Questo protocollo può essere utilizzato per caratterizzare la dinamica della miosina non muscolare a livello proteico, che può informare le proprietà mobili che contribuiscono al loro ruolo nelle cellule. Questo è un metodo veloce, riproducibile e altamente controllato che può essere utilizzato per studiare gli effetti di varie condizioni regolatorie sulla motilità della miosina, informando i loro comportamenti cellulari. Queste tecniche possono essere utilizzate per studiare come le mutazioni che causano malattie nelle miosine non muscolari influenzano i loro comportamenti a livello di singola molecola e ensemble.
L'approccio generale della sua metodologia può essere applicato a vari altri sistemi citoscheletrici, come la caratterizzazione di chinetine e dineine purificate con microtubuli. La versatilità di questo protocollo può sollevare domande su quali fluorofori e condizioni chimiche siano più appropriati, ma il metodo può essere ottimizzato in tempi relativamente brevi. Capire come impostare e rivestire le camere di flusso crea una solida base su cui ci si può adattare alle varie condizioni per questi esperimenti.
Per iniziare, preparare una soluzione di nitrocellulosa all'uno per cento in acetato di amile e posizionare una carta da filtro circolare con un diametro di 125 millimetri sul fondo di una piastra di coltura tissutale. Caricare otto coperchi quadrati scivola su un rack e lavarli accuratamente con circa due o cinque millilitri di etanolo a prova di 200 seguito da due a cinque millilitri di acqua distillata. Quindi guidare completamente il coperchio scivola utilizzando una linea di aria filtrata o una linea di azoto.
Pipettare lentamente 10 microlitri di soluzione di nitrocellulosa all'uno per cento lungo un bordo di uno slittamento di copertura. Spalmarlo sul resto dello slip di copertura usando il lato di una punta della pipetta da 200 microlitter con un movimento regolare. Quindi posizionare questo coperchio scivolare sul piatto di coltura del tessuto con il lato nitrocellulosa in alto.
Ripetere l'operazione per le restanti scivolate di copertura e lasciarle asciugare. Pulire un vetrino per microscopio con una carta ottica per lenti per pulire i detriti di grandi dimensioni. Tagliare due pezzi di nastro biadesivo, lunghi circa due centimetri, e posizionare un pezzo lungo il centro del bordo lungo del vetrino del microscopio.
Posizionare il secondo pezzo di nastro a circa due millimetri sotto il primo pezzo di nastro in modo tale che i due siano paralleli creando una camera di flusso che può contenere circa 10 microlitri di soluzione. Attaccare con attenzione uno dei coperchi di nitrocellulosa scivola sul nastro in modo che il lato rivestito di nitrocellulosa stia facendo contatto diretto con il nastro. Utilizzando una punta della pipetta, premere delicatamente verso il basso sull'interfaccia del nastro scorrevole per assicurarsi che lo slittamento del coperchio sia correttamente aderente alla diapositiva.
Quindi tagliare il nastro in eccesso appeso sul bordo della diapositiva con una lama di rasoio. Preparare le soluzioni per Myosin 5a e tenerle sul ghiaccio. Fluire in 10 microlitri della Myosin 5a attraverso la camera di flusso di scorrimento e attendere un minuto.
Quindi flusso in 10 microlitri di un milligrammo per millilitro BSA in tampone di motilità con DTT. Ripeti due volte e attendi un minuto dopo il terzo lavaggio. Utilizzare l'angolo di una carta velina o di carta da filtro per far traspirare la soluzione attraverso il canale posizionando delicatamente l'angolo della carta all'uscita della camera di flusso.
Quindi lavare con 10 microlitri di tampone di motilità con DTT. Pipettare la soluzione di actina nera con una siringa da un millilitro e un ago calibro 27 per tagliare i filamenti di actina prima di introdurre tale soluzione nella camera. Aggiungere l'actina nera alla camera in presenza di un ATP millimolare in MB 50 millimolari con un DTT millimolare.
