoDe. Al fine di garantire la qualità della colorazione uniforme, nuove soluzioni dovrebbero essere utilizzati per ogni rack diapositiva elaborato. <ol start="8"><li> Dopo gli ultimi 15 minuti di emersione in HemoDe, coprioggetto le diapositive con Permount. </li><li> Lasciare i vetrini per asciugare prima di esaminare con un microscopio. </li></ol>

<ol>
	<li>Mychasiuk, R., Ilnystkyy, S., Kovalchuk, O., Kolb, B., Gibb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intensity+matters:+Brain,+behaviour,+and+the+epigenome+of+prenatally+stressed+rats.">Intensity matters: Brain, behaviour, and the epigenome of prenatally stressed rats.</a> Neuroscience. 180, 105-110 (2011).</li><li>Muhammad, A., Carroll, C., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+during+development+alters+dendritic+morphology+in+the+nucleus+accumbens+and+prefrontal+cortex.">Stress during development alters dendritic morphology in the nucleus accumbens and prefrontal cortex.</a> Neuroscience. 216, 103-109 (2012).</li><li>Wiesel, T., Hubel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+visual+deprivation+on+morphology+and+physiology+of+cells+in+the+cat's+lateral+geniculate+body.">Effects of visual deprivation on morphology and physiology of cells in the cat's lateral geniculate body.</a> Journal of Neurophysiology. 26 (978), 6 (1963).</li><li>Dwyer, J., McQuown, S., Leslie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+effects+of+nicotine+on+the+developing+brain.">The dynamic effects of nicotine on the developing brain.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 122, 125-139 (2009).</li><li>Richards, S., Mychasiuk, R., Kolb, B., Gibb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tactile+stimulation+during+development+alters+behaviour+and+neuroanatomical+organization+of+normal+rats.">Tactile stimulation during development alters behaviour and neuroanatomical organization of normal rats.</a> Behavioural Brain Research. 231, 86-91 (2012).</li><li>Schanberg, S., Field, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+deprivation+stress+and+supplemental+stimulation+in+the+rat+pup+and+preterm+neonate.">Sensory deprivation stress and supplemental stimulation in the rat pup and preterm neonate.</a> Child Development. 58 (6), 1431-1447 (1987).</li><li>Caldji, C., Tannenbaum, J., Sharma, S., Francis, D., Plotsky, P., Meaney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+care+during+infancy+regulates+the+development+of+neural+systems+mediating+the+expression+of+fearfulness+in+the+rat.">Maternal care during infancy regulates the development of neural systems mediating the expression of fearfulness in the rat.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (9), 5335-5340 (1998).</li><li>Imanaka, A., Morinobu, S., Toki, S., Yamamoto, S., Matsuki, A., Kozuru, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+tactile+stimulation+reverses+the+effect+of+neonatal+isolation+on+open-field+and+anxiety-like+behavior,+and+pain+sensitivity+in+male+and+female+adult+Sprague-Dawley+rats.">Neonatal tactile stimulation reverses the effect of neonatal isolation on open-field and anxiety-like behavior, and pain sensitivity in male and female adult Sprague-Dawley rats.