Questo protocollo fornisce una panoramica passo-passo su come preparare le perle per la pulizia dell'affinità e la proteolisi delle proteine e come utilizzarle nella determinazione delle proteine a bassa abbondanza da microcampioni essiccati. Il vantaggio principale è che ti vengono forniti gli strumenti per preparare ed eseguire campionamenti altamente efficienti di campioni complessi da volumi molto piccoli. Questo metodo può essere adattato ad altri biomarcatori proteici purché si abbia accesso ad anticorpi efficienti per catturare la proteina o il peptide proteotipico.
È necessario fare molta attenzione quando si regola il pH per il trattamento acido dell'anticorpo, soprattutto se si prepara un piccolo volume di perline. Per iniziare, trasferire il volume desiderato di soluzione anticorpale in una provetta da microcentrifuga a basso legame proteico da cinque millilitri e aggiungere una piccola barra di agitazione magnetica alla soluzione anticorpale. Utilizzare un pHmetro con un microelettrodo per misurare il pH e regolare il pH aggiungendo prima 10 microlitri di acido cloridrico monomolare e quindi riducendo il volume quando il pH si avvicina a 2,5.
Registrare il volume totale di acido cloridrico monomolare necessario per regolare il pH a 2,5. Rimuovere il microelettrodo e incubare l'anticorpo acidificato sul ghiaccio, su un agitatore magnetico per un'ora. Per neutralizzare la soluzione anticorpale, misurare il pH e regolarlo a sette aggiungendo prima 10 microlitri di idrossido di sodio monopolare e quindi riducendo il volume di idrossido di sodio quando il pH si avvicina a sette.
Registrare il volume totale di idrossido di sodio monomolare aggiunto. Mescolare accuratamente la sospensione magnetica a sfere su un miscelatore a vortice e prelevare un volume contenente la quantità desiderata di sospensione del tallone. Ad esempio, per preparare un millilitro di sospensione di perline, ritirare un volume contenente 20 milligrammi di perline.
Posizionare la sospensione del tallone su un rack magnetico per un minuto e rimuovere il surnatante. Lavare le perle due volte con un volume uguale di acqua di tipo I e mescolare usando un miscelatore a vortice dopo ogni aggiunta della soluzione di lavaggio. Quindi, posizionare nuovamente la soluzione su un rack magnetico per un minuto e rimuovere il surnatante come mostrato in precedenza.
Aggiungere l'anticorpo trattato con acido, il tampone borato da 0,5 molari e il tampone di accoppiamento per l'accoppiamento degli anticorpi alle sfere magnetiche. Miscelare utilizzando un miscelatore a vortice e ruotare a temperatura ambiente durante la notte utilizzando un miscelatore di campioni end-over-end, preferibilmente con rotazione e vibrazione reciproche. Quindi, centrifugare per 10 minuti a 239 g.
Posizionare il tubo sul magnete per due minuti e rimuovere il surnatante. Dopo aver lavato le perline, posizionare nuovamente il tubo sul magnete per un minuto e seguire la stessa procedura per rimuovere il surnatante. Conservarlo nel tampone desiderato utilizzando la concentrazione desiderata di sfere in frigorifero.
Lasciare raccogliere 10 microlitri di siero in un microcampionamento volumetrico ad assorbimento volumetrico da 10 microlitri, o VAMS, utilizzando le linee guida del produttore, e asciugare all'aria a temperatura ambiente per almeno due ore. Rimuovere il VAMS dal supporto e metterlo in una provetta da microcentrifuga a basso contenuto proteico da due millilitri. Aggiungere 1.000 microlitri di soluzione di bicarbonato di ammonio da 100 millimolari ed estrarre VAMS per un'ora a 22 gradi Celsius utilizzando un miscelatore a temperatura controllata a 1.000 giri / min.
Trasferire l'estratto in una nuova provetta da microcentrifuga a basso legame proteico da 1,5 millilitri per la proteolisi triptica. Aggiungere 30 microlitri di perle di tripsina lavate a ciascun estratto VAMS per avviare la digestione e incubare per due ore a 37 gradi Celsius e 1.000 giri / min utilizzando un miscelatore a temperatura controllata o simile. Centrifugare a 2.655 g per cinque minuti e trasferire il surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga a basso legame proteico da due millilitri.
