We thank Kristen Kwan for the pCS2-H2A.F/Z-EGFP and pCS2-mCherry-CAAX vectors. We thank Chris Rodesch for tutoring us in live imaging in zebrafish. We thank Shawn Williams, Erik Malarkey and Brad Yoder for assistance in confocal imaging at UAB and the High Resolution Imaging Facility at UAB. The High Resolution Imaging Facility is supported by the UAB Comprehensive Cancer Center Support Grant (P30CA013148) and the Rheumatic Disease Core Center (P30 AR048311). J.M.P. is supported by the National Institute of Neurological Disease and Stroke (NIH R21 NS092105), and pilot grants from American Cancer Society (ACS IRG-60-001-53-IRG) and the UAB Comprehensive Cancer Center (P30CA013148). S.M.P. is supported by the Cell and Molecular Biology T32 Training Grant (5T32GM008111-28).

1. in vitro Trascrizione <ol><li> Linearizzare pCS2-H2A.F / Z-EGFP e / o vettori pCS2-mCherry-CAAX per restrizione NotI enzima digerire 31. L&#39;utilizzo di un RNA nel kit di trascrizione in vitro, generare 5 &#39;prodotti mRNA ricoperti da ogni modello, secondo il protocollo del produttore. </li><li> Purificare i mRNA innevate con un kit di purificazione. Seguire le istruzioni del produttore. Eluire con RNasi-free H 2 O. </li><li> Determinare la concentrazione di RNA mediante assorbanza a 260 nm utilizzando uno spettrofotometro. (OD 260 x diluizione x 40 mcg / ml). </li><li> Diluire l&#39;RNA a 100 ng / mL per ogni H H2A.F / Z-EGFP e mCherry-CAAX con RNase-free 2 O. Se la concentrazione di RNA è troppo bassa, la fluorescenza sarà diminuita o assente. campioni Brighter diminuirà le preoccupazioni sulla fototossicità e photobleaching. D&#39;altra parte, troppo RNA può essere tossico e / o causare effetti off bersaglio. Nota: Conservare il rimanentemRNA purificato in -80 ° C freezer. </li></ol> 2. Allevamento Zebrafish, Embrione Collection, e mRNA iniezione 36-38 <ol><li> Assemblare vasche di allevamento con una barriera per separare il serbatoio in due regioni e riempire ciascun serbatoio di allevamento con l&#39;acqua sistema di acquacoltura utilizzato nella struttura zebrafish. </li><li> Per evitare l&#39;allevamento prematura, posizionare due pesci maschio su un lato della barriera e due pesci femmina dall&#39;altro lato la notte prima di allevamento. </li><li> Il giorno successivo, scongelare la miscela mRNA precedentemente preparato sul ghiaccio. Sostituire l&#39;acqua in vasche di allevamento con acqua sistema di acquacoltura fresca e rimuovere le barriere. Subito dopo le barriere sono tirati, riscaldare uno stampo ad iniezione di 28,5 ° C e impostare l&#39;apparecchiatura per la microiniezione. Nota: Per informazioni su stampi ad iniezione, si rimanda al Gerlach 36. </li><li> Raccogliere uova ogni 10 - 15 minuti utilizzando un colino da tè e sciacquare le uova in un ambiente pulito 100 x 15 mm piastra di Petri con E3 Blu (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mm CaCl 2, 0,33 mm MgSO 4, 10 -5% blu di metilene). E3 blu è usato per prevenire la crescita di funghi e garantire il corretto sviluppo delle larve. Per maggiori informazioni su l&#39;accoppiamento e la raccolta degli embrioni, fare riferimento a Gerlach 36 e 37 Porazinkski. </li><li> Incorporare una cella scena embrioni in uno stampo ad iniezione riscaldato ed