</a> Behavioural Brain Research. 186, 91-97 (2008).</li><li>Gibb, R., Gonzalez, C., Wegenast, W., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tactile+stimulation+promotes+motor+recovery+following+cortical+injury+in+adult+rats.">Tactile stimulation promotes motor recovery following cortical injury in adult rats.</a> Behavioural Brain Research. 214 (1), 102-107 (2010).</li><li>Rodrigues, A., Artneni, N., Abel, C., Zylbersztejn, D., Chazan, R., Viola, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tactile+stimulation+and+maternal+separation+prevent+hippocampal+damage+in+rats+submitted+to+neonatal+hypoxia-ischemia.">Tactile stimulation and maternal separation prevent hippocampal damage in rats submitted to neonatal hypoxia-ischemia.</a> Brain Research. 1002, 94-99 (2004).</li><li>Kolb, B., Gibb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tactile+stimulation+after+frontal+or+parietal+cortical+injury+in+infant+rats+facilitates+functional+recovery+and+produces+synaptic+changes+in+adjacent+cortex.">Tactile stimulation after frontal or parietal cortical injury in infant rats facilitates functional recovery and produces synaptic changes in adjacent cortex.</a> Behavioural Brain Research. 214, 115-120 (2010).</li><li>Muhammad, A., Hossain, S., Pellis, S., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tactile+stimulation+during+development+attenuates+amphetamine+sensitization+and+structurally+reorganizes+prefrontal+cortex+and+striatum+in+a+sex-dependent+manner.">Tactile stimulation during development attenuates amphetamine sensitization and structurally reorganizes prefrontal cortex and striatum in a sex-dependent manner.</a> Behavioral Neuroscience. 125 (2), 161-174 (2011).</li><li>Golgi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sulla+struttura+della+sostanza+grigia+dell+cervello.">Sulla struttura della sostanza grigia dell cervello.</a> Gaz Med Lomb. 33, 244-246 .</li><li>Glaser, E. M., van der Loos, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+thick+brain+sections+by+obverse-reverse+computer+microscopy:+Application+of+a+new,+high+clarity+Golgi-Nissl+stain.">Analysis of thick brain sections by obverse-reverse computer microscopy: Application of a new, high clarity Golgi-Nissl stain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 4, 117-125 (1981).</li><li>Gibb, R., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+vibratome+sectioning+of+Golgi-Cox+stained+whole+rat+brain.">A method for vibratome sectioning of Golgi-Cox stained whole rat brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 79, 1-4 (1998).</li><li>Meaney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+care,+gene+expression,+and+the+transmission+of+individual+differences+in+stress+reactivity+across+generations.">Maternal care, gene expression, and the transmission of individual differences in stress reactivity across generations.</a> Annual Review of Neuroscience. 24, 1161-1192 (2001).</li><li>Robinson, T. E., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+plasticity+associated+with+exposure+to+drugs+of+abuse.">Structural plasticity associated with exposure to drugs of abuse.</a> Neuropharmacology. 47, 33-46 (2004).</li></ol>

