Questo protocollo delineerà un modo semplice ed efficiente per isolare con successo le cellule dell'epitelio pigmentato retinico primario del topo. Le cellule dell'epitelio pigmentato retinico svolgono un ruolo molto importante per mantenere le cellule fotorecettrici e per garantire la normale funzione della retina. Il nostro laboratorio ha isolato le cellule primarie dell'epitelio pigmentato del topo come uno strumento importante per studiare la barriera emato-retinica esterna e le malattie correlate come la degenerazione maculare legata all'età.
Per estrarre gli occhi del topo, eutanasia etica del topo secondo i metodi approvati dalla tua istituzione, quindi posiziona il topo su un sottoscocca sterile e nuclea l'occhio premendo una pinzetta stile 5/45 sull'area orbitale per indurre la proptosi, quindi sposta la pinzetta nella parte posteriore dell'occhio e tira delicatamente per rimuovere l'occhio assicurandoti che il nervo ottico sia ancora intatto. Durante l'utilizzo di una pinza, immergere gli occhi in un tubo di microcentrifuga da 2 millilitri contenente il 5% di iodio povidone. Incubare gli occhi a temperatura ambiente per 2 o 3 minuti.
Rimuovere gli occhi dallo iodio povidone e metterli in una capsula di Petri. Durante l'utilizzo di una pipetta di trasferimento sterile, lavare gli occhi con la soluzione salina bilanciata di Hanks fino a quando il colore arancione dello iodio povidone è sparito. Questo richiede circa 2 o 3 lavaggi.
Posizionare gli occhi in una nuova capsula di Petri e immergerli in mezzi di crescita cellulare RPE completi e freddi. Da lì, puoi iniziare a sezionare sotto un microscopio da dissezione. Al microscopio, utilizzare pinzette e / o forbici Vannas per tirare o tagliare via il tessuto connettivo nei muscoli extraoculari.
Gli occhi possono quindi essere tenuti per un'ora in terreni di coltura cellulare RPE freddi. Tuttavia, è preferibile procedere direttamente al passaggio successivo dopo aver pulito il bulbo oculare. Trasferire gli occhi in un tubo di microcentrifuga da 2 millilitri contenente la soluzione di enzima A, quindi incubare gli occhi all'interno di un'incubatrice a 37 gradi Celsius per 40 minuti.
Rimuovere gli occhi dalla soluzione dell'enzima A e metterli in una nuova provetta da microcentrifuga da 2 millilitri contenente la soluzione di enzima B, quindi posizionarli all'interno di un incubatore e incubare a 37 gradi Celsius per 50 minuti. Rimuovere gli occhi dall'enzima B e metterli in una piastra di Petri da 60 millimetri e immergerli e completare i mezzi di crescita delle cellule RPE, quindi incubare gli occhi a 4 gradi Celsius per 30 minuti. Posizionare il piatto sotto il microscopio da dissezione e iniziare a sezionare.
Utilizzare una pinza M5S e un ago di una siringa per fare un'incisione nella sezione ora seratta. Ora con due pinze, afferrare la parte interna dell'incisione con una pinza e afferrare la cornea con l'altra pinza. Inizia a strappare lentamente la cornea dalla retina tirando la cornea.
Assicurati di strappare in piccoli incrementi e spostarti verso il basso mentre rimuovi la cornea. Ciò garantirà che l'RPE rimanga per lo più intatto e si otterrà uno strappo più pulito. Una volta che la cornea è completamente staccata, dovresti essere in grado di vedere l'iride e la lente.
Rimuovere sia l'iride che la lente con una pinza per mantenere la purezza dell'isolamento. Per rimuovere la retina neurale dallo strato RPE, afferrare lo strato esterno del bulbo oculare con una pinzetta e posizionare un braccio di una seconda pinzetta tra entrambi gli strati RPE e neurali. Da lì, tirare delicatamente o raccogliere la retina neurale lontano dallo strato RPE, quindi scartare la retina neurale.
Spostate il livello RPE in un punto diverso del piatto privo di detriti. Per separare l'RPE dalla coroide e dalla sclera, raschiare delicatamente l'interno della concia oculare con una pinzetta stile 5/45 per garantire la separazione delle cellule RPE. Le celle RPE appaiono torbide quando sospese e completano il mezzo di crescita delle cellule RPE.
Aspirare le cellule utilizzando una pipetta di trasferimento sterile da 3,2 millilitri e trasferirle in una nuova provetta da centrifuga da 15 millilitri contenente un mezzo di crescita completo delle cellule RPE. Le celle possono essere centrifugate a 300g per 10 minuti a temperatura ambiente. È quindi possibile aspirare il surnatante e risospendere il pellet in mezzi di crescita cellulari RPE riscaldati.
Placcare le cellule su una piastra di Petri da 100 millimetri e incubare a 37 gradi Celsius e 5% CO2. Queste immagini mostrano un isolamento riuscito al passaggio 0 e al passaggio 1, che è evidente dalla pigmentazione delle cellule RPE. Al passaggio 4, le cellule diventano meno caratteristiche e mostrano meno pigmento, mostrano un aspetto simile a un fuso o diventano più robuste con una superficie più ampia.
Abbiamo convalidato le cellule RPE con un marcatore specifico RPE, RPE65 e una proteina citoscheletrica F-actina. Abbiamo anche controllato la potenziale contaminazione con le cellule di Muller colorando con un marcatore specifico della cellula di Muller, la vimentina. Questo protocollo è un adattamento semplificato dei protocolli esistenti.
Il protocollo utilizza materiali e attrezzature associate disponibili nella maggior parte dei laboratori di ricerca, che aiuteranno a isolare le cellule RPE primarie del topo in modo efficace.
