Gli autori desiderano ringraziare Jeffrey Farrell, James Gagnon, e Jennifer Bergmann per i commenti sul manoscritto. KWR è stato sostenuto dal National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program durante lo sviluppo del test FDAP. Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del NIH di AFS e da finanziamenti della Fondazione tedesca per la ricerca (Emmy Noether Program), il Max Planck Society, e il Programma Umana Frontier Science (Career Development Award) per PM.

1. Creazione di un fotoconvertibile Fusion Costruire e Iniettare dechorionated embrioni di zebrafish <ol><li> Generare un costrutto funzionale contenente la proteina di interesse fusa ad una proteina fotoconvertibile verde a rosso (vedi Discussione), quindi utilizzare la trascrizione in vitro per generare capped mRNA codificante la proteina di fusione come nel Müller et al., 2012 19. </li><li> Utilizzare pronasi per rimuovere le chorions da circa 30 embrioni di zebrafish allo stadio unicellulare. In alternativa, dechorionate manualmente embrioni usando pinze 28. Nota: Gli embrioni devono essere dechorionated per l&#39;imaging successiva. Se lo si desidera, gli embrioni possono essere iniettati attraverso il corion e dechorionated più tardi, appena prima di imaging. <ol><li> Fare un / soluzione madre ml 5 mg di pronasi da Streptomyces griseus nello standard medio embrione zebrafish 19. Rock the soluzione lentamente a temperatura ambiente per 10 minuti per consentire la proteasi a sciogliere. Aliquota 2 ml in microprovette e congelare a -20 ° C. </li><li> Trasferimento stadio unicellulare embrioni ad un vetro del diametro di 5 cm di plastica scatola di Petri agarosio rivestite contenente ~ 8 ml di mezzo embrione. Aggiungere 2 ml di soluzione di scongelata pronasi magazzino al piatto e incubare a RT per 5 a 10 min. </li><li> Evitare di esporre embrioni all&#39;aria o di plastica, come il contatto sia con causerà embrioni dechorionated rottura. Riempire un bicchiere di vetro da 200 ml con media embrione. Trasferire gli embrioni al becher inclinando la piastra di Petri mentre immergendo nel mezzo. </li><li> Dopo gli embrioni sono depositata sul fondo del bicchiere, versare la maggior parte del mezzo dell&#39;embrione, quindi versare mezzo embrione fresco nel bicchiere. Il vorticoso delicato del mezzo versare nel bicchiere fa embrioni perdono le loro chorions indeboliti. </li><li> Ripetere il punto 1.2.4. </li></ol></li><li> Trasferire gli embrioni dechorionated ad un&#39;iniezione piatto agarosio rivestite 29 con un bicchiere pipetta Pasteur con una punta fiammata. Fiammeggianteil puntale impedisce bordi frastagliati da embrioni feriti. </li><li> Co-iniettare il mRNA e 3 kDa Alexa488-destrano coniugato 29,30 (Figura 1B, vedere Consigli per suggerito mRNA e quantità Alexa488-destrano). Iniettare direttamente al centro della cella (non il tuorlo) per assicurare una distribuzione uniforme del mRNA e colorante fluorescente volta clivaggio inizio. Nota: Il segnale Alexa488 verrà utilizzato durante l&#39;analisi dei dati per generare maschere compartimentali per distinguere tra intracellulare e fluorescenza extracellulare. </li><li> Trasferimento embrioni iniettati ad un agarosio rivestite bene di un piatto a sei ben plastica pieno di media embrione 1-2%. Incubare al buio a 28 ° C fino a quando gli embrioni hanno raggiunto la fase sfera tardi 31 (circa 5 ore dopo la fecondazione). Controllare embrioni ognuno di 2 ore allo stereomicroscopio e rimuovere eventuali detriti generati da embrioni che sono morti. </li></ol> 2. Montaggio embrioni di zebrafish per Photoconversion e imaging su un invertito confocale microscopio <ol><li> Utilizzare uno stereomicroscopio per identificare 1-5 embrioni sani, e utilizzare una pipetta Pasteur di vetro con una punta fiammata per rimuoverli dal piatto. </li><li> Espellere delicatamente gli embrioni in una provetta contenente ~ 1 ml di fuso 1% a basso punto di fusione agarosio in mezzo embrione di 1x Danieau (vedi Materiali List) (Figura 2A). Nota: agarosio deve avere una temperatura compresa tra 40 e 42 ° C; temperature più elevate potrebbero danneggiare gli