iniettare l&#39;RNA nel tuorlo nella quantità desiderata di embrioni (Figura 1A). Conto per naturale morte embrionale ed embrioni non fecondate eseguendo iniezioni embrionali, il 15% in più rispetto embrioni necessario per l&#39;esperimento. Per ulteriori dettagli su microiniezione di embrioni di zebrafish, si prega di fare riferimento a Gerlach 36 e 37 Porazinkski. NOTA: Per il primo utilizzo di mRNA, eseguire un&#39;analisi dose di curva per determinare la dose ottimale per la fluorescenza e la vitalità (definita come assenza di difetti di sviluppo lordi fino a 5 dpf) prima di eseguire l&#39;imaging 5D. 150 - 200 ng / mliniettate in embrioni è spesso la concentrazione ottimale, quindi è un buon punto di partenza per la concentrazione finale. </li><li> estrarre delicatamente gli embrioni iniettati dallo stampo utilizzando una versione modificata del &quot;vetro pipetta Pasteur 9. Per modificare la pipetta, sciogliere il finale utilizzando un becco Bunsen fino a formare una palla. </li><li> Mettere embrioni iniettati in un 100 x 15 mm piastra di Petri in E3 blu e la casa in un incubatore a 28.5 °. </li><li> Sei ore dopo l&#39;iniezione, rimuovere eventuali embrione è morto o non fecondate dai piatti e aggiungere pulita E3 blu. Casa gli embrioni a 28,5 ° C. </li></ol> 3. Preparazione e Embedding a Live embrioni di zebrafish per Imaging (Figura 1B) <ol><li> Due ore prima di imaging, lo screening degli embrioni iniettati per GFP utilizzando un microscopio da dissezione a fluorescenza. Luogo luminoso embrioni che esprimono GFP-verdi in una nuova mm piatto 100 x 15 Petri con E3 blu. </li><li> Far bollire una soluzione stock di 1% a basso agarosio fusione con l&#39;aggiunta di 1 g di basso punto di fusione agarosio a 100 ml di E3 Blu. Dopo aver utilizzato il agarosio, coprire il pallone con un foglio di alluminio. La soluzione madre può essere utile per un massimo di un mese. </li><li> Aliquotare 3 ml di agar fuso in una provetta 17 x 100 mm. Mantenere la calda agarosio collocando la provetta in un bagno d&#39;acqua a 42 ° C fino al momento dell&#39;uso. Preparare una soluzione di 15 mm Tricaine in acqua deionizzata per anestetizzare gli embrioni di zebrafish 36. NOTA: Se l&#39;imaging in punti temporali precedenti è desiderato, la concentrazione di agar può essere diminuita a partire da 0,3% 39. </li><li> Portare il 15 MM Tricaine, gli embrioni a screening, bassa agarosio fusione, E3 Blu, e da 35 mm di vetro coprioggetto cultura fondo piatto per un microscopio ottico dissezione. Rimuovere con attenzione corion dell&#39;embrione con # 5 pinzette. Fare questo per tre embrioni. </li><li> Mettere gli embrioni dechorionated in un contenitore separato per essere anestetizzati. Il coperchio del piatto coprioggetto fondo viene spesso utilizzato per questo scopo. Usando una pipetta di trasferimento, aggiungere tre gocce (circa 150 ml)15 mM Tricaine al piatto 5 ml E3 blu (se utilizzando il coperchio del piatto inferiore coprioggetto) o fino embrioni sono stati sufficientemente anestetizzato. Inoltre, aggiungere 3-4 gocce (circa 150 - 200 microlitri) di 15 mM soluzione Tricaine al tubo agarosio fuso 1%. </li><li> Usando una pipetta P200 con 1 cm dalla punta della pipetta tagliare; trasferire gli embrioni anestetizzati al