Successivamente, flusso in 50 microlitri di tampone di motilità con DTT e un ATP millimolare per esaurire la camera di filamenti di actina liberi. Lavare con 10 microlitri di tampone di motilità con DTT tre volte per esaurire la camera di qualsiasi ATP. Fluire in 10 microlitri di soluzione di actina RH nanomolare contenente tampone di motilità con DTT e attendere un minuto per consentire il legame rigoroso dei filamenti di actina alla Myosin 5a attaccata alla superficie dello slittamento del coperchio.
Lavare con 10 microlitri di tampone di motilità da 50 millimolari con DTT due volte per rimuovere i filamenti di actina RH non legati. Flusso in 30 microlitri di tampone finale. Registra le immagini su un microscopio a fluorescenza utilizzando una lunghezza d'onda di eccitazione di 561 nanometri per visualizzare l'actina RH.
Preparare le soluzioni per il test di motilità invertita Myosin 5a e tenerle sul ghiaccio. Lavali in camera con 10 microlitri di tampone di motilità con DTT. Flusso in 10 microlitri di un milligrammo per millilitro BSA in tampone di motilità con DTT.
Ripeti questo due volte, aspettando un minuto dopo il terzo lavaggio. Utilizzare carta velina o carta da filtro per far traspirare la soluzione attraverso il canale posizionando delicatamente l'angolo della carta all'uscita della camera di flusso. Quindi, lavare la camera con 10 microlitri di tampone di motilità con DTT tre volte.
Flusso in 10 microlitri della soluzione di NeutrAvidin in tampone di motilità con DTT e attendere un minuto. Quindi lavare con 10 microlitri di quella soluzione tre volte. Flusso in 10 microlitri di actina BRH contenenti tampone di motilità con DTT utilizzando una punta di pipetta di grande diametro.
E aspetta un minuto. Quindi, lavare con 10 microlitri di tampone di motilità con DTT tre volte. Flusso in 30 microlitri di tampone finale con 10 miosina nanomolare 5a.
E caricare immediatamente sul microscopio a fluorescenza a riflessione interna totale. Inizia a registrare una volta trovata la messa a fuoco ottimale per l'imaging TIRF. La purificazione della miosina 2b non muscolare, delle catene leggere essenziali e delle catene leggere regolatorie, nonché della miosina 5a e della calmodulina è stata valutata eseguendo SDS-PAGE.
Il test del filamento di actina planante mostra le caratteristiche di un film ideale e tracciabile con movimenti fluidi di filamenti di actina etichettati. Il lavaggio dell'actina nera ha assicurato che le teste di miosina morte fossero rimosse dal campo di misurazione contribuendo ulteriormente al movimento regolare complessivo dei filamenti di actina. Le immagini di output del tracciamento dei filamenti dal programma fast track sono state ottenute per Myosin 2b e Myosin 5a non muscolari.
Un istogramma rappresentativo mostra che la velocità di scorrimento di Actomyosin 2b è di 77 nanometri al secondo. E quello di Actomyosin 5a è di 515 nanometri al secondo. In assenza di metilcellulosa, i filamenti di actina non rimangono così strettamente associati dalla superficie rivestita di miosina, causando il suo flopping vicino alla superficie delle scivolate di copertura rivestite di miosina 2b non muscolari.
Il movimento della miosina è stato osservato su filamenti di actina fluorescente legati alla superficie utilizzando il test di motilità invertita. È importante tagliare l'actina non etichettata prima di introdurla nella cella di flusso per il lavaggio dell'actina nera che consentirà la traslocazione regolare dell'actina. Ulteriori esperimenti possono studiare come la motilità della miosina è influenzata da mutazioni della miosina, proteine che inducono carico, forza ionica e proteine regolatrici.
Varie condizioni cellulari possono essere ricostituite per studi futuri. Questi metodi consentono le indagini biochimiche e biofisiche su come le varie isoforme di miosina variano nelle loro proprietà mobili e meccaniche a livello di singola molecola e insieme.