embrioni. </li><li> Disegnare gli embrioni di nuovo nella pipetta insieme ad alcuni agarosio. Estrarre delicatamente l&#39;agarosio ed embrioni sul vetro di copertura di un piatto fondo di vetro (Figura 2B). Assicurarsi che lo spessore del vetro di copertura è compatibile con l&#39;obiettivo del microscopio confocale. <ol><li> Riutilizzare la pipetta di vetro se lo si desidera. Per pulire l&#39;agarosio residua dalla pipetta e prevenire l&#39;intasamento, rapidamente medio embrione pipetta su e giù.Inserire un tubo 15 ml riempito con ~ 5 ml di terreno dell&#39;embrione accanto alla stereomicroscopio a questo scopo. </li></ol></li><li> Utilizzare una sonda di metallo per posizionare gli embrioni in modo che il polo animale (blastoderma) rivolto verso il vetro di copertura. Lavorare velocemente dal momento che l&#39;agarosio si solidifica in 20-30 sec. Utilizzare lo stereomicroscopio di monitorare le posizioni degli embrioni e regolare, se necessario, fino a quando l&#39;agarosio si indurisce. </li><li> Ripetere i passaggi 2,1-2,4 fino è stato montato il numero desiderato di embrioni. Nota: In un tipico esperimento, quattro gocce di agarosio contenente quattro o cinque embrioni ciascuno si adatta facilmente sul vetro di copertura. Circa 16 gli embrioni possono essere esposte in un singolo esperimento ideale (Figura 2C). </li><li> Quando l&#39;agarosio si è solidificato, riempire il piatto di vetro-basso con media embrione di 1x Danieau. </li></ol> 3. Photoconverting e misurando la diminuzione del segnale Photoconverted Un obiettivo 25X o 40X acqua is appropriato per la dimensione e l&#39;indice di rifrazione di embrioni di zebrafish. È meglio usare olio per immersione con lo stesso indice di rifrazione acqua piuttosto che acqua reale, poiché l&#39;acqua evapora durante il corso dell&#39;esperimento cinque ore. Assicurarsi che l&#39;olio di immersione è stato progettato per essere utilizzato con un acqua (non olio) obiettivo. <ol><li> Mettere un grande goccia di olio per immersione sull&#39;obiettivo di garantire che il film d&#39;olio tra l&#39;obiettivo e il vetro di copertura non si romperà come stadio si sposta diverse posizioni dell&#39;embrione durante l&#39;imaging. Saldamente posizionare il piatto fondo di vetro sul palco in modo che il piatto non si sposterà quando il palco si muove. Se possibile, utilizzare una fase riscaldata a 28 ° C, la temperatura ottimale per lo sviluppo zebrafish. </li><li> Definire la posizione di ogni embrione nel pacchetto software del microscopio confocale. Regolare la z approfondito per ogni embrione, e tentare di indirizzare o meno sullo stesso piano in ogni embrione. Nota: A proposito di 30 micron dal polo animale è un andareod profondità poiché a questa profondità dello strato avvolgente dell&#39;embrione può essere evitato, area di esposizione è massimizzata, e diffusione della luce è minima. Una singola fetta ottico con uno spessore di ~ 3,3 micron fornisce dati sufficienti; non vi è alcuna necessità di acquisire una z-stack (vedi sezione 5). </li><li> Raccogliere due segnali durante l&#39;esperimento: il segnale &quot;verde&quot; dal Alexa488-destrano coniugato-che verrà utilizzata durante l&#39;analisi dei dati per isolare extracellulare e intracellulare fluorescenza e il segnale &quot;rosso&quot; dalla proteina di fusione dopo che è photoconverted. <ol><li> Excite Alexa488 utilizzando un laser 488 nm, e raccogliere la fluorescenza emessa tra ~ 500 e 540 nm. Nota: Dopo la fotoconversione, molti verde a rosso proteine ​​fotoconvertibile (ad esempio, Dendra2) può essere eccitato con un laser 543 nm ed emettono fluorescenza tra ~ 550 e 650 nm. Regolare, se necessario, sulla base di proteina fotoconvertibile utilizzato. </li></ol></li><li> Acquisire &quot;pre-fotoconversione&quot;Le immagini, e configurare il software del microscopio confocale a immagine ciascuna delle posizioni definite in precedenza (dal punto 3.2) con le condizioni di imaging appropriate ogni 10 o 20 minuti per un corso di tempo di cinque ore (vedi sezione 5 e Discussione). </li><li> Per photoconvert la proteina di fusione, passare a un obiettivo 10X ed esporre gruppi di embrioni