piatto coprioggetto fondo. Rimuovere qualsiasi eccesso E3 Blu: soluzione Tricaine. </li><li> Aggiungere lentamente 5 - 10 ml di agarosio a bassa fusione: soluzione Tricaine negli embrioni, mantenendo ogni goccia separato per garantire gli embrioni non accidentalmente deriva vicini l&#39;uno all&#39;altro. Attenzione: se l&#39;agarosio è troppo caldo, si danneggia l&#39;embrione. Una buona temperatura per mantenere l&#39;agar a è 42 ° C. </li><li> Utilizzando un 21 ago G 1 ½, orientare delicatamente l&#39;embrione nel agarosio nella posizione desiderata. Quando si utilizza un microscopio invertito per l&#39;imaging time-lapse, orientare la regione di interesse (ROI) più vicino possibile al vetrino come possibLe. Nota: Per scopi generali, la regione coda offre la facilità di orientamento e chiarezza a causa della relativamente sottile di tessuto (Figura 1A). Altri tessuti, come lo strato epiteliale che circonda le pieghe tuorlo e pinne, possono essere usati 28,29. Questi tessuti offrono grande chiarezza, tuttavia queste regioni sono spessi solo pochi strati di cellule. Ai fini di questo protocollo, è vantaggioso per un&#39;immagine regione coda di acquisire quante divisioni cellulari possibili. </li><li> Attendere qualche minuto per la solidificazione parziale del agar. Utilizzare l&#39;ago di spezzare un piccolo pezzo di agar per testare la sua solidificazione. Quando un pezzo di agar può essere tirato dalla goccia, procedere al passo successivo. </li><li> Coprire l&#39;intero vetrino con una bassa agar fusione formando una cupola sopra gli embrioni incorporati. Lasciare che l&#39;agar solidificare prima di spostare il piatto per l&#39;imaging confocale (Figura 1A). </li><li> Durante il processo di solidificazione agar (dura circa 10 minuti), preparare da 3 ml osoluzione f E3 blu con cinque gocce di (circa 250 ml) 15 mm Tricaine per essere posizionato sopra gli embrioni incorporati durante l&#39;imaging. </li></ol> 4. 5D confocale Imaging Live embrioni di zebrafish 40,41 NOTA: Vedere Ariga 40 e O&#39;Brien 41 per i dettagli su come eseguire l&#39;imaging 5D utilizzando altri sistemi confocale. Per Z-intervallo, Z-stack, Z-profondità, intervallo di tempo, e definizioni 5D si veda la Figura 1C. <ol><li> Aprire il software di imaging e impostare il microscopio a 60X NA 1.4 lente dell&#39;obiettivo. Applicare l&#39;olio di immersione alla lente dell&#39;obiettivo e posizionare il piatto cultura nel supporto diapositive sul palco microscopio. Utilizzando il controllore assi, centrare l&#39;embrione di interesse al di sopra della lente dell&#39;obiettivo e portare la lente obiettivo verso l&#39;alto per incontrare il piatto cultura. </li><li> Fare clic sull&#39;icona oculare e passare al filtro GFP sul microscopio. Focus sul ROI. Concentrandosi sul tessuto più vicino al vetrino sarà offer i migliori risultati di imaging. </li><li> Rimuovere il blocco. Selezionare i canali GFP e mCherry (lunghezze d&#39;onda pre-impostati nel software) e impostare la linea opzione normale media. </li><li> Utilizzare &quot;Controlli View / acquisizione / A1 Area di scansione&quot; comando per aprire lo strumento A1 Area di scansione. </li><li> Avviare la scansione. Utilizzando l&#39;asse-controllore, posizionare l&#39;embrione in modo