Aggiungere 25 microlitri di 14 nanogrammi per millilitro di soluzione standard interna, o IS, contenente il peptide marcato con isotopi stabili in una soluzione di bicarbonato di ammonio da 100 millimolari. Aggiungere due 20 microlitri di sospensione di perline magnetiche lavate a ciascuna provetta di microcentrifuga a basso legame proteico contenente un estratto VAMS digerito e IS. Eseguire l'immunoestrazione per un'ora utilizzando un miscelatore di campioni end-over-end a temperatura ambiente. Lavare le sfere magnetiche aggiungendo 500 microlitri di PBS con polisorbato 0,05% 20.
Rimuovere la provetta di microcentrifuga a basso legame proteico contenente perline e soluzione di lavaggio dal rack magnetico e capovolgere con cautela fino a ottenere un'omogeneità. Quindi, posizionare il tubo di microcentrifuga a basso legame proteico sul magnete per 30 secondi, capovolgerlo per 30 secondi e posizionarlo nuovamente sul magnete per un minuto. Rimuovere la soluzione di lavaggio e rilavare le sfere magnetiche con PBS, acido cloridrico tris e bicarbonato di ammonio.
Aggiungere 15 microlitri di acido formico al 2% in acqua di tipo I a ciascun campione e incubare per cinque minuti a 22 gradi Celsius e 1.000 giri / min utilizzando un miscelatore a temperatura controllata o simile per eluire i peptidi catturati. Dopo aver posizionato l'eluato sul magnete per un minuto, trasferirlo in una nuova provetta da microcentrifuga a basso legame proteico da 1,5 millilitri. Ripetere una volta e trasferire il secondo eluato nello stesso tubo di microcentrifuga a basso legame proteico del primo eluato.
Aggiungere 20 microlitri di bicarbonato di ammonio 100 millimolari a ciascun eluato. Centrifugarlo e trasferire 40 microlitri di eluato in microinserti per flaconcini HPLC. Nel software dello strumento, impostare la temperatura del forno a colonna su 25 gradi Celsius e la portata su 50 microlitri al minuto.
Quindi, posizionare i campioni nell'autocampionatore. Preparare una sequenza contenente i campioni da eseguire utilizzando il software disponibile per il sistema LC-MS/MS e impostare il volume di iniezione a 10 microlitri. Premere Run Sequence nel software dello strumento per avviare la sequenza e registrare l'area di picco del peptide triptico catturato per affinità, specifico per ProGRP e il suo IS. Qui sono mostrati i cromatogrammi di spettrometria di massa, o MS, del peptide proteotipico e dell'IS dopo VAMS e punto di siero essiccato, o DSS, nonché per un campione di siero a spillo aggiunto direttamente nella soluzione di estrazione.
I risultati rappresentativi del rapporto dell'area di picco del peptide proteotipico ProGRP con IS per campioni di siero con ProGRP e applicati a VAMS, DSS o direttamente alla soluzione di estrazione sono mostrati in questa figura. Da questi risultati, si può vedere che VAMS fornisce rapporti di area simili a quelli del campione di controllo, indicando nessuna perdita per il materiale di campionamento, mentre DSS fornisce un rapporto di area significativamente inferiore, indicando la perdita per il materiale di campionamento. In questa figura viene presentato un confronto tra i cromatogrammi di picco di base dopo l'estrazione di proteine intatte e l'estrazione del peptide dell'epitopo proteotipico.
Quando prepari tu stesso le perle con anticorpi o enzimi, puoi personalizzare le perle per coprire le tue esigenze specifiche. Ciò è rilevante per la determinazione mirata delle proteine e l'analisi proteomica globale. I metodi sensibili nella determinazione delle proteine da VAMS e macchie di sangue essiccato rendono possibili approcci orientati al paziente come i test extraospedalieri nel follow-up di una gamma più ampia di malattie.