Gli autori dichiarano che non abbiamo interessi finanziari concorrenti.

A causa della plasticità palese del cervello di sviluppo, è importante che le procedure sperimentali di prime esperienze sono accuratamente esaminati e tentativi di controllare per tutte le variabili intervenienti. Per questo motivo, un disegno cucciolata croce è impiegato durante la procedura di stimolazione tattile per garantire che i cuccioli stanno ricevendo esperienze simili in tutti gli altri domini di sviluppo. Inoltre, è anche importante che più cuccioli da più cucciolate sono selezionate per analisi per evitare la possibilità che gli effetti derivano da una polarizzazione in un singolo cucciolo o lettiera. Stimolazione tattile si crede di imitare il naturale comportamento materno, leccare e governare, che è pensato per essere utile allo sviluppo prole. Sebbene la ricerca precedente ha sottolineato la prima settimana di vita (P0-P7) per essere un periodo critico per leccare e governare 16, la vastità del cambiamento identificato secondo 18 giorni di tastimolazione ctile può implicare che, sebbene esistano periodi sensibili, l&#39;esposizione è più superiore. E &#39;anche importante notare che i cuccioli ricevono stimolazione tattile in questo paradigma sperimentale sperimentano anche leccare e governare dalle loro madri, quindi la stimolazione tattile è in aggiunta al normale stimolazione somministrata dalla madre. Infine, bisogna anche essere consapevoli dei cambiamenti regione-dipendente. Sebbene la stimolazione tattile durante lo sviluppo è aumentata complessità dendritiche nella corteccia prefrontale, questo non garantisce che i cambiamenti strutturali di questa natura saranno evidenti in tutte le regioni del cervello. E &#39;possibile che la morfologia neuronale in altre regioni del cervello come la corteccia parietale, risponderebbe in maniera sorprendentemente diverso per la stessa esperienza. Tuttavia, poiché la procedura di stimolazione tattile è facilmente gestito e non presenta alcun rischio per la prole o dighe, ha il potenziale per servire come uno strumento prezioso per molti studi di ricerca volti a migliorare lo sviluppoal esiti. Per quanto riguarda Golgi-Cox colorazione del tessuto cerebrale, i passaggi critici per la visualizzazione di successo di cellule neuronali sono i seguenti: 1) deve esserci un&#39;adeguata perfusione del cervello con soluzione fisiologica. Perfusione improprio o insufficiente dei risultati di tessuto cerebrale in artefatti vasi sanguigni che rendono difficile effettivamente visualizzare cellule neuronali attraverso il labirinto dei vasi sanguigni, ma anche di complicare la possibilità di fotografare i neuroni colorati. 2) cervelli perfusi devono essere conservati in soluzione Golgi-Cox e soluzione di saccarosio al buio. Conservazione del tessuto cerebrale al buio riduce la colorazione di fondo del tessuto, aumentando ancora la possibilità di visualizzare con successo le cellule neuronali qualità. 3) Tessuto cerebrale è memorizzato nella soluzione di saccarosio in seguito alla di immagazzinamento 14 giornata soluzione Golgi-Cox. Quando il tessuto viene immerso nella soluzione di saccarosio al 30% per 2-5 giorni, i cervelli sono più flessibili che impedisce la rottura e strappo delle parti quandotaglio. È importante prevenire tessuto cerebrale rimanga nella soluzione di saccarosio di maggiori periodi di tempo (a meno che la soluzione di saccarosio è continuamente sostituito con soluzione fresca) perché conservazione prolungata in saccarosio riduce la qualità della colorazione. 4) Infine, una volta che i vetrini sono stati macchiati e la copertura scivolato, devono avere il tempo sufficiente per asciugare prima visualizzazione al microscopio. Se i vetrini non sono autorizzati a ventilare adeguatamente asciutto, il tessuto potrebbe scurirsi, riducendo la visualizzazione di successo dei neuroni corticali. Cambiamenti stabili nel funzionamento psicologico e risposte comportamentali che si verificano in risposta alle esperienze sono ritenute essere facilitato dalla riorganizzazione della morfologia neuronale e connettività sinaptica 17. Poiché questi cambiamenti strutturali forniscono una risorsa misurabile per plasticità esperienza-dipendente, l&#39;uso di una procedura di colorazione affidabile è importante. Basato Questo vibratome procedura di colorazione Golgi-Cox fornisce macchia affidabilezione di rami sottili e spine dendritiche che possono non essere evidenti con altri protocolli come celloidina-embedding. Il carattere distintivo della procedura di Golgi-Cox deriva dalla sua capacità di macchiare solo una piccola frazione di elementi neuronali (1-10%), che consenta di risalire singoli neuroni per lunghe distanze. Nonostante il fatto che solo una piccola frazione di neuroni sono impregnati con la macchia, cellule che sono resi visibili, mantengono tutte le funzioni, tra cui corpo cellulare, dendriti, spine dendritiche e assoni. Inoltre, quando la procedura di colorazione viene eseguita correttamente, le cellule colorate distinguono chiaramente e distintamente su uno sfondo trasparente perché altre strutture corticali rimangono senza macchia e trasparente. Grazie alla realizzazione che cambiamenti persistenti nel funzionamento passivo devono essere correlati alla plasticità del sistema nervoso, ossia la capacità dei neuroni di modificare la loro struttura e la connettività, la procedura di colorazione Golgi-Cox fornisce ai ricercatori untecnica affidabile per visualizzare e quantificare questa plasticità.

