Questo protocollo consente l'isolamento e la coltura efficienti delle celle RPE del mouse. Le colture RPE primarie sane sono modelli preziosi per comprendere i meccanismi delle malattie oculari sottostanti. Le colture RPE confluenti e vitali ottengono entro tre giorni e possono essere coltivate per settimane.
Questo protocollo è stato utilizzato con successo per comprendere i meccanismi alla base della degenerazione maculare legata alla prima età, che è la principale causa di cecità tra gli anziani nei paesi sviluppati. È importante visualizzare i passaggi di dissezione. I dettagli sono fondamentali per il successo del protocollo, ad esempio, come gestire i bulbi oculari in modo che lo sclera non venga perforato, dove dovrebbero essere eseguiti esattamente i tagli e come incorporare le coppe degli occhi nella tripparina in modo che rimangano aperte.
Inizia con la preparazione di tutti i reagenti necessari per il protocollo. Quindi, inizia a pulire il bulbo oculare rimuovendo attentamente tutto il tessuto connettivo, il sangue e i muscoli, usando le forcelle dumont numero cinque e le forbici angolate, senza fare alcun taglio nella sclera. Trasferire regolarmente il bulbo oculare su un piatto fresco contenente tre millilitri di tampone HBSS privo di HEPES per mantenere l'occhio fresco e pulito ed evitare qualsiasi contaminazione.
Utilizzare il nervo ottico come maniglia per tenere il bulbo oculare e fare un buco al centro della cornea con una lama in acciaio al carbonio acuto numero 11. Fai tre incisioni nella cornea attraverso il foro con le forbici Dumont numero cinque, assicurando che ci sia spazio sufficiente per rimuovere l'obiettivo. Tenere il nervo ottico e applicare una leggera pressione all'ora serrata con la base delle forbici angolate, fino a quando l'obiettivo esce completamente.
Mantenere intatto l'epitelio dell'iride per prevenire il distacco della retina neurale e dell'RPE durante l'incubazione. Posizionare l'occhio nel buffer HBSS privo di HEPES. Incubare gli occhi senza lenti in soluzione di ialuronidasi a 37 gradi Celsius per 45 minuti in un incubatore aerato di anidride carbonica al 5% per staccare la retina neurale dall'RPE.
Mettere ogni occhio in un nuovo pozzo con 1,5 millilitri di tampone HBSS HEPES freddo per pozzo e incubarlo sul ghiaccio per 30 minuti. Dopo il lavaggio, mettere ogni occhio in un piatto di coltura di 35 millimetri con tampone HEPES HBSS fresco. Tagliare la cornea attraverso le incisioni originali con forbici Vannas di otto centimetri fino a raggiungere l'ora serrata, quindi tagliare sotto l'ora serrata per rimuovere l'epitelio dell'iride e la cornea.
Tenere l'ora serrata con pinzette curve e utilizzando micro pinze angolate, allontanare la retina neurale, assicurandosi che lo strato RPE non sia tagliato. Quindi, tagliare l'attacco interno al nervo ottico. Tagliare il nervo ottico e trasferire ogni tazza per gli occhi su una diversa piastra di 12 pozzi contenente 1,5 millilitri di tripside-EDTA fresco per pozzo.
Assicurarsi che le coppe per gli occhi rimangano aperte e completamente immerse nella tripina. Incubare le coppe oculari a 37 gradi Celsius per 45 minuti in un incubatore di anidride carbonica al 5%. Raccogliere ogni tazza per gli occhi insieme a eventuali fogli RPE staccati durante l'incubazione della tripparina e trasferirli in una piastra di 12 pozzi contenenti 1,5 millilitri di soluzione FBS per pozzo.
Se i fogli RPE rimangono nella soluzione di tripina, utilizzare una micropipetta per trasferirli al pozzo con la soluzione FBS. Tenere ogni tazza per gli occhi dal nervo ottico e scuoterla a faccia in giù nella piastra del pozzo 12 contenente 1,5 millilitri di 20%FBS nel buffer HBSS HEPES fino a raggiungere il completo distacco dei fogli RPE. Raccogliere eventuali fogli RPE e cluster RPE con una micropipetta, evitando pezzi bianchi di sclera o coroide, che potrebbero contaminare le colture, e metterli in un tubo da 15 millilitri.
Tirare due occhi dallo stesso mouse in un tubo. Quindi, centrifugare la miscela RPE a 340 x g per due minuti a temperatura ambiente e scartare il supernatante. Rimossare delicatamente il pellet di RPE in una miscela millilitro dello 0,25% di tripsiderina-EDTA e incubarlo per un minuto in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per disaggregare i fogli RPE in singole cellule.
Quindi pipettare delicatamente su e giù 10 volte, evitando la formazione di bolle. Aggiungere nove millilitri di mezzo RPE appena preparato per diluire e inattivare la tripparina e centrifugare la miscela a 340 x g per due minuti a temperatura ambiente. Aspirare il supernatante e rimescolare con cura il pellet cellulare in 150 microlitri di mezzo RPE con 5%FBS.
Successivamente, rimuovere pbs dalla camera inferiore dell'inserto a membrana rivestito in laminina precedentemente preparato e aggiungere 700 microlitri di mezzo RPE ad esso. Rimuovere la laminina dalla camera superiore dell'inserto della membrana e distribuire la sospensione cellulare RPE in modo drop-wise e uniformemente al centro della camera. Posizionare l'inserto della membrana indisturbato in un incubatore di anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius per almeno 24 ore.
Quindi controllare l'inserto della membrana al microscopio per assicurarsi che la maggior parte delle cellule RPE siano attaccate all'inserto e che la confluenza sia almeno del 50%Non cambiare il supporto durante le prime 72 ore. Le cellule RPE isolate utilizzando questo protocollo mostravano le dimensioni, la morfologia e la pigmentazione tipiche dell'RPE. Dopo una settimana è stato osservato un monostrato RPE altamente polarizzato con due nuclei uniti da giunzioni strette, insieme alla presenza di microvilli apicali e informazioni basali.
La polarizzazione del monostrato RPE è stata confermata dai valori TER, con una media superiore a 200 ohm centimetro al quadrato, che è rimasta stabile nel tempo. Nei test di fagocitosi eseguiti su POS bovino etichettato FITC, è stato osservato l'inghiottimento e la digestione del POS, indicando la formazione di un monostrato confluente funzionale di cellule RPE. Le culture vitali richiedono un breve tempo di dissezione, che si ottiene con l'esperienza.
Alcune cellule RPE possono rimanere attaccate alla retina neurale, ma se rimangono allegati più fogli RPE, il protocollo non avrà esito positivo. L'ialuronidasi fresca deve essere utilizzata ogni volta per prevenire questo problema. Queste colture funzionali di cellule RPE del topo primario sono uno strumento prezioso per studiare la patobiologia dell'RPE in molte malattie degli occhi.
Ad esempio, questo protocollo ha permesso di studiare la patobiologia dell'RPE in un modello di topo di degenerazione maculare.
