Il nostro protocollo consente ai ricercatori di costruire motivi citoscheletrici da componenti purificati e misurare direttamente le forze generate da queste reti per capire come funzionano questi componenti meccanici della cellula sia in stati sani che patologici. Questo metodo ci consente di quantificare le forze e correlare direttamente questi numeri per mantenere i parametri delle proteine coinvolte, compresa la concentrazione e la densità delle proteine. Parametri che sono generalmente impossibili da acquisire all'interno della cella.
Questo metodo può fornire informazioni su qualsiasi tipo di rete di citoscheletro, come quelli coinvolti nella mitosi o nello sviluppo neurale. Può essere facilmente adattato per studiare le reti coinvolte nella contrazione muscolare o nella migrazione cellulare semplicemente sostituendo queste specifiche proteine utilizzate. L'aspetto più difficile di questo metodo è il coordinamento delle diverse tecnologie, che includono una trappola ottica a raggio singolo e un microscopio TIRF.
Inoltre, gli esperimenti a singola molecola richiedono un'attenta preparazione delle superfici, come il vetrino di copertura, quindi la preparazione di campioni di alta qualità è fondamentale. Inizia con la costruzione di una camera di umidità posizionando un tessuto piegato e privo di lanugine inumidito con acqua ultrapura sul fondo di una scatola di punta vuota per pipette. Introdurre tutti i reagenti pipettando il liquido a un'estremità del canale e espellendo il liquido all'estremità opposta.
Utilizzando una punta per pipetta angolata da 20 microlitri, scorrere lentamente in 10 microlitri di 0,5 milligrammi per millilitro di streptavidina o NeutrAvidin. Incubare il vetrino nella camera di umidità per 4 minuti con il vetrino di copertura rivolto verso il basso. Lavare la camera utilizzando 20 microlitri di un 1x BRB80 utilizzando un fazzoletto privo di lanugine per estrarre i liquidi.
Dopo aver ripetuto i reagenti fluenti e l'incubazione ancora una volta, lavare con 10 microlitri di 0,5 milligrammi per millilitro di soluzione bloccante della caseina. Far scorrere 10 microlitri di microtubuli biotinilati diluiti di colore rosso lontano nella camera, quindi lavare la camera con 20 microlitri di 1x BRB80. Dopo aver fatto scorrere il reagente e incubato come dimostrato in precedenza, lavare il passaggio con 10 microlitri di una concentrazione appropriata di proteina non motoria da studiare, quindi far fluire in 10 microlitri di microtubuli di rodamina e ripetere l'incubazione e il lavaggio.
Quindi, combinare 1 microlitro di perline rivestite di chinesina rigoroso e 19 microlitri di tampone di reazione. Sigillare entrambi i bordi della camera con smalto trasparente e attendere che lo smalto si asciughi. Utilizzare uno strumento microscopio invertito che abbia capacità di imaging a fluorescenza a riflessione interna totale e in cui è stata costruita una trappola ottica a raggio singolo.
Aggiungere 1 goccia di olio ad immersione sul vetrino di copertura della camera del campione. Con il lato di copertura della camera del campione rivolto verso il basso, posizionare il campione da visualizzare sulla piattaforma del microscopio. Portare lentamente l'obiettivo verso l'alto in modo che ci sia un contatto tra il vetrino di copertura e l'obiettivo attraverso l'olio.
Regolare l'altezza dell'obiettivo in modo che la superficie di slittamento del coperchio della camera del campione sia a fuoco. Registra immagini a fotogramma singolo dei campioni in tutti e tre i canali. Per gli esperimenti qui, utilizzare da 100 a 200 millisecondi di esposizione.
Regolare la potenza del laser per ottenere un buon rapporto segnale-rumore dai campioni, riducendo al minimo lo sbiancamento fotografico nell'arco di 2-5 minuti quando viene analizzato il singolo fascio. La frequenza dei fasci di microtubuli per campo visivo dovrebbe essere di circa tre o quattro fasci di microtubuli per 100 microlitri per 100 microlitri di campo visivo per camera. Osservare la densità delle perle nel campione utilizzando un campo luminoso e l'obiettivo 100x sul microscopio.
Impiegare una concentrazione di perle tale che le perle siano in media a un minimo di 10 micrometri l'una dall'altra e assicurarsi che siano prive di qualsiasi tipo di confinamento superficiale o raggruppamento. Assicurarsi che i microtubuli biotinilati rosso lontano siano saldamente attaccati alla superficie del vetrino di copertura e che la rodamina non abbia un movimento browniano visibile. Assicurarsi che i microtubuli di rodamina siano attaccati ai microtubuli biotinilati tramite la mappa di reticolazione e siano visibilmente fluttuanti alle loro estremità libere.
Identificare un fascio di microtubuli adatto che contenga solo due microtubuli, uno biotinilato con attacco a superficie completa e un microtubulo non biotinilato che sia parzialmente libero in soluzione e allineato sull'asse x o y. Usa la trappola ottica per catturare una perla libera che dimostra il moto browniano. Una volta che il tallone è stato intrappolato, spostare con attenzione il tallone sul fascio di microtubuli selezionato assicurandosi che nessun'altra perlina venga tirata nella trappola nel processo.
Assicurarsi che il cordone si trovi a diversi micron di distanza dalla regione di sovrapposizione contenente proteine reticolanti. Abbassare con attenzione il tallone sull'asse z fino a quando non entra in contatto con il bordo del segmento libero del microtubulo di rodamina. Tirare delicatamente verso l'alto e spostarsi perpendicolarmente all'asse dei microtubuli per verificare la presenza di attaccamenti osservando la flessione del microtubulo di rodamina e seguendo la posizione del tallone.
Riallineare con attenzione il microtubulo di rodamina lungo l'asse dei microtubuli del microtubulo attaccato alla superficie spostando lo stadio di nano-posizionamento e impostare i parametri per la trazione automatica del fascio di microtubuli. Impostare la direzione lungo l'asse parallelo dei microtubuli. Impostare la velocità di trazione desiderata e il tempo di trazione desiderato in base alla lunghezza di sovrapposizione.
Iniziate a registrare i dati di fluorescenza nei tre canali a una velocità da 1 a 2 fotogrammi al secondo. Utilizzare le potenze laser ottimizzate e i tempi di esposizione. Avvia il movimento automatico dello stadio e registra i dati di cattura dallo stadio del rilevatore sensibile alla posizione e dallo stadio della telecamera a fluorescenza a riflessione interna totale.
Disattiva le trappole per rilasciare la perlina e ripeti l'esperimento come desiderato. Gli insiemi della proteina motoria mitotica essenziale kinesin-5 possono regolare lo scorrimento dei microtubuli generando forze di spinta e frenata che scalano linearmente con la lunghezza di sovrapposizione. Si è constatato che il dominio di coda C-terminale è necessario per un'efficiente reticolazione e generazione di forza.
La proteina a lunghezza intera è in grado di generare forze sostenute che si stabilizzano quando tutte le proteine motorie raggiungono la loro forza di stallo individuale. Tuttavia, il motore kinesin-5 privo della sua coda C-terminale genera forze massime che sono quasi cinque volte più piccole in termini di grandezza. Gli insiemi della proteina mitotica non motoria PRC1 funzionano come un cruscotto meccanico per resistere allo scorrimento dei microtubuli nella zona centrale del mandrino anafase.
Le forze resistive non dipendono dalla lunghezza delle regioni di sovrapposizione tra coppie di microtubuli o dalla densità locale dei reticolanti, ma dipendono fortemente dalla concentrazione totale delle molecole PRC1 impegnate. Questo metodo può essere adattato per studiare diversi sistemi biologici come l'organizzazione microbica e i neuroni utilizzando proteine alternative. Può anche essere facilmente ampliato per analizzare le geometrie di rete basate sull'actina per studiare la contrazione muscolare o la motilità cellulare.
Questa tecnica consente di studiare geometrie totali cellulari uniche, dove i filamenti sono sia traccia che carico e sono organizzati da piccoli insiemi di proteine. Queste geometrie imitano meglio ciò che sta accadendo nelle cellule durante numerosi processi biologici.