Anche se ci sono molte tecniche riportate e utilizzate per l&#39;esame delle prime esperienze negative sulla maturazione del cervello, come lo stress perinatale 1,2, deprivazione sensoriale 3, e la tossicità della droga 4, ci sono pochissime le metodologie impiegate per esaminare gli effetti di esperienze positive in questo periodo di tempo. A parte l&#39;arricchimento ambientale, stimolazione tattile è uno dei pochi cervello migliorando trattamenti con effetti dimostrati 5. Stimolazione tattile è un metodo di stimolazione sensoriale per la pelle che simula il comportamento di ratto materno, leccare e governare. La sua accettazione generale come una manipolazione positiva nasce da studi che indicano che la stimolazione tattile migliorato la maturazione dei neonati prematuri e ratti neonati 6. Inoltre, la ricerca in laboratorio Meaney 7 ha dimostrato che alti livelli di leccare materna e governare sono legati a risultati positivi nella prole. A causa di tinfluenze positive ueste, stimolazione tattile rapidamente evoluto in una strategia correttiva volta a ridurre l&#39;ansia 8, migliorando i risultati associati a lesioni cerebrali 9-11, e attenuando droga sensibilizzazione 12. Come tale, la stimolazione tattile è una tecnica utile per la promozione delle prime esperienze positive, con una comprovata capacità di riorganizzare radicalmente la morfologia neuronale e la connettività sinaptica del cervello in via di sviluppo. Al fine di esaminare e quantificare i cambiamenti nella morfologia neuronale, è necessario visualizzare neuroni intatti. La procedura di colorazione Golgi-Cox è una modifica della tecnica di Golgi pubblicato alla fine del 1800 che fornisce colorazione discreta di un piccolo numero di neuroni completi 13. Anche se la procedura sembra macchiare i neuroni a caso e la riproducibilità è comunemente citato come difetto principale, la visualizzazione permessi piccolo tasso impregnazione del tutto l&#39;elemento neuronale, tra cui cell corpi, dendriti, le spine dendritiche, e assoni. Allo stesso modo, il tempo necessario per impregnare un dato cervello con soluzione Golgi è anche stata citata come una caduta. Tuttavia, dato che una volta colorazione è tessuto completo può essere conservata indefinitamente, e il tempo tra perfusione del cervello e visualizzazione di neuroni con un microscopio può essere completato in meno di 21 giorni, il periodo di tempo non è irragionevole. Inoltre, con piccole modifiche al protocollo, Golgi-Cox colorazione può essere efficacemente utilizzato per impregnare cervello di roditori da tutte le fasce d&#39;età. Come cambiamenti a livello strutturale sono stati collegati a modifiche permanenti alle funzioni comportamentali e psicologiche, la tecnica di pittura Golgi-Cox fornisce ai ricercatori un valido strumento per misurare la neuroplasticità.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Dichromate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P188</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercuric Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M1561</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chromate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P220</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A669-500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kodak Rapid Fix</td>
			<td>Vistek</td>
			<td>Kodak 146 4016</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH-95 &amp; Anhydrous</td>
			<td>Commercial Alcohols</td>
			<td>No Cat Numbers</td>
			<td>All other Et-OH are dilutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swiffers- Soft Feather-Like dusters</td>
			<td>Safeway</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Can be found at most grocery stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-9378</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HemoDe</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>23410</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Sp15</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>160004-365</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>062011-9</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the effects of a positive early experience, tactile stimulation, on dendritic morphology and synaptic connectivity with golgi-cox staining

Per generare cambiamenti a lungo termine nel comportamento, esperienze devono essere producendo cambiamenti stabili nella morfologia neuronale e la connettività sinaptica. Stimolazione tattile è un&#39;esperienza positiva presto che imita materna leccare e governare nel ratto. L&#39;esposizione cuccioli di ratto a questa esperienza positiva può essere completato in modo semplice e conveniente, utilizzando materiali altamente accessibili, come uno spolverino famiglia. Utilizzando un disegno cross-figliata, cuccioli sono o accarezzati o lasciati indisturbati, per 15 minuti, tre volte al giorno per tutto il periodo perinatale. Per misurare i cambiamenti neuroplastici relativi a questa prima esperienza positiva, Golgi-Cox colorazione del tessuto cerebrale viene utilizzato. Per il fatto che Golgi-Cox impregnazione macchie un numero discreto di neuroni piuttosto che tutte le cellule, la colorazione del cervello roditore con soluzione Golgi-Cox permette la visualizzazione di interi elementi neuronali, compreso il corpo cellulare, dendriti, assoni, e spine dendritiche. La procedura di colorazione is svolto per diversi giorni e richiede che il ricercatore prestare molta attenzione ai dettagli. Tuttavia, una volta colorazione è completato, l&#39;intero cervello è stato impregnato e può essere conservata indefinitamente analisi in corso. Pertanto, Golgi-Cox colorazione è una risorsa preziosa per lo studio della plasticità esperienza-dipendente.

