Abbiamo sviluppato un metodo semplice per indurre una degenerazione robusta e progressiva del glaucoma basata sull'aumento temporaneo della pressione intraoculare. Ciò rappresenta un'opportunità unica per studiare i punti chiave della fisiopatologia del glaucoma. Si tratta di un modello di facile apprendimento, non invasivo, a basso costo e altamente riproducibile che consente l'analisi funzionale in vivo e disegni sperimentali a breve termine utilizzando un numero ridotto di animali per ogni esperimento.
La retina e il nervo ottico sono parti valutabili del sistema nervoso centrale, quindi modellare la progressiva compromissione di queste strutture può fornire preziose informazioni su altri disturbi neurodegenerativi. Per misurare la pressione intraoculare basale, o IOP, sia degli occhi di controllo sperimentali che controlaterali, posizionare il ratto anestetizzato in una posizione di decubito ventrale sul banco, in modo tale che la superficie corneale sia facilmente accessibile alla punta del tonometro. Posizionare la punta del tonometro in modo che tocchi leggermente perpendicolarmente la zona corneale centrale.
Quindi, acquisire la misurazione premendo il pulsante di misurazione. Successivamente, posizionare il ratto in una leggera posizione di decubito laterale sotto uno stereomicroscopio e ispezionare l'occhio sperimentale con un ingrandimento di 40 volte. Durante la procedura, mantenere lubrificato l'occhio di controllo controlaterale instillando una goccia di carmellosa sodica o ialuronato di sodio.
Successivamente, utilizzando una pinza curva, spingere delicatamente il bulbo oculare sperimentale in avanti per esporre la vascolarizzazione che circonda 360 gradi del limbus. Quindi, con l'altra mano, utilizzando un cauterizzatore oftalmico a bassa temperatura, cauterizzare delicatamente i vasi intorno alla cornea. Fare attenzione a non cauterizzare la periferia corneale.
Confermare il successo della procedura chirurgica osservando la comparsa di piccoli segni circolari di cauterizzazione sul limbus sclerale, l'obliterazione della vascolarizzazione limbare e la dilatazione della pupilla nell'occhio operato. Dopo l'intervento, controllare la IOP postoperatoria immediata in entrambi gli occhi come dimostrato in precedenza. Quindi, applicare una goccia di prednisolone acetato oftalmico sulla superficie anteriore dell'occhio sperimentale.
Dopo 40 secondi, sostituirlo con un unguento antibiotico oftalmico. Applicare un follow-up clinico quotidiano dell'occhio sperimentale con farmaci topici composti da un farmaco antinfiammatorio non steroideo e unguento antibiotico. Per l'analisi della risposta optomotoria, posizionare il ratto per l'assuefazione su una piattaforma costruita con quattro monitor di computer in un quadrilatero.
Mantieni il cursore del mirino rosso sul fotogramma video tra gli occhi del ratto che si muove liberamente, poiché indica il centro del cilindro virtuale. Osservare la risposta optomotoria consistente in un tracciamento riflessivo della testa e del collo del ratto suscitato dalle gradazioni rotanti. Inizialmente, introdurre uno stimolo con bassa frequenza spaziale, quindi aumentare progressivamente la frequenza fino a quando il movimento di tracciamento non viene notato.
Per registrare l'elettroretinogramma del modello, dopo aver anestetizzato il ratto, inserire con cautela l'elettrodo attivo alla periferia temporale della cornea. Inoltre, inserire l'elettrodo di riferimento nel tessuto sottocutaneo del canto temporale omolaterale e l'elettrodo di terra in uno degli arti posteriori. Quindi posizionare il ratto a 20 centimetri dallo schermo dello stimolo, monitorare la linea di base del segnale e avviare l'acquisizione premendo il pulsante Analisi sul sistema di acquisizione.
Dopo aver isolato le retine, trasferirle in una piastra di coltura a 24 pozzetti contenente un millilitro di PBS, mantenendo la retina interna rivolta verso l'alto. Permeabilizzare il tessuto lavando con un tensioattivo non ionico allo 0,5% diluito in PBS. Quindi, incubare il tessuto e la soluzione bloccante per un'ora a temperatura ambiente agitando delicatamente.
Durante l'incubazione, preparare la soluzione di anticorpi primari Brn-3a e conservarla a quattro gradi Celsius. Dopo il blocco dei tessuti, incubare le retine in 200 microlitri di soluzione anticorpale primaria a quattro gradi Celsius per 72 ore con agitazione delicata. Successivamente, lavare il fazzoletto con PBS.