che l&#39;area di scansione viene riempito con la maggior quantità di zebrafish possibile. La potenza del laser non deve essere ottimale a questo punto. Abbassare la potenza del laser al fine di evitare inutili photobleaching. </li><li> Utilizzare i &quot;Controlli View / acquisizione / acquisizione ND&quot; comando per aprire il pannello di controllo acquisizione ND. </li><li> Avviare la scansione per impostare i parametri di Z-stack. Impostare il limite superiore Z-stack per cui le cellule non sono a fuoco e limite inferiore per cui le cellule non sono più visibili. Lasciare uno spazio 3 micron sopra il campione per la crescita e il movimento delle cellule, che può espandersi nel campo di ripresa. La Z-stack per i dati riportati in questo proprotocollo copriva una Z-profondità di 40 micron di coda dell&#39;embrione. </li><li> Impostare la dimensione del passo Z-intervallo di 2 micron. In media, una cella è 10 micron di diametro; quindi 2 micron produrrà cinque intervalli di dati di imaging da analizzare per ogni cella. NOTA: La profondità dell&#39;immagine che può essere acquisito dipende dall&#39;intervallo Z. risoluzione Z è sacrificato per ottenere profondità totale nella dimensione Z al fine di immagine come molte cellule in fase di mitosi possibile (grande Z-profondità). L&#39;inverso è vero, nel senso che, diminuendo la dimensione del passo, la risoluzione Z si guadagna, mentre la profondità Z viene sacrificato (piccolo Z-profondità). </li><li> Regolare la potenza del laser immagine, HV, e offset livelli. Per gli esperimenti hanno dimostrato in questo protocollo, utilizzare il seguente potenza del laser, HV, e offset livelli fissati ai livelli corrispondenti, rispettivamente, per il canale GFP; 2-5, 120-140, e -9 a -11. Per il canale mCherry, utilizzare il seguente potenza del laser, HV, e offset livelli, rispettivamente; 3 - 6, 120 - 140, e -3 a-8. Una volta impostati i parametri, spegnere la scansione per evitare l&#39;esposizione al laser inutili che possono causare fototossicità e photobleaching del campione. </li><li> Selezionare l&#39;icona media linea di 2x. &quot;No media&quot; produce un&#39;immagine sgranata mentre &quot;linea 4x media&quot; aumenta drasticamente il tempo di scansione. L&#39;uso della linea di 2x media fornisce la migliore qualità di immagine e il tempo più veloce di scansione. </li><li> Selezionare l&#39;intervallo di tempo e durata, necessarie per l&#39;esperimento. Per le divisioni wild-type, intervalli di tempo di due minuti per 2 ore è meglio per la determinazione della durata mitotico (utilizzato nelle figure 1, 2, 3A e 3B). Divisioni che attivano il checkpoint del fuso per più di 30 minuti sono più adatti per cinque intervalli minuti per quattro ore al fine di preservare la fluorescenza come mostrato nella Figura 3C. </li><li> Selezionare la casella &quot;Salva su file&quot; e il nome del file per salvare automaticamente il file come si è in fase di acquisizione. Doppio controllo tutte le parametri siano impostate correttamente e ha colpito &quot;start run&quot;. </li><li> Dopo l&#39;acquisizione è stata completata, per visualizzare il file in un formato tridimensionale, cliccare sull&#39;icona soglia di volume. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