Quando questa procedura di colorazione è stata eseguita in modo appropriato, si genera colorazione coerente e uniforme dei dendriti e spine. Vedere la Figura 1 per una rappresentazione di Golgi-Cox colorazione neuronale. Questo procedimento produce colorazione che è paragonabile al recente sviluppato metodi in vitro e può consentire la visualizzazione di campi dendritiche che sono uninterruptable incorporamento seguente tessuti. La tecnica basata vibratome per Golgi-Cox colorazione è stato trovato per produrre più diffusa colorazione dei rami terminali e neuroni piramidali, di colorazione con uno celloidina-embedded e criostatate sezionata, 15. Inoltre, poiché questo metodo di colorazione impregna l&#39;intero cervello, tutte le sezioni possono essere analizzati immediatamente o in futuro. Come la posizione di cambiamento morfologico è che non è sempre evidente quando si genera un&#39;ipotesi originale, questo processo permette l&#39;esplorazione di regioni cerebrali supplementari und impedisce smaltimento di tessuto che può essere utile in futuro. Questo metodo di colorazione può essere utilizzato per la colorazione affidabile di un cervello di ratto invecchiati (P0-vecchiaia). Tuttavia, quando la colorazione giovani cervelli (&lt;1 grammo), il cervello dovrebbe rimanere solo nella soluzione Golgi-Cox per 6 giorni, anziché 14 giorni raccomandate per cervello adulto; tutte le altre procedure sono mantenute costanti. La difficoltà principale che si possono incontrare durante questo processo di colorazione Golgi-Cox è l&#39;incapacità di produrre colorazione di alta qualità di regioni cerebrali centrali, compresa la talamo. Poiché l&#39;intero cervello è impregnato Allo stesso tempo, le regioni centrali non possono ricevere concentrazioni ideali di macchia. Nonostante questa scoperta, la tecnica di Golgi-Cox produce eccezionale colorazione di regioni sottocorticali come l&#39;ippocampo e striato. Una limitazione finale della procedura deriva dalla rimozione incompleta del sangue dal cervello durante il processo di perfusione. Il sangue può produrre artefatti nel tessuto cerebraleche rende difficile fotografare e tracciare i neuroni. Tecniche di colorazione di Golgi-Cox forniscono una misura affidabile della morfologia dendritica e neuroanatomia che è utile per una vasta gamma di studi volti a esaminare le modifiche a livello neuronale. Nell&#39;esaminare struttura neuronale nella corteccia prefrontale in seguito a stimolazione tattile nel primo periodo-postnatale, Golgi-Cox colorazione rivelato aumenti drammatici nella complessità dendritiche. Alterazioni anatomiche legate alla stimolazione tattile precoce può essere dimostrato visivamente confrontando densità delle spine dei neuroni piramidali da un ratto di controllo per piramidale neuroni da un ratto che ha subito la stimolazione tattile (vedere Figura 1). Inoltre, parametri quali arborization dendritica, lunghezza dendritica e densità delle spine possono essere calcolati e analizzati statisticamente per generare dati continuo che può essere confrontata tra animali. Per generare risultati affidabili, analisi deve essere effettuata su amminimo della tre animali per gruppo di trattamento e circa cinque neuroni per emisfero deve essere selezionato in modo casuale per ogni regione del cervello in fase di analisi. Figura 2 mostra la complessità dendritiche (spine / micron x micron di dendriti) di animali che hanno ricevuto la stimolazione tattile e animali che non . In entrambi i settori apicali e basilari dei neuroni analizzati dal mPFC (CG3), stimolazione tattile ha comportato la proliferazione dei parametri neuronali. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50694/50694fig1.jpg" /> Figura 1. A. Rappresentante fotografia di un Golgi-Cox macchiato neurone piramidale dallo strato III area CG3 in un topo che ha ricevuto la stimolazione tattile durante lo sviluppo. B. rappresentativa ingrandita (1.000 X) fotografia di spine dendritiche sui dendriti dei terminali nel settore basilare di CG3 ; l&#39;immagine più chiara a sinistra è un topo nel gruppo di controllo e l&#39;immagine più scura RIght è da un topo che ha ricevuto stimolazione tattile. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50694/50694fig2.jpg" /> Figura 2. La rappresentazione illustrativa della complessità dendritiche apicale e basilare media (spine / micron x micron) per i neuroni nella zona CG3 da ratti adulti che o hanno ricevuto la stimolazione tattile durante lo sviluppo o non abbia (* p &lt;0.01).

