Isolamento delle cellule epiteliali pigmentate retiniche da occhi di porcellino d'India

L'epitelio pigmentato retinico o RPE è fondamentale per la salute della retina. E studiare l'RPE isolato è fondamentale per la malattia della retina. Questo metodo di isolamento RPE dalla cavia, un modello di miopia popolare, aiuta a risolvere il problema impegnativo.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che è relativamente semplice e produce campioni RPE di alta qualità adatti per gli studi molecolari biologici, compresa l'analisi RPE. Seguendo perfettamente la tecnica dimostrata e osservando come manipolare gli strumenti di dissezione, si può padroneggiare rapidamente questa procedura con un po 'di pratica. Dopo aver eutanasia umana la cavia ed enuclemangiato gli occhi dell'animale, lavare immediatamente gli occhi trasferendoli in una capsula di Petri di 10 centimetri contenente soluzione salina tamponata con fosfato sterile o PBS.

Dopo il lavaggio, trasferire gli occhi alla soluzione PBS fresca. Ora lavorando al microscopio da dissezione, utilizzare un ago calibro 18 per fare una piccola apertura iniziale nella sclera di un occhio, circa un millimetro dietro il confine limbare tra la cornea e la sclera. Usando le forbici, rimuovere il segmento anteriore, compresa la cornea, l'iride, il corpo ciliare e il cristallino.

Quindi, lavorando con un segmento oculare posteriore rimanente, utilizzare una pinza per afferrare e tirare delicatamente la zonula di Zinn, seguita dal distacco della retina dal complesso RPE / coroide / sclera e rimuovendo la retina senza frammentazione. Dopo che la retina è stata completamente rimossa, immergere la concia oculare posteriore rimanente, che include RPE, coroide e sclera in uno dei pozzetti di una piastra a 12 pozzetti contenente due millilitri di reagente di stoccaggio dei tessuti e tenerlo immerso per cinque minuti. Per risciacquare il reagente di stoccaggio, trasferire la concia oculare in un altro pozzetto riempito con quattro millilitri di PBS per 10 secondi prima di spostarlo in un terzo pozzetto riempito con due millilitri di PBS.

Prima di procedere alla fase finale di isolamento RPE, preparare una siringa da un millilitro riempita con PBS e collegare un ago da 30 gauge. Spingere delicatamente sullo stantuffo della siringa per creare una corrente a getto di PBS. Lavorando al microscopio, in primo luogo, punta questo flusso di PBS verso l'RPE per fare un piccolo strappo o un buco in esso.

Quindi dirigere il flusso di PBS nell'apertura creata per staccare l'RPE come un foglio dalla coroide. Dopo aver staccato l'RPE dalla coroide, raccogliere le cellule RPE in una siringa senza ago da un millilitro e trasferire il campione raccolto in una provetta da 1,5 millilitri. Centrifugare il tubo con l'RPE raccolto a 8.000 x g per un minuto per ottenere un pellet RPE.

Per i campioni da utilizzare nelle analisi dell'RNA, scartare il surnatante, cioè la soluzione PBS, e sostituirlo con 350 millilitri di tampone di lisi incluso nei kit di isolamento dell'RNA. Pipet il contenuto su e giù 20 volte per mescolare bene e preservare la qualità del campione. Per la conservazione e la conservazione a lungo termine, trasferire i campioni in un congelatore a meno 80 gradi Celsius.

Utilizzare un kit di isolamento dell'RNA e seguire le istruzioni del produttore per isolare e raccogliere l'RNA dai campioni RPE prima di valutare la qualità del campione tramite elettroforesi. Nel nostro studio, i campioni di RPE raccolti hanno mostrato RNA ben conservato con un numero di integrità dell'RNA o RIN superiore a otto. Il conteggio totale dell'RNA di circa 240 nanogrammi per occhio.

Il livello di espressione del gene specifico RPE, Rpe65, è risultato essere significativamente più alto nei campioni RPE rispetto alla coroide e alla sclera. Al contrario, i campioni di RPE hanno mostrato un'espressione minima del gene specifico della sclera coroidea selezionato, collagene di tipo alfa-one, indicando l'assenza di contaminanti coroideali e sclerali nei campioni RPE isolati. Il passo più importante della procedura è la rimozione graduale della retina senza lasciare alcun frammento retinico.

Questa procedura di isolamento RPE merita la spiegazione degli studi di coltura cellulare in vitro con alcune importanti differenze, tra cui la scelta dei mezzi per immergere le cellule RPE dopo l'isolamento.