La tecnica di chiarezza descritta per la prima volta nel 2013 è una tecnica di compensazione dei tessuti che consente il campionamento di grandi quantità di cellule, vasi sanguigni, quindi anche proteine come una singola risoluzione cellulare in spesse fette di cervello. Questa tecnica consente lo studio di strutture microscopiche intatte rendendo trasparente l'intero cervello. Questo protocollo è un chip semplice e una pipeline diretta per la pulizia dei tessuti.
Questa tecnica può essere utilizzata per eliminare i tessuti in altri sistemi oltre ai tessuti cerebrali. Per iniziare, sigillare il tubo e il cappuccio usando il parafilm e forare due fori nel cappuccio. Quindi trasferire il gas azoto dal serbatoio utilizzando un tubo flessibile con un diametro interno di cinque millimetri e un ago calibro 19 collegato alla sua estremità.
Iniziare il degasaggio attaccando il tubo al tubo e consentendo lo scambio di gas per 30 minuti a temperatura ambiente. Staccare il tubo e sigillare immediatamente i fori con argilla modellante. Quindi trasferire i tubi sigillati degas in un bagno di 37 gradi Celsius per 3 1/2 ore per polimerizzare la soluzione di idrogel.
Togli il cervello dal tubo. Utilizzando salviette da laboratorio, rimuovere l'idrogel polimerizzato intorno al cervello assicurando che nessun gel residuo rimanga attaccato alla superficie del cervello. Dividi il cervello in fette spesse che contengono tutte le aree di interesse.
Mettere le fette nella prima soluzione di compensazione e incubare a 37 gradi Celsius con rotazione a 70 RPM per 24 ore. Nel frattempo, prepara un tubo perforato per posizionare il cervello. Mettere il tubo perforato in un becher riempito con una seconda soluzione di compensazione su un dispositivo di agitazione.
Quindi posizionare il cervello nel becher e sigillarlo con un foglio di alluminio per evitare lo sbiancamento. Dopo che il tessuto diventa trasparente, trasferire il cervello in PBST in incubazione a 37 gradi Celsius con rotazione a 70 RPM per 24 ore. Sostituire la soluzione con PBST fresco e continuare l'incubazione per altre 24 ore.
Quindi trasferire il cervello a PBS a temperatura ambiente per 24 ore. Dopo 24 ore, rimuovere il cervello dalla PBS e trasferirlo in una soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione. Incubare il cervello a 37 gradi Celsius durante la notte.
Innanzitutto, posizionare il campione al centro della diapositiva. Usando la colla a caldo, crea pareti sui bordi della diapositiva, quasi alte come il tessuto. Assicurati di lasciare un piccolo spazio in uno degli angoli.
Quando lo strato di colla a caldo si avvicina all'altezza della fetta di cervello, applicare una o due gocce della soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione sul campione per inumidire la superficie superiore e prevenire la formazione di bolle. Mentre la colla a caldo è ancora liquida, sigillare la parte superiore con un coperchio, posizionandolo nel modo più uniforme possibile, quindi riempire la camera con la soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione. Chiudere lo spazio con la colla a caldo.
Se le pareti di colla a caldo si estendono oltre i bordi della diapositiva, tagliare i bordi estensibili. Se per l'imaging viene utilizzato un obiettivo di immersione in olio, aggiungere altri due o tre millimetri di colla alle pareti sopra lo slittamento del coperchio per mantenere la soluzione di immersione. Dopo questo protocollo, il tessuto cerebrale verrà eliminato.
Sono state preparate chiare fette di cervello utilizzando questo protocollo per visualizzare popolazioni di astrociti e neuroni nella regione CA1 dell'ippocampo del topo. Tutti gli astrociti hanno espresso tdTomato e neuroni eccitatori che hanno espresso H2B-GFP nei loro nuclei. La camera preparata per il tessuto chiarificato era ottimale per l'imaging al microscopio a due fotoni o confocali.
Utilizzando un microscopio a due fotoni, sono stati osservati oltre 300 astrociti in una sezione eliminata della regione CA1 dell'ippocampo del topo. Gli astrociti ippocampali nelle cellule rosse e piramidali, i somata in verde erano visibili e il tessuto spesso e trasparente che rappresentava la vicinanza spaziale tra questi due tipi di cellule. Utilizzando un microscopio confocale laser a scansione, i fasci assonali dei neuroni eccitatori sono stati tracciati su un intero emisfero.
I fasci verdi sono stati tracciati dall'ippocampo dorsale verso i corpi super mamillari. I fasci rossi sono stati tracciati dai corpi mamillari verso la loro origine nell'ippocampo di sfiato. Fattori come la temperatura, le concentrazioni e il tempo di incubazione hanno influenzato l'esito della procedura di chiarezza.
Pertanto, la precisione in ogni fase del protocollo è vitale per il successo del raggiungimento di tessuti chiari. Usando questa tecnica, misuriamo le distanze tra neuroni e astrociti in diverse strutture cerebrali. Questo protocollo ha permesso l'analisi di due o tre ordini di grandezza in più di cellule rispetto agli studi precedenti.