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Visualizing the Effects of a Positive Early Experience, Tactile Stimulation, on Dendritic Morphology and Synaptic Connectivity with Golgi-Cox Staining

Questo documento descrive le procedure per la stimolazione tattile dei cuccioli di ratto e successiva colorazione Golgi-Cox della morfologia neuronale. Stimolazione tattile è un&#39;esperienza positiva che viene somministrato nel periodo perinatale da accarezzare cuccioli con un piumino famiglia. Golgi-Cox colorazione è una procedura affidabile che consenta la visualizzazione di interi neuroni.

Visualizzare gli effetti di una prima esperienza positiva, tattile stimolazione, su dendritiche Morfologia e Synaptic connettività con Golgi-Cox colorazione

To generate longer-term changes in behavior, experiences must be producing stable changes in neuronal morphology and synaptic connectivity. Tactile ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.9K Views.  University of Lethbridge.  Questo documento descrive le procedure per la stimolazione tattile dei cuccioli di ratto e successiva colorazione Golgi-Cox della morfologia neuronale. Stimolazione tattile è un'esperienza positiva che viene somministrato nel periodo perinatale da accarezzare cuccioli con un piumino famiglia. Golgi-Cox colorazione è una procedura affidabile che consenta la visualizzazione di interi neuroni. 

Video: Visualizing the Effects of a Positive Early Experience, Tactile Stimulation, on Dendritic Morphology and Synaptic Connectivity with Golgi-Cox Staining

State-Dependency Effects on TMS:  A Look at Motive Phosphene Behavior

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability (either increasing or decreasing it) via the application of localized magnetic field pulses.1,2 Within the field of TMS, the term state dependency refers to the initial, baseline condition of the particular neural region targeted for stimulation. As can be inferred, the effects of TMS can (and do) vary according to this primary susceptibility and responsiveness of the targeted cortical area.3,4,5

In this experiment, we will examine this concept of state dependency through the elicitation and subjective experience of motive phosphenes. Phosphenes are visually perceived flashes of small lights triggered by electromagnetic pulses to the visual cortex. These small lights can assume varied characteristics depending upon which type of visual cortex is being stimulated. In this particular study, we will be targeting motive phosphenes as elicited through the stimulation of V1/V2 and the V5/MT+ complex visual regions.6

In this article, we examine the effects of visually relevant state dependency on TMS induced motive phosphenic presentations.

Stato-dipendenza Effetti sulla TMS: uno sguardo al comportamento Motive fosfene

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate ...

Ricerca

Neuroscienze

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In Vivo a due fotoni di imaging dei cambi molecolari esperienza-dipendenti nei neuroni corticali

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Veloce micro-ionoforesi di glutammato e GABA: un utile strumento per indagare l&#39;integrazione Synaptic

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the membrane with the co-transport of 3 Na+ and 1 H+ and the counter-transport of 1 K+. The stoichiometric current generated by the transport process can be monitored with whole-cell patch-clamp recordings from astrocytes. The time course of the recorded current is shaped by the time course of the glutamate concentration profile to which astrocytes are exposed, the kinetics of glutamate transporters, and the passive electrotonic properties of astrocytic membranes. Here we describe the experimental and analytical methods that can be used to record glutamate transporter currents in astrocytes and isolate the time course of glutamate clearance from all other factors that shape the waveform of astrocytic transporter currents. The methods described here can be used to estimate the lifetime of flash-uncaged and synaptically-released glutamate at astrocytic membranes in any region of the central nervous system during health and disease.

