AirID è un enzima prezioso per l'interazione proteina-proteina e crea meno tossicità e meno errori nei processi che richiedono tempo rispetto ad altri enzimi che marcano la prossimità. Viene presentato un protocollo passo-passo per l'esecuzione dell'esperimento di marcatura di prossimità in cetriolo o Cucumis sativus utilizzando AT4G18020 proteina APRR2-AirID come modello. A dimostrare la procedura saranno Ahmad Zada, Imran Khan, Yuting Cheng e Min Zhang del mio laboratorio.
Inizia trasferendo i semi di Cucumis sativus o cetriolo in acqua, incubandoli a 50 gradi Celsius per 20 minuti, quindi posizionando i semi sulla carta da filtro su una piastra di Petri per 12-16 ore. Successivamente, trasferisci i semi in vasi contenenti terriccio e coltivali in una camera climatica a 23 gradi Celsius in 16 ore di luce e 18 ore di buio per tre o quattro settimane. Trasferire 2,5 microlitri del plasmide EarleyGate 100 alle cellule competenti del ceppo agrobacterium tumefaciens GV3101.
Incubare la provetta su ghiaccio per 30 minuti prima di trasferirla in azoto liquido per tre minuti. Per dare lo shock termico, trasferire il tubo nell'incubatrice a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Quindi metti il tubo sul ghiaccio per due minuti.
Aggiungere 1.000 microlitri di terreno Luria Bertani o LB alle cellule di agrobatterio sottoposte a shock termico. Dopo aver incubato le cellule a 30 gradi Celsius e 118 RPM per un'ora, centrifugarle a 3000 G per due minuti a quattro gradi Celsius. Quindi scartare il surnatante da 800 microlitri e mescolare la soluzione rimanente.
Piastrarlo sul terreno LB integrato con 50 microgrammi per millilitro di kanamicina e gentamicina ciascuno e 25 microgrammi per millilitro di rifampicina. Incubare le piastre a 30 gradi Celsius per 48 ore. Prelevare alcune colonie batteriche dalle piastre.
Metterli in terreni liquidi LB, integrati con antibiotici appropriati e incubare LB liquidi a 30 gradi Celsius e 218 RPM per 36-48 ore. Dopo due minuti di centrifugazione a 3.000 G a quattro gradi Celsius, risospendere il pellet in un tampone di agroinfiltrazione per regolare la densità ottica a uno alla lunghezza d'onda di 600 nanometri. Utilizzando una siringa senza ago da un millilitro, infiltrare l'intera epidermide della superficie abassiale con 1,5 millilitri di inoculo agrobatterico risospeso.
Mantenere le piante nella camera climatica a 23 gradi Celsius con 75 micromoli per metro quadrato al secondo di luce per 16 ore in condizioni di oscurità per otto ore Dopo 36 ore, infiltrare un millilitro di cinque microgrammi di biotina nelle foglie già filtrate. Dopo 4-12 ore di infiltrazione di biotina, tagliare le foglie e trasferirle rapidamente in azoto liquido per evitare la degradazione delle proteine. Macinare le foglie con un pestello e un mortaio e aggiungere rapidamente due millilitri di PBS BSA a pH 7,4, seguito da una macinazione lenta.
Trasferire la miscela di campioni in una provetta conica da 15 millilitri attraverso