a luce UV da una lampada a vapori di mercurio con un filtro ~ 300-400 nm di eccitazione in uscita 100% per 2 min. Spostare l&#39;attenzione lungo l&#39;asse z per promuovere fotoconversione uniforme (vedi sezione 5). Assicurarsi che l&#39;olio di immersione non cola sulla obiettivo 10x durante fotoconversione. Nota: Lo spostamento di fuoco durante fotoconversione può essere automatizzato per evitare variabilità tra sperimentatori. </li><li> Tornare alla dell&#39;obiettivo 25X o 40X immediatamente dopo fotoconversione. Assicurarsi che le posizioni precedentemente definite dal punto 3.2 sono ancora accurate. Se il piatto spostato durante photoconversion, ri-definire le posizioni degli embrioni. <ol><li> Avviare il programma creato nel passaggio 3.4 e permette l&#39;imaging proseguire per 5 ore. Nota il tempo trascorso tra fotoconversione e l&#39;inizio delle immagini per ogni embrione. </li></ol></li><li> Controllare di tanto in tanto l&#39;esperimento. Monitorare il livello di supporto di Danieau e aggiungere più se necessario. Riavviare il software se è in fase di stallo. </li><li> Per determinare i valori di fluorescenza di fondo che verranno utilizzati durante l&#39;analisi dei dati per stimare il asintoto di un modello esponenziale decrescente, includere alcuni embrioni che sono stati iniettati con Alexa488-destrano ma non mRNA nell&#39;esperimento. Per determinare il rumore strumento, che verrà utilizzata anche durante la successiva analisi dei dati, acquisire un&#39;immagine in assenza di un campione. </li></ol> 4. Analizzare i dati utilizzando PyFDAP <ol><li> Ispezionare visivamente il tempo record di dati naturalmente da ogni embrione. Eliminare set di dati da embrioni morti durante imagING, che ha spostato in modo significativo, che hanno livelli molto bassi di segnale photoconverted, o che contengono regioni di cellule che sembrano insoliti e hanno smesso di muoversi e dividendo (tipico di embrioni feriti o ammalati). Nota: Di tanto in tanto, bolle nell&#39;olio immersione o altri artefatti appariranno in una o due immagini in un set di dati altrimenti utilizzabili. Prendere nota di eventuali immagini che contengono artefatti; saranno scartati dopo, e le restanti punti di tempo di tale insieme di dati possono ancora essere analizzati. </li><li> Utilizzare la sede a Python pacchetto software PyFDAP per analizzare i dati FDAP. PyFDAP calcola emivite determinando l&#39;intensità media intracellulare ed extracellulare fluorescenza rossa in ogni immagine ed il montaggio dei dati con un esponenziale decrescente funzione 56 (Figura 3). <ol><li> Scarica PyFDAP (vedi Elenco dei materiali). </li><li> Utilizzare PyFDAP per separare intracellulare ed extracellulare segnale photoconverted (Figura 3A, B). Noivia e il segnale Alexa488, che è strettamente intracellulare, per creare una maschera intracellulare. Applicare questa maschera per l&#39;immagine del canale rosso corrispondente per evitare pixel intracellulari da essere considerato per il calcolo dell&#39;intensità media extracellulare. Per misurare l&#39;intensità media intracellulare, invertire la maschera. </li><li> In PyFDAP, visualizzare le immagini mascherate generate nel passaggio 4.2.2. Controllare visivamente queste immagini ed eliminare set di dati in cui le maschere non distinguono accuratamente intracellulare dallo spazio extracellulare (questo dovrebbe essere raro, di notare che le membrane cellulari sono inclusi nelle immagini in cui lo spazio extracellulare è stato mascherato, ma potrebbero essere rimossi alterando la soglia algoritmo o introducendo una maschera membrana (ad esempio, utilizzando membrane-PCP)). Eliminare anche eventuali immagini singole contenenti manufatti (ad esempio, bolle nell&#39;olio immersione) identificati nella fase 4.1. </li><li> Utilizzare PyFDAP per calcolare la media intensità di fluorescenza extracellulari e intracellulari per each immagine. PyFDAP calcola queste medie sommando le intensità dei pixel che cadono al di fuori della maschera e la divisione per il numero totale di pixel sommati. </li><li> Inserire i dati di fluorescenza (Figura 3C) con la seguente funzione esponenziale: <img fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52266/52266eq1.jpg" width="159" /> dove t è il tempo post-fotoconversione, c (t) è l&#39;intensità ad un dato valore di t, c 0 è l&#39;intensità a t = 0, k è la costante di velocità di clearance, e y 0 è l&#39;asintoto che la funzione avvicina come fluorescenza diminuisce (Figura 1D). y 0 può essere limitato in base alle misure in fase 3.8 19. </li><li> Utilizzare PyFDAP per calcolare le proteine ​​extracellulari e intracellulari emivita (τ) dalle costanti di velocità di liquidazione (k) con la seguente relazione: <img fo:content-width = src &quot;1in&quot; = &quot;/ files / ftp_upload / 52.266 / 52266eq2.jpg&quot; width = &quot;153&quot; /&gt; </li></ol></li></ol> 5. Gli esperimenti di controllo per valutare Photobleaching, involontario Fotoconversione, e Fotoconversione Uniformità <ol><li> Valutare photobleaching Nota: Photobleaching potrebbe causare una riduzione di artefatti di intensità di fluorescenza che riflette le proprietà sbiancanti della proteina fluorescente in aggiunta alla clearance della proteina di interesse. <ol><li> Per valutare possibili photobleaching, eseguire una serie di esperimenti FDAP con 10 min intervalli tra immagini e una seconda serie con 20 min intervalli tra immagini (Figura 4). Analizzare i dati provenienti da due serie di esperimenti utilizzando PyFDAP come descritto nella Sezione 4. </li><li> Confrontare l&#39;emivita dei 10 e 20 intervalli min esperimenti. Emivita più lunga da 20 min esperimenti indicano intervallo significativo photobleaching. Se l&#39;emivita di entrambi gli esperimenti sono identici, photobleaching non è un problema significativo. </li><li> In alternativa, valutare photobleaching acquisendo una serie di ~ 30 immagini immediatamente dopo fotoconversione. Una diminuzione significativa fluorescenza indica significativo photobleaching. </li><li> Se viene rilevato photobleaching, usare il potere del laser più basso, diminuire il tempo di imaging, o utilizzare un più fotostabili proteine ​​fotoconvertibile 32. </li></ol></li><li> Valutare fotoconversione involontaria. Nota: Dendra2 può essere photoconverted con illuminazione 488 nm 27. Quando eccitante Alexa488 con il laser 488 nm come descritto al punto 3.3.1, fotoconversione involontaria e quindi un aumento di artefatti nella emivita apparente della proteina di interesse è possibile. Tuttavia, abbiamo altri 33 abbiamo trovato che 488 nm illuminazione è un metodo inefficiente di fotoconversione in embrioni di zebrafish. <ol><li> Utilizzare l&#39;esperimento di controllo descritto al punto 5.1.1 per rilevare fotoconversione involontaria. Confrontare l&#39;emivita dei 10 e 20 intervalli min esperimenti. Brevi tempi di dimezzamento di 20 min esperimenti indicano intervallo significativo fotoconversione involontario. Se l&#39;emivita di entrambi gli esperimenti sono identici, fotoconversione involontario non è un problema significativo. </li><li> Se viene rilevato fotoconversione involontario, utilizzare una potenza laser 488 nm inferiori e tempi di imaging più brevi per evitare inavvertitamente photoconverting Dendra2. </li></ol></li><li> Valutare uniformità fotoconversione. Nota: Se fotoconversione è polarizzato verso il polo animale dell&#39;embrione, la diminuzione della fluorescenza sarà influenzato dalla diffusione proteine ​​o movimento cellulare in piani più profondi (Figura 5A). <ol><li> Per determinare se fotoconversione è uniforme, esprimere una proteina secreta fotoconvertibile (per esperimenti con proteine ​​di fusione extracellulari) o una proteina citoplasmatica fotoconvertibile (per esperimenti con proteine ​​di fusione intracellulari). Photoconvert come al solito, tgallina acquisiscono una z-stack che comprende la maggior parte del blastoderma ogni 20 min per 80 min. </li><li> Se fotoconversione è polarizzato verso il polo animale, l&#39;intensità di fluorescenza in piani profondi aumenterà nel tempo a causa della diffusione o movimento cellulare (Figura 5B). Se viene rilevato non uniforme fotoconversione, concentrarsi più in profondità gli embrioni durante fotoconversione. </li></ol></li></ol>