We describe an analytical method to estimate the lifetime of glutamate at astrocytic membranes from electrophysiological recordings of glutamate transporter currents in astrocytes.

Derivando La durata di Liquidazione glutammato con una analisi Deconvoluzione delle Correnti Transporter astrociti

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Imaging Neurons within Thick Brain Sections Using the Golgi-Cox Method

The Golgi-Cox method of neuron staining has been employed for more than two hundred years to advance our understanding of neuron morphology within histological brain samples. While it is preferable from a practical perspective to prepare brain sections at the greatest thickness possible, in order to increase the probability of identifying stained neurons that are fully contained within single sections, this approach is limited from a technical perspective by the working distance of high-magnification microscope objectives. We report here a protocol to stain neurons using the Golgi-Cox method in mouse brain sections that are cut at 500 &#956;m thickness, and to visualize neurons throughout the depth of these sections using an upright microscope fitted with a high-resolution 30X 1.05 N.A. silicone oil-immersion objective that has an 800 &#956;m working distance. We also report two useful variants of this protocol that may be employed to counterstain the surface of mounted brain sections with the cresyl violet Nissl stain, or to freeze whole brains for long-term storage prior to sectioning and final processing. The main protocol and its two variants produce stained thick brain sections, throughout which full neuron dendritic&#160;trees and dendrite spines may be reliably visualized and quantified.

We present a protocol for using the Golgi-Cox staining method in thick brain sections, in order to visualize neurons with long dendritic&#160;trees contained within single tissue samples. Two variants of this protocol are also presented that involve cresyl violet counterstaining, and the freezing of unprocessed brains for long-term storage.

I neuroni di imaging all&#39;interno di sezioni di cervello spesse Uso del metodo di Golgi-Cox

The Golgi-Cox method of neuron staining has been employed for more than two hundred years to advance our understanding of neuron morphology within ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and columns to facilitate brain wiring during development and information processing in developed animals. Postsynaptic neurons elaborate dendrites in type-specific patterns in specific layers to synapse with appropriate presynaptic terminals. The fly medulla neuropil is composed of 10 layers and about 750 columns; each column is innervated by dendrites of over 38 types of medulla neurons, which match with the axonal terminals of some 7 types of afferents in a type-specific fashion. This report details the procedures to image and analyze dendrites of medulla neurons. The workflow includes three sections: (i) the dual-view imaging section combines two confocal image stacks collected at orthogonal orientations into a high-resolution 3D image of dendrites; (ii) the dendrite tracing and registration section traces dendritic arbors in 3D and registers dendritic traces to the reference column array; (iii) the dendritic analysis section analyzes dendritic patterns with respect to columns and layers, including layer-specific termination and planar projection direction of dendritic arbors, and derives estimates of dendritic branching and termination frequencies. The protocols utilize custom plugins built on the open-source MIPAV (Medical Imaging Processing, Analysis, and Visualization) platform and custom toolboxes in the matrix laboratory language. Together, these protocols provide a complete workflow to analyze the dendritic routing of Drosophila medulla neurons in layers and columns, to identify cell types, and to determine defects in mutants.

Here, we show how to analyze dendritic routing of Drosophila medulla neurons in columns and layers. The workflow includes a dual-view imaging technique to improve the image quality and computational tools for tracing, registering dendritic arbors to the reference column array and for analyzing the dendritic structures in 3D space.

