Questo protocollo offre un metodo relativamente rapido ed economico, nonché un'acquisizione e un'analisi automatizzate, producendo così uno screening a bassa sensibilità della 5-metilcitosina, che è un biomarcatore epigenetico comune. Il vantaggio principale di questa tecnica è la flessibilità che offre un design sperimentale che gli utenti possono ottimizzare per il loro modello e fase di sviluppo. Questa tecnica può essere utilizzata per rilevare come l'esposizione chimica altera l'abbondanza relativa di 5-metilcitosina all'interno di un organismo in via di sviluppo che normalmente potrebbe essere fatto solo attraverso costosi metodi ad alto trpA come il sequenziamento.
Questo metodo è utile per qualsiasi ricerca che mira ad utilizzare metodi NCG per comprendere le alterazioni epigenetiche della 5-metilcitosina in risposta a stimoli ambientali. Inizia preparando una nuova soluzione di esposizione la mattina della raccolta. Aggiungere cinque millilitri di acqua di sistema priva di particelle a una capsula di Petri di vetro da 60 millimetri.
Quindi utilizzare una pipetta di vetro micro capillare da 10 micro litri per trasferire 10 microlitri di dimetilsolfossido o soluzione madre chimica all'acqua del sistema. Ruotare la capsula di Petri di vetro per assicurarsi che la soluzione madre si dissolva. Aggiungere altri cinque millilitri di acqua di sistema alla capsula di Petri di vetro e ruotare il piatto per omogeneizzare la soluzione di esposizione.
Tappare i piatti di vetro con coperchi di vetro per ridurre al minimo l'evaporazione. Quindi, utilizzare una bottiglia di spruzzo riempita d'acqua RO per trasferire gli embrioni dalla rete da pesce in un piatto da 100 millimetri. Ordinare in modo casuale 50 embrioni vivi a 0,75 ore dopo la fecondazione e rimuovere l'acqua RO in eccesso.
Al termine della durata dell'esposizione, rimuovere gli embrioni dall'incubatrice. Trasferire tutti gli embrioni viventi in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Aspirare la soluzione di esposizione residua senza aspirare embrioni.
Aggiungere 500 microlitri di paraformaldeide refrigerata al 4% e mescolare gli embrioni per inversione più volte. Lasciare che gli embrioni si fissino e il 4% di paraformaldeide durante la notte a quattro gradi Celsius. Dopo aver fissato gli embrioni, aspirare il 4% di paraformaldeide, rispendere gli embrioni in 1X PBS e mescolare con un pipettaggio delicato per 30 secondi.
Utilizzando una pipetta di vetro, trasferire con cura gli embrioni fissi in un piatto di vetro riempito d'acqua RO. Agitare delicatamente per 30 secondi e ripetere il lavaggio una volta. Sotto uno stereomicroscopio impostato a cinque volte l'ingrandimento decorenare gli embrioni usando aghi da siringa.
Usando la punta dell'ago, forare il corion e staccarlo delicatamente dal tuorlo e dalla massa cellulare. Dopo che gli embrioni sono stati decorati, utilizzare una pipetta micro capillare di vetro per trasferire fino a 25 embrioni intatti in un cesto di immunoistochimica. Posizionare il cestello IHC in una piastra da 24 pozzetti.
Quindi aspirare l'acqua da ciascun pozzo. Risospendere gli embrioni in 500 microlitri di tampone bloccante per pozzetto, avvolgere la piastra con paraform e foglio di alluminio per proteggerla dalla luce. Incubare la piastra a quattro gradi Celsius per quattro ore su uno shaker orbitale a 100 giri / min.
Dopo l'incubazione, aspirare il tampone bloccante da ciascun pozzetto. Sostituirlo con 500 microlitri di soluzione anticorpale primaria. Ricordarsi di incubare un sottoinsieme di embrioni di controllo del veicolo con il buffer di blocco per tenere conto del rumore di fondo.
Riavvolgere la piastra e la paraforma e il foglio di alluminio e lasciare che la piastra incubi a quattro gradi Celsius durante la notte su uno shaker orbitale. Il giorno seguente rimuovere la soluzione anticorpale primaria da ciascun pozzetto e sostituirla con 1x PBST. Lavare ogni pozzetto tre volte con 1x PBST per cinque minuti per lavaggio su uno shaker orbitale.
Aspirare 1x PBST da ciascun pozzetto e posizionare il cestello IHC in una capsula di Petri di vetro riempita con acqua RO. Sotto un microscopio stereoscopico standard ordina casualmente gli embrioni intatti in una piastra da 96 pozzetti assicurando un embrione per pozzetto. Quindi rimuovere tutta l'acqua RO dai singoli pozzetti e aggiungere 200 microlitri di 1x PBS.
Centrifugare la piastra per tre minuti in un G.Immagine gli embrioni con un obiettivo due volte sotto luce trasmessa e FITC. Selezionare la messa a fuoco automatica per assicurarsi che la messa a fuoco della fotocamera sia sul fondo della lastra e sfalsata dallo spessore inferiore. Selezionare una lunghezza d'onda FITC con una durata di esposizione di 100 millisecondi e impostare la messa a fuoco automatica su laser con offset Z.
Osservare e confermare la corretta acquisizione dell'immagine e diversi pozzetti prima di iniziare l'acquisizione della piastra. Dopo l'acquisizione delle immagini, eseguire l'analisi dei dati utilizzando il sistema di screening ad alto contenuto e una procedura di analisi delle immagini automatizzata personalizzata. Selezionare ogni embrione sulla piastra a 96 pozzetti da analizzare per l'area totale e l'intensità integrata della fluorescenza.
Quindi tabulare i punti dati ed esportarli dal sistema di screening ad alto contenuto andando su misura e selezionando open data log per esportare i dati in un foglio di calcolo. Caricare il foglio di calcolo esportato nel pacchetto deployer per ordinare e sommare i dati per ciascun pozzo e filtrare in base al numero di pozzi. Quindi utilizzare il pacchetto Excel corretto per esportare i dati riepilogati in un foglio di calcolo.
La distribuzione e l'intensità integrata dell'area totale specifica della 5-metilcitosina sono state valutate per gli embrioni di zebrafish a sei ore dopo la fecondazione. L'asse x mostra l'esposizione al DMSO come veicolo o al TDCIPP come controllo positivo. L'asse Y indica la fluorescenza relativa.
Le soglie erano significativamente diverse dagli embrioni trattati con veicolo, come dimostrato dall'area totale di 5-metilcitosina rilevata all'interno degli embrioni e dall'intensità integrata all'interno della stessa area che indica il massimo rapporto segnale/rumore. È estremamente importante mantenere l'integrità del giogo e della massa cellulare per un corretto rilevamento IHC. Questo metodo è relativamente insensibile e offre solo dati RFU di abbondanza relativa.
Se è necessaria una quantificazione, si può seguire con un approccio più mirato.