Gli autori non hanno conflitti di rivelare.

Il successo di un esperimento FDAP si basa sulla generazione di una proteina di fusione fotoconvertibile funzionale. Tagging una proteina può compromettere la sua attività biologica e / o proprietà biofisiche, tra cui la sua localizzazione, solubilità, stabilità e 36-41. Siate pronti a testare l&#39;attività di diversi costrutti di fusione diversi al fine di trovare uno che è attiva. Abbiamo trovato che la modifica della posizione della proteina fotoconvertibile relativa alla proteina di interesse o ut...

I livelli di proteine ​​nelle cellule ed organismi sono determinati dalla loro tassi di produzione e passaggio. Protein dimezzamento possono variare da minuti a giorni 1-4. In molti sistemi biologici, la stabilizzazione o liquidazione di proteine ​​chiave ha effetti importanti sulla attività cellulare. È necessaria modulazione di stabilità proteina intracellulare per la progressione del ciclo cellulare 5,6, segnalazione di sviluppo 7-9, apoptosi 10, e la funzione normale e la manutenzione dei neuroni 11,12. Stabilità della proteina extracellulare influenza la distribuzione e la disponibilità di proteine ​​secrete, come morphogens 13,14, all&#39;interno di un tessuto. Negli ultimi decenni, la stabilità della proteina è stata valutata principalmente in coltura cellulare utilizzando radioattivo pulse-etichettatura o esperimenti chase cicloesimide 15. In tali esperimenti pulse-chase, le cellule sono o transitoriamente esposti ad un &quot;impulso&quot; di amino radioattiviprecursori di acidi che sono incorporati in proteine ​​di nuova sintesi, o sono esposti a cicloesimide, che inibisce la sintesi proteica. Cellule coltivate vengono poi raccolti in diversi momenti, e sia immunoprecipitazione seguita da autoradiografia (in radioattive esperimenti pulse-chase) o occidentale assorbente (in esperimenti cicloesimide) viene utilizzato per quantificare il gioco di proteine ​​nel corso del tempo. Test di stabilità proteica convenzionali hanno diverse lacune. Innanzitutto, proteine ​​in questi saggi sono spesso non espressi in loro ambienti endogeni, ma piuttosto in coltura tissutale e talvolta in cellule di specie diverse. Per proteine ​​la cui stabilità è dipendente dal contesto, questo approccio è problematico. In secondo luogo, non è possibile seguire la clearance proteine ​​in singole cellule o organismi nel tempo, ed i dati da questi saggi riflette una media delle diverse popolazioni di cellule a tempi diversi. Poiché le cellule individuali possono avere iniziatocon diverse quantità di proteine, potrebbe aver preso l&#39;etichetta o cicloesimmide radioattivo in tempi diversi, o può avere diverse cinetiche di liquidazione, tali dati aggregati potrebbero essere fuorvianti. Infine, nel caso di esperimenti chase cicloeximide, aggiunta del inibitore della sintesi proteica può avere effetti fisiologici indesiderati che potrebbero alterare artificialmente stabilità proteica 16-18. Queste carenze possono essere evitati utilizzando fluorescenza Decay Dopo Fotoconversione (FDAP), una tecnica che utilizza le proteine ​​fotoconvertibile per misurare il gioco di proteine ​​in modo dinamico in organismi viventi 19-25 (vedi la discussione per le limitazioni della tecnica FDAP). Proteine ​​fotoconvertibile sono proteine ​​fluorescenti la cui eccitazione e di emissione di proprietà cambiare dopo l&#39;esposizione a specifiche lunghezze d&#39;onda della luce 26. Una variante comunemente usata è Dendra2, una proteina fotoconvertibile &quot;green-to-rossa&quot;, che ha inizialmente excitazioni ed emissione proprietà simili alle proteine ​​fluorescenti verdi, ma dopo l&#39;esposizione a &quot;fotoconversione&quot; UV light- -il eccitazione / proprietà di emissione diventano simili a quelle delle proteine ​​fluorescenti rosse 23,27. È importante sottolineare che, nuova proteina prodotta dopo fotoconversione non avrà le stesse proprietà di eccitazione / emissione come la proteina photoconverted, permettendo disaccoppiamento della produzione e la clearance su fotoconversione e l&#39;osservazione di solo un pool di proteine ​​photoconverted. Tagging proteine ​​di interesse con le proteine ​​fotoconvertibile fornisce quindi un modo conveniente per impulsi-label proteine ​​intatte, organismi viventi otticamente accessibili. In saggi FDAP (Figura 1A), una proteina di interesse è etichettato con una proteina fotoconvertibile ed espressa in un organismo vivente (Figura 1B). La proteina di fusione è photoconverted, e la diminuzione del segnale photoconverted nel tempo è monitorato da fluorescenmicroscopia ce (Figura 1C). I dati vengono poi dotato di un modello appropriato per determinare l&#39;emivita della proteina di fusione (Figura 1D). Il test FDAP qui descritto è stato progettato per determinare l&#39;emivita extracellulari di proteine ​​di segnalazione secrete in embrioni di zebrafish durante la prima embriogenesi 19. Tuttavia, questo approccio può essere adattato a qualsiasi organismo modello trasparente che tollera imaging dal vivo, e potrebbe essere usato per monitorare il passaggio di qualsiasi proteina intracellulare o extracellulare oggetto di tag. Variazioni della tecnica qui descritta sono stati effettuati in cellule in coltura 20,23 e 22 Drosophila e topo di 21 embrioni.