Analizzando dendritiche Morfologia in colonne e strati

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching variations of the neuronal dendrites within the hippocampus are implicated in cognition and memory formation. There are several approaches to Golgi staining, all of which have been useful for determining the morphological characteristics of dendritic arbors and produce a clear background. The present Golgi-Cox method, (a slight variation of the protocol that is provided with a commercial Golgi staining kit), was designed to assess how a relatively low dose of the chemotherapeutic drug 5-flurouracil (5-Fu) would affect dendritic morphology, the number of spines, and the complexity of arborization within the hippocampus. The 5-Fu significantly modulated the dendritic complexity and decreased the spine density throughout the hippocampus in a region-specific manner. The data presented show that the Golgi staining method effectively stained the mature neurons in the CA1, the CA3, and the dentate gyrus (DG) of the hippocampus. This protocol reports the details for each step so that other researchers can reliably stain tissue throughout the brain with high quality results and minimal troubleshooting.

Here we present a Golgi-Cox protocol in extensive detail. This reliable tissue stain method allows for a high-quality assessment of the cytoarchitecture in the hippocampus, and throughout the entire brain, with minimal troubleshooting.

Valutazione della complessità dendritica ippocampale nei topi invecchiati utilizzando il metodo Golgi-Cox

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

Effects of Transcranial Alternating Current Stimulation on the Primary Motor Cortex by Online Combined Approach with Transcranial Magnetic Stimulation

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) is a neuromodulatory technique able to act through sinusoidal electrical waveforms in a specific frequency and in turn modulate ongoing cortical oscillatory activity. This neurotool allows the establishment of a causal link between endogenous oscillatory activity and behavior. Most of the tACS studies have shown online effects of tACS. However, little is known about the underlying action mechanisms of this technique because of the AC-induced artifacts on Electroencephalography (EEG) signals. Here we show a unique approach to investigate online physiological frequency-specific effects of tACS of the primary motor cortex (M1) by using single pulse Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) to probe cortical excitability changes. In our setup, the TMS coil is placed over the tACS electrode while Motor Evoked Potentials (MEPs) are collected to test the effects of the ongoing M1-tACS. So far, this approach has mainly been used to study the visual and motor systems. However, the current tACS-TMS setup can pave the way for future investigations of cognitive functions. Therefore, we provide a step-by-step manual and video guidelines for the procedure.

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) allows the modulation of cortical excitability in a frequency-specific fashion. Here we show a unique approach which combines online tACS with single pulse Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) in order to "probe" cortical excitability by means of Motor Evoked Potentials.

Effetti della stimolazione transcranica con corrente alternata la corteccia motoria primaria di approccio combinato Online con stimolazione magnetica transcranica

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) is a neuromodulatory technique able to act through sinusoidal electrical waveforms in a specific ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

Combinando optogenetica con microRNA artificiali per caratterizzare gli effetti del Gene atterramento su funzione presinaptica all'interno di circuiti neuronali intatto

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the brains of AD patients, these do not improve memory functions. Since A&#946; aggregates in the brain before the appearance of memory impairments, targeting A&#946; may be inefficient for treating AD patients who already exhibit memory deficits. Therefore, downstream signaling due to A&#946; deposition should be blocked before AD development. A&#946; induces axonal degeneration, leading to the disruption of neuronal networks and memory impairments. Although there are many studies on the mechanisms of A&#946; toxicity, the source of A&#946; toxicity remains unknown. To help identify the source, we propose a novel protocol that uses microscopy, gene transfection, and live cell imaging to investigate early changes caused by A&#946; in axonal growth cones of cultured neurons. This protocol revealed that A&#946; induced clathrin-mediated endocytosis in axonal growth cones followed by growth cone collapse, demonstrating that inhibition of endocytosis prevents A&#946; toxicity. This protocol will be useful in studying the early effects of A&#946; and may lead to more efficient and preventative AD treatment.

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &amp;#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

Here a protocol to investigate the early effects of amyloid-&#946; (A&#946;) in the brain is presented. This shows that A&#946; induces clathrin-mediated endocytosis and collapse of axonal growth cones. The protocol is useful in studying early effects of A&#946; on axonal growth cones and may facilitate prevention of Alzheimer's disease.

Visualizzazione di collasso del cono di crescita assonale ed effetti precoci β amiloide in neuroni coltivati del topo

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the ...