Incubare il tessuto in 200 microlitri di soluzione anticorpale secondaria per due ore a temperatura ambiente e poi con soluzione di colorante nucleare per 10 minuti per la colorazione dei nuclei fluorescenti. Dopo tre lavaggi PBS, trasferire la retina su un vetrino da microscopio utilizzando due piccoli spazzolini mantenendo il lato vitreo rivolto verso l'alto. Posizionare il quadrante retinico dorsale verso l'alto sul vetrino del microscopio.
Infine, applicare 200 microlitri di mezzo di montaggio antisbiadimento su un vetrino coprioggetto e posizionarlo sulla retina piatta per l'analisi microscopica. Sotto un microscopio a epifluorescenza confocale, utilizzando un obiettivo di ingrandimento 40x, esaminare i supporti piatti per stimare le cellule gangliari retiniche. Dopo l'enucleazione del bulbo oculare, rimuovere il segmento prossimale della porzione intraorbitale del nervo ottico, compresa parte della porzione intraoculare.
Quindi, posizionare immediatamente i campioni in fiale o provette contenenti da 200 a 300 microlitri di fissativo freddo. Dopo due ore, lavare il tessuto con tampone freddo di cacodilato di sodio da 100 micromolari. Quindi, post-fissare il tessuto per un'ora in tetrossido di osmio all'1% e cloruro di calcio nanomolare a quattro gradi Celsius sotto agitazione delicata.
Dopo tre lavaggi con tampone di cacodilato di sodio freddo, lavare i frammenti del nervo ottico con acqua distillata fredda prima dell'incubazione notturna e acetato per orinatoio all'1% a quattro gradi Celsius. Il giorno seguente, dopo tre lavaggi con acqua, disidratare progressivamente il tessuto aumentando le concentrazioni di acetone. Quindi, eseguire tre cicli di inclusioni e soluzioni di acetone di resina epossidica prima di incorporare il tessuto in resina epossidica pura per 24 ore.
Il giorno successivo, rimuovere i campioni dal portacampioni e trasferirli negli stampi di inclusione per 48 ore a 60 gradi Celsius. Dopo la polimerizzazione, utilizzare un ultra microtomo per tagliare sezioni trasversali semisottili dei frammenti del nervo ottico. Quindi, raccogliere e trasferire le sezioni su un vetrino da microscopio.
Colorare le sezioni con blu di toluidina e visualizzarle utilizzando un microscopio ottico con un ingrandimento di 100 volte. Per l'analisi ultra strutturale, eseguire sezioni trasversali ultra sottili e raccoglierle su una griglia di rame. Quindi, colorare le sezioni con acetato per orinatoio e citrato di piombo per l'esame al microscopio elettronico a trasmissione.
La cauterizzazione a cerchio completo ha indotto l'aumento della IOP immediatamente dopo l'intervento chirurgico rispetto agli occhi di controllo. Il picco di IOP postoperatoria è stato osservato il primo giorno ed è diminuito gradualmente fino ai livelli basali il sesto giorno. Inoltre, la funzione retinica è stata valutata sia dal punto di vista comportamentale che elettrofisiologico utilizzando rispettivamente il riflesso optomotore e l'elettroretinogramma a pattern.
Dopo l'intervento chirurgico, entrambi i parametri hanno mostrato due fasi distinte di compromissione: la fase acuta dell'ipertensione oculare il terzo giorno e una fase di degenerazione secondaria il giorno 30. Rispetto ai nervi ottici di controllo, la conta assonale e le sezioni semisottili del nervo ottico trasversale sono diminuite progressivamente dopo l'intervento chirurgico. Le micrografie elettroniche di trasmissione dei nervi ottici dall'occhio di controllo hanno mostrato fibre mieliniche densamente impacchettate separate da sottili processi di cellule gliali ed evidenti microtubuli assonali e neurofilamenti.
Al contrario, dopo tre giorni di ipertensione oculare, sono state osservate alcune fibre degenerate, vacuolizzazione citoplasmatica nei processi delle cellule gliali e cromatina condensata nei nuclei delle cellule gliali. Dopo sette giorni, c'è stato un aumento delle fibre assonali degenerate e dei processi ipertonici delle cellule gliali. E dopo 14 giorni, è stata osservata una maggiore disorganizzazione delle fibre del nervo ottico associata all'invasione dei processi delle cellule gliali tra gli assoni.
Inoltre, la densità delle cellule gangliari retiniche è diminuita nel tempo principalmente nei quadranti retinici dorsali e temporali. Durante l'esecuzione di questa procedura, cercare di toccare delicatamente i vasi limbari con la punta di un cauterizzatore, risparmiando la periferia del midollo e assicurandosi che si osservino segni di cauterizzazione continui intorno al limbus sclerale. Seguendo questa procedura, è possibile applicare una varietà di metodi, come la valutazione biochimica funzionale e immunoistochimica delle strutture oculari e altri metodi che possono riconoscere la fisiopatologia del glaucoma.