L&#39;uso di questo metodo permette di dedurre ripartizione nucleare envelope, formazione di una piastra di metafase da allegati microtubuli cinetocoro, e la segregazione dei cromatidi fratelli per formare due nuove cellule in vivo e in un modo dipendente dal tempo. La capacità di osservare mitosi in zebrafish è vantaggioso su campioni fissati e sistemi di coltura cellulare perché le cellule vengono ripreso nella fisiologia naturale, il tessuto è trasparente che permette proteine ​​fluorescenti da utili...

La mitosi è un essenziale processo cellulare fondamentale per la crescita, la differenziazione e la rigenerazione in un organismo vivente. Dopo accurata preparazione e la replicazione del DNA in interfase, la cella è innescato per dividere. La prima fase della mitosi, profase, viene avviata dall&#39;attivazione della ciclina B / Cdk1. Prophase è caratterizzata dalla condensazione del materiale cromatina in cromosomi. Nucleare ripartizione busta avviene al passaggio tra profase e prometafase. In prometafase, centrosomi, il centro di nucleazione per la formazione del fuso, cominciano a migrare verso poli opposti, estendendo microtubuli in cerca di attaccamento cinetocore. Al momento di attacco, le conversioni al fine di applicare il sistema dei microtubuli e forze di tensione orientano i cromosomi che formano una piastra di metafase 1. Se tutti i cromosomi sono collegati correttamente, il punto di controllo di assemblaggio del mandrino è soddisfatto, anelli cohesin tengono i cromatidi fratelli insieme sono spaccati, e microtubuli accorciare a tirare sorellacromatidi ai poli opposti durante anaphase 2,3. La fase finale, telofase, comporta l&#39;allungamento della cella e riforma della membrana nucleare attorno ai due nuovi nuclei. Citochinesi completa il processo di divisione separando citoplasma delle due nuove cellule figlie 4-6. L&#39;alterazione delle vie principali mitosi (cioè, posto di blocco di assemblaggio del mandrino, la duplicazione dei centrosomi, sorella cromatidi coesione, ecc.) Può provocare l&#39;arresto metafase, missegregation dei cromosomi, e instabilità genomica 7-10. In ultima analisi, difetti nei percorsi di controllo mitosi possono causare disturbi dello sviluppo e il cancro, che richiede la visualizzazione della mitosi e dei suoi difetti di un live, vertebrato, organismo pluricellulare 10-16. embrioni di zebrafish servire come un grande organismo modello per l&#39;imaging dal vivo grazie al tessuto trasparente, la facilità di microiniezione e rapido sviluppo. Utilizzando zebrafish, l&#39;obiettivo generale di questo manoscritto è quello didescrivere un metodo di 5D vivo (dimensioni X, Y, Z, tempo e lunghezza d&#39;onda) di imaging di mitosi 17 (Figura 1C). L&#39;uso di zebrafish mutante difettoso in diversi percorsi mitotici dimostrare la conseguenza di tali difetti. Per questo protocollo, Aurora B ESCO2 mutanti sono stati scelti per illustrare questi difetti. Aurora B è una chinasi che fa parte del complesso cromosoma passeggeri (CPC) coinvolte nella formazione del fuso e l&#39;attaccamento microtubuli. E &#39;anche necessario per la formazione di scissione solco nel cytokinesis 18,19. In zebrafish, la carenza di Aurora B porta a difetti di induzione solco, citocinesi, e la segregazione cromosoma 20. ESCO2, d&#39;altra parte, è un acetiltransferasi che è essenziale per sorella cromatidi coesione 21,22. Si acetila cohesin sulla parte SMC3 dell&#39;anello stabilizzando così cohesin per garantire una corretta segregazione cromosomica al passaggio metafase-anafase 23. Perdita di ESCO2 in zebrafish porta a chmissegregation romosome, prematura sorella separazione cromatidi, instabilità genomica, e p53-dipendente apoptosi e indipendenti 24,25. Grazie alla disponibilità, auroraB hi1045, e hi2865 ESCO2 zebrafish mutante (di seguito denominato aurB m / m ed ESCO2 m / m, rispettivamente) verrà utilizzato per illustrare questa tecnica 25-27. Accoppiamento microscopia confocale con macchinari cellule fluorescenti-tag ha permesso ai ricercatori di visualizzare cromatina e della membrana cellulare dinamiche durante la mitosi 25,28,29. istoni fluorescenti-tag sono stati storicamente utilizzati per la visualizzazione della cromatina. Gli istoni sono proteine ​​nucleari composti da quattro diverse coppie (H2A, H2B, H3, H4 e) che sono responsabili della struttura nucleosomi che compone i cromosomi 30. Mentre H2B è probabilmente il più usato per istone proteine ​​fluorescenti amouse e colture cellulari, l&#39;uso di istone 2A, Famiglia Z (H2A.F / Z) ha dimostrato bene per l&#39;uso in zebrafish 31,32. Concanavalina A e caseina chinasi 1-gamma per esempio, localizzare alla membrana cellulare e sono stati precedentemente dimostrato efficace nel visualizzare membrana cellulare in ricci e drosophila 33,34. Altri studi hanno dimostrato che la proteina fluorescente-tag CAAX etichette la membrana cellulare e ha avuto successo in zebrafish 31. CAAX è un motivo che è riconosciuto da enzimi di modificazione post-traduzionali quali farnesyltransferases e geranylgeranyltransferases. Modifiche di questi enzimi causano proteine ​​di diventare associata alla membrana, etichettatura così la membrana cellulare 35. A causa del precedente uso di zebrafish, questo protocollo ha scelto di utilizzare H2A.F / Z e CAAX di etichettare cromatina e la membrana cellulare. L&#39;applicazione di questo metodo permetterà al ricercatore di monitorare mitosi a livello di cella singola osservare singolo cromosomadinamiche, come monitorare e allo stesso tempo più divisioni cellulari che possono influire differenziazione dei tessuti e lo sviluppo. Questo articolo si concentrerà su l&#39;imaging le dinamiche di segregazione dei cromosomi durante la mitosi a livello singola cella. All&#39;interno di questo manoscritto, la capacità di osservare diverse divisioni mitotiche, calcolare il tempo di divisione, e decifrare i fenotipi mitotiche verrà illustrato e discusso. Utilizzando questi parametri, fisiologicamente dati rilevanti possono essere raccolti e applicati a diversi stati di malattia affetti da difetti mitotico.