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>PyFDAP (download from the following website: http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Install and operate using the instructions provided on the PyFDAP website; PyFDAP is compatible with Linux, Mac, and Windows operating systems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit (Life Technologies, AM1340)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To generate capped mRNA for injection into embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488-dextran conjugate, 3 kDa (Life Technologies, D34682)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Co-inject with mRNA to create intracellular and extracellular masks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plastic dish (BD Falcon)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Incubate embryos in agarose-coated wells until ready for mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>250 mg/l Instant Ocean salt, 1 mg/l methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease from Streptomyces griseus (Sigma, P5147)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos at the one-cell stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 cm diameter glass petri dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For embryo dechorionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 ml glass beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For embryo dechorionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For injection of mRNA and dye into embryos at the one-cell stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For injecting and mounting embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Danieau&#39;s medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute low melting point agarose and perform imaging in this medium; recipe: 0.2 mm filtered solution of 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.3 mM CaCl2, 5 mM HEPES pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure low melting point agarose (Invitrogen, 16520-100)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For mounting embryos; use at a concentration of 1% in Danieau&#39;s medium: add 200 mg to 20 ml Danieau&#39;s medium, microwave until dissolved, then aliquot 1 ml into microcentrifuge tubes; aliquots can be stored at 4 &#176;C, re-melted at 70 &#176;C, and cooled to 40 - 42 &#176;C when ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette (Kimble Chase (via Fisher), 63A53WT)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For mounting embryos; flame the tip to prevent jagged edges from injuring embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For positioning embryos during mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes (MatTek, P35G-1.5-14-C)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use the appropriate cover glass thickness for your objective; part number listed here is for cover glass No. 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tube (BD Falcon) filled with ~5 ml embryo medium&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For rinsing residual agarose from the Pasteur pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted laser scanning confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A mercury arc lamp, 488 nm laser, 543 nm laser, and the appropriate filter sets are required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated stage</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To maintain embryos at the optimal temperature of 28 &#176;C during the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal software capable of time-lapse imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Must be able to define multiple positions and automatically image them at defined intervals&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25x or 40x water objective</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Objective for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x air objective</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Objective for photoconversion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Immersion oil with the same refractive index as water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring protein stability in living zebrafish embryos using fluorescence decay after photoconversion (fdap)