<table><tbody><tr><td>pCS2 vectors</td><td>Gift from K. Kwan</td><td></td><td>For plasmid of interest</td></tr><tr><td>NotI-HF restriction enzyme</td><td>New England BioLabs</td><td>R3189S</td><td>For restriction digest of plasmid</td></tr><tr><td>mMessage SP6 kit</td><td>Life Technologies</td><td>AM1340</td><td>For &lt;em&gt;in vitro&lt;/em&gt; transcription</td></tr><tr><td>RNeasy Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>For purifying mRNA</td></tr><tr><td>100 x 15 mm Petri dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>For housing embryos</td></tr><tr><td>microinjection mold</td><td>homemade</td><td></td><td>For holding embryos during microinjection</td></tr><tr><td>Agarose II</td><td>Amresco</td><td>0815-25G</td><td>For embedding embryos</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521-10G</td><td>For anesthetizing embryos</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Calcium Chloride Dihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8106</td><td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Fisher Scientific</td><td>M7506</td><td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Methylene Blue Hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MB1</td><td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>100 mm culture tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-819-812</td><td>For melted agar</td></tr><tr><td>35 mm glass coverslip bottom culture dish&amp;nbsp;</td><td>MatTek Corp</td><td>P35G-0-20-C&amp;nbsp;</td><td>No. 0, 20 mm glass, For embedding embryos</td></tr><tr><td>#5 tweezers</td><td>Dumont</td><td>72701-D</td><td>For dechorionating embryos</td></tr><tr><td>21 G 1 1/2 gauge needle</td><td>Becton Dickinson</td><td>305167</td><td>For positioning embryos in agar</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Nikon AZ100</td><td></td><td>For screening and embedding embryos, any dissecting scope will do</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Nikon A1+</td><td></td><td>For time-lapse imaging</td></tr><tr><td>Confocal software</td><td>NIS Elements AR 4.13.00</td><td></td><td>For image acquisition and processing</td></tr></tbody></table>