Stabilità della proteina influenza molti aspetti della biologia, e misurando la cinetica di clearance di proteine ​​in grado di fornire importanti informazioni nei sistemi biologici. In esperimenti FDAP, la clearance di proteine ​​negli organismi viventi può essere misurata. Una proteina di interesse è etichettato con una proteina fluorescente fotoconvertibile, espresso in vivo e photoconverted, e la diminuzione del segnale di photoconverted nel tempo è monitorato. I dati vengono poi dotata di un modello di clearance appropriato per determinare la proteina emivita. È importante sottolineare che la cinetica di clearance delle popolazioni di proteine ​​in diversi comparti dell&#39;organismo possono essere esaminati separatamente applicando maschere compartimentali. Questo approccio è stato utilizzato per determinare l&#39;emivita intra- ed extracellulari di proteine ​​di segnalazione secrete durante lo sviluppo zebrafish. Qui, descriviamo un protocollo per la sperimentazione FDAP in embrioni di zebrafish. Dovrebbe essere possibile utilizzare FDAP per determinare la cinetica di liquidazioneogni proteina oggetto di tag in ogni organismo otticamente accessibile.

FDAP è stata utilizzata per determinare l&#39;emivita di proteine ​​di segnalazione extracellulari in embrioni di zebrafish 19. Una di queste proteine, Squint, induce l&#39;espressione di geni mesendodermal durante l&#39;embriogenesi 34. Strabismo-Dendra2 attiva l&#39;espressione di geni mesendodermal a livelli simili a untagged Squint, come dimostrato da qRT-PCR e ibridazione in situ test 19. Gli embrioni sono stati co-iniettate con Alexa488 destrano e mRNA codifica Squint...

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Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

I livelli di proteine ​​nelle cellule e tessuti sono spesso strettamente regolati dal saldo della produzione di proteine ​​e di liquidazione. Usando fluorescenza Decay Dopo Fotoconversione (FDAP), la cinetica di clearance di proteine ​​possono essere sperimentalmente misurati in vivo.

Misurare Protein Stabilità in Living embrioni di zebrafish Usando fluorescenza Decay Dopo Fotoconversione (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

measuring-protein-stability-living-zebrafish-embryos-using

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

11.1K Views.  Harvard University.  I livelli di proteine ​​nelle cellule e tessuti sono spesso strettamente regolati dal saldo della produzione di proteine ​​e di liquidazione. Usando fluorescenza Decay Dopo Fotoconversione (FDAP), la cinetica di clearance di proteine ​​possono essere sperimentalmente misurati in vivo. 

Video: Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes. External development and optical transparency make these embryos especially amenable to microscopy, and numerous transgenic lines that label specific cell types with fluorescent proteins are available, making the zebrafish embryo an ideal system for visualizing the interaction of vascular, hematopoietic, and other cell types during injury and repair in vivo. Forward and reverse genetics in zebrafish are well developed, and pharmacological manipulation is possible. We describe a mechanical vascular injury model using micromanipulation techniques that exploits several of these features to study responses to vascular injury including hemostasis and blood vessel repair. Using a combination of video and timelapse microscopy, we demonstrate that this method of vascular injury results in measurable and reproducible responses during hemostasis and wound repair. This method provides a system for studying vascular injury and repair in detail in a whole animal model.

This article describes a method for creating a mechanical vessel injury in zebrafish embryos. This injury model provides a platform for studying hemostasis, injury-related inflammation, and wound healing in an organism ideally suited for real-time microscopy.

Mechanical Injury Vessel in embrioni di zebrafish

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Imaging strutture subcellulari nell&#39;embrione Living Zebrafish

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

analizzare<em&gt; In Vivo</em&gt; Migrazione cellulare utilizzando Trapianti cellulari e Time-lapse imaging in embrioni di zebrafish

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos. 
Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).

Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.

Biosensing potenziale del membrane del neurone del motore in embrioni di Zebrafish in tensione

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. The observation of Tribolium embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has multiple advantages over conventional widefield and confocal fluorescence microscopy. Due to the unique properties of a light sheet-based microscope, three dimensional images of living specimens can be recorded with high signal-to-noise ratios and significantly reduced photo-bleaching as well as photo-toxicity along multiple directions over periods that last several days. With more than four years of methodological development and a continuous increase of data, the time seems appropriate to establish standard operating procedures for the usage of light sheet technology in the Tribolium community as well as in the insect community at large. This protocol describes three mounting techniques suitable for different purposes, presents two novel custom-made transgenic Tribolium lines appropriate for long-term live imaging, suggests five fluorescent dyes to label intracellular structures of fixed embryos and provides information on data post-processing for the timely evaluation of the recorded data. Representative results concentrate on long-term live imaging, optical sectioning and the observation of the same embryo along multiple directions. The respective datasets are provided as a downloadable resource. Finally, the protocol discusses quality controls for live imaging assays, current limitations and the applicability of the outlined procedures to other insect species.
This protocol is primarily intended for developmental biologists who seek imaging solutions that outperform standard laboratory equipment. It promotes the continuous attempt to close the gap between the technically orientated laboratories/communities, which develop and refine microscopy methodologically, and the life science laboratories/communities, which require 'plug-and-play' solutions to technical challenges. Furthermore, it supports an axiomatic approach that moves the biological questions into the center of attention.

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Imaging the morphogenesis of insect embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has become state of the art. This protocol outlines and compares three mounting techniques appropriate for Tribolium castaneum embryos, introduces two novel custom-made transgenic lines well suited for live imaging, discusses essential quality controls and indicates current experimental limitations.

Luce Scheda a base di microscopia a fluorescenza di vita o fissate e colorate<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; embrioni

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system comprises a chamber featuring a simple setup that is nevertheless robust to induce and maintain a specific oxygen concentration and temperature in any experimental solution of choice. The presented system is very cost-effective but highly functional, it allows induction and sustainment of hypoxia for direct experiments in vivo and for various time periods up to 48 h.
To monitor and study the effects of hypoxia, we have employed two methods - measurement of levels of hypoxia-inducible factor 1alpha (HIF-1&#945;) in whole embryos or specific tissues and determination of retinal stem cell proliferation by 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU) incorporation into the DNA. HIF-1&#945; levels can serve as a general hypoxia marker in the whole embryo or tissue of choice, here embryonic retina. EdU incorporation into the proliferating cells of embryonic retina is a specific output of hypoxia induction. Thus, we have shown that hypoxic embryonic retinal progenitors decrease proliferation within 1 h of incubation under 5% oxygen of both frog and zebrafish embryos.
Once mastered, our setup can be employed for use with small aquatic model organisms, for direct in vivo experiments, any given time period and under normal, hypoxic or hyperoxic oxygen concentration or under any other given gas mixture.

We introduce a novel hypoxic chamber system for use with aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system is simple, robust, cost-effective and allows the induction and sustainment of hypoxia in vivo and for up to 48 h. We present 2 reproducible methods to monitor the effectiveness of hypoxia.

Induzione di ipossia in rana vivente e embryos zebrafish

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

Cella singola fotoconversione in Zebrafish intatto vivente

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the field of developmental biology. The discovery and development of photoconvertible proteins have greatly aided our understanding of these dynamic changes by providing a method to optically highlight cells and tissues. However, while photoconversion, time-lapse microscopy, and subsequent image analysis have proven to be very successful in uncovering cellular dynamics in organs such as the brain or the eye, this approach is generally not used in the developing heart due to challenges posed by the rapid movement of the heart during the cardiac cycle. This protocol consists of two parts. The first part describes a method for photoconverting and subsequently tracking endocardial cells (EdCs) during zebrafish atrioventricular canal (AVC) and atrioventricular heart valve development. The method involves temporally stopping the heart with a drug in order for accurate photoconversion to take place. Hearts are allowed to resume beating upon removal of the drug and embryonic development continues normally until the heart is stopped again for high-resolution imaging of photoconverted EdCs at a later developmental time point. The second part of the protocol describes an image analysis method to quantify the length of a photoconverted or non-photoconverted region in the AVC in young embryos by mapping the fluorescent signal from the three-dimensional structure onto a two-dimensional map. Together, the two parts of the protocol allows one to examine the origin and behavior of cells that make up the zebrafish AVC and atrioventricular heart valve, and can potentially be applied for studying mutants, morphants, or embryos that have been treated with reagents that disrupt AVC and/or valve development.

This protocol describes a method for the photoconversion of Kaede fluorescent protein in endocardial cells of the living zebrafish embryo that enables the tracking of endocardial cells during atrioventricular canal and atrioventricular heart valve development.

Seguendo i movimenti del tessuto Endocardial tramite cella fotoconversione nell'embrione di pesce zebra

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

Intero Monte Immunohistochimica in Embrioni e Larve di pesce zebra

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

Visualizzare il cervello in via di sviluppo nel pesce zebra vivente utilizzando Brainbow e Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...