observing mitotic division and dynamics in a live zebrafish embryo

La mitosi è fondamentale per la crescita e la differenziazione organismal. Il processo è altamente dinamico e richiede ordinato eventi per realizzare una corretta condensazione della cromatina, l&#39;attaccamento ai microtubuli cinetocoro, segregazione dei cromosomi, e citocinesi in un piccolo lasso di tempo. Errori nel delicato processo può portare a malattie umane, tra cui difetti di nascita e il cancro. Gli approcci tradizionali che indagano stati di malattia mitotico umani spesso si basano su sistemi di coltura cellulare, che non hanno la naturale fisiologia e contesto di sviluppo / tessuto-specifica vantaggiosa quando si studia la malattia umana. Questo protocollo supera molti ostacoli, fornendo un modo per visualizzare, ad alta risoluzione, la dinamica dei cromosomi in un sistema di vertebrati, il pesce zebra. Questo protocollo saranno i dettagli di un approccio che può essere usato per ottenere immagini dinamiche di cellule in divisione, che comprendono: la trascrizione in vitro, allevamento zebrafish / raccolta, embrione embedding, e time-lapse imaging. Ottimizzazione e modifications di questo protocollo sono anche esplorati. Utilizzando H2A.F / Z-EGFP (etichette cromatina) e mCherry-CAAX (etichette cella a membrana) embrioni mRNA-iniettato, mitosi in AB wild-type, auroraB hi1045, e hi2865 ESCO2 zebrafish mutante viene visualizzato. Ad alta risoluzione delle immagini dal vivo in zebrafish permette di osservare più mitosi per quantificare statisticamente difetti mitotici e tempi di progressione mitotico. Inoltre, si osservano osservazione di aspetti qualitativi che definiscono i processi impropri mitosi (ad esempio, difetti congressione, missegregation di cromosomi, ecc) e gli esiti cromosomiche improprio (ad esempio, aneuploidia, poliploidia, micronuclei, etc.). Questo test può essere applicato alla osservazione di tessuti differenziazione / sviluppo ed è suscettibile all&#39;uso di zebrafish mutante e agenti farmacologici. Visualizzazione di come difetti di mitosi portare a disturbi del cancro e di sviluppo sarà notevolmentemigliorare la comprensione della patogenesi della malattia.

La figura 2 mostra la capacità di osservare molte divisioni cellulari che utilizzano un ampio panorama di un campo di tipo selvaggio coda zebrafish AB. Oltre sette cellule mitotiche vengono esposte in un arco di tempo 14 min (Film 1). Entro il corso di due ore, più di 40 eventi mitotico sono stati catturati. In media, 50 cellule in divisione sono stati osservati nel 30 AB e divisione delle cellule in AUR B m / m embrioni <s...

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Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

Osservando divisione mitotica e Dynamics in un embrione vivo Zebrafish

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

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Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Imaging strutture subcellulari nell&#39;embrione Living Zebrafish

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

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Biologia dello sviluppo

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. In particular, posterior body elongation is an essential process in embryonic development by which multiple tissue deformations act together to direct the formation of a large part of the body axis. In order to observe this process by long-term time-lapse imaging it is necessary to utilize a mounting technique that allows sufficient support to maintain samples in the correct orientation during transfer to the microscope and acquisition. In addition, the mounting must also provide sufficient freedom of movement for the outgrowth of the posterior body region without affecting its normal development. Finally, there must be a certain degree in versatility of the mounting method to allow imaging on diverse imaging set-ups. Here, we present a mounting technique for imaging the development of posterior body elongation in the zebrafish D. rerio. This technique involves mounting embryos such that the head and yolk sac regions are almost entirely included in agarose, while leaving out the posterior body region to elongate and develop normally. We will show how this can be adapted for upright, inverted and vertical light-sheet microscopy set-ups. While this protocol focuses on mounting embryos for imaging for the posterior body, it could easily be adapted for the live imaging of multiple aspects of zebrafish development.

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Un metodo di montaggio versatile per il lungo termine Imaging di sviluppo Zebrafish

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to numerous cell types throughout the body. Understanding the biology of the neural crest has been limited, reflecting a lack of genetically tractable models that can be studied in vivo and in real-time. Zebrafish is a particularly important developmental model for studying migratory cell populations, such as the neural crest. To examine neural crest migration into the developing eye, a combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time videos of the developing eye in transgenic zebrafish embryos, namely Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP), as sox10 and foxd3 have been shown in numerous animal models to regulate early neural crest differentiation and likely represent markers for neural crest cells. Multi-photon time-lapse imaging was used to discern the behavior and migratory patterns of two neural crest cell populations contributing to early eye development. This protocol provides information for generating time-lapse videos during zebrafish neural crest migration, as an example, and can be further applied to visualize the early development of many structures in the zebrafish and other model organisms.

A combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time imaging of neural crest migration in Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP) zebrafish embryos.

Multi-fotone Time Lapse Imaging per visualizzare lo sviluppo in tempo reale: visualizzazione della migrazione di cellule neurali della cresta negli embrioni di Zebrafish

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Vivere Imaging of the Brain Zebrafish embrionali da microscopia confocale

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Biologia

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene knockdown approaches can be utilized to examine the molecular mechanisms underlying nervous system development. Second, large clutches of developmentally synchronized embryos provide large experimental sample sizes. Third, the optical clarity of the zebrafish embryo permits researchers to visualize progenitor, glial, and neuronal populations. Although zebrafish embryos are transparent, specimen thickness can impede effective microscopic visualization. One reason for this is the tandem development of the spinal cord and overlying somite tissue. Another reason is the large yolk ball, which is still present during periods of early neurogenesis. In this article, we demonstrate microdissection and removal of the yolk in fixed embryos, which allows microscopic visualization while preserving surrounding somite tissue. We also demonstrate semipermanent mounting of zebrafish embryos. This permits observation of neurodevelopment in the dorso-ventral and anterior-posterior axes, as it preserves the three-dimensionality of the tissue.

Developmental processes such as proliferation, patterning, differentiation, and axon guidance can be readily modeled in the zebrafish spinal cord. In this article, we describe a mounting procedure for zebrafish embryos, which optimizes visualization of these events.

Dissezione e laterale Montaggio di embrioni di zebrafish: analisi dello sviluppo del midollo spinale

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

Neuroscienze

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

Immagini dal vivo della motilità cellulare e citoscheletro dei singoli neuroni e cellule della cresta neurale in embrioni di zebrafish

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

Visualizzare il cervello in via di sviluppo nel pesce zebra vivente utilizzando Brainbow e Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...

<meta charset="utf8"></head><body>Protocollo di microscopia a foglio luminoso multiview perfezionato per embrioni di zebrafish

Light Sheet Microscopy Imaging and Mounting Strategies for Early Zebrafish Embryos

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In particular, a multiview system, which allows sample rotation, enables imaging of entire embryos from different angles. However, in most imaging sessions with a multiview system, sample mounting is a troublesome process as samples are usually prepared in a polymer tube. To aid in this process, this protocol describes basic mounting strategies for imaging early zebrafish development between the 70% epiboly and early somite stages. Specifically, the study provides statistics on the various positions the embryos default to at the 70% epiboly and bud stages within the chorion. Furthermore, it discusses the optimum number of angles and the interval between angles required for imaging whole zebrafish embryos at the early stages of development so that cellular-scale information can be extracted by fusing the different views. Finally, since the embryo covers the entire field of view of the camera, which is required to obtain a cellular-scale resolution, this protocol details the process of using bead information from above or below the embryo for the registration of the different views.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Strategie per il montaggio di embrioni di zebrafish per la microscopia a foglio luminoso multivista ad alta risoluzione - Tecniche per l'ima

A sample preparation strategy for imaging early zebrafish embryos within an intact chorion using a light-sheet microscope is described. It analyzes the different orientations that embryos acquire within the chorion at the 70% epiboly and bud stages and details imaging strategies for obtaining cellular-scale resolution throughout the embryo using the light-sheet system.

Imaging al microscopio a foglio leggero e strategie di montaggio per embrioni precoci di zebrafish

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In ...

Osservando divisione mitotica e Dynamics in un embrione vivo Zebrafish

Riepilogo

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Imaging al microscopio a foglio leggero e strategie di montaggio per embrioni precoci di zebrafish

Imaging al microscopio a foglio leggero e strategie di montaggio per embrioni precoci di zebrafish

Imaging al microscopio a foglio leggero e strategie di montaggio per embrioni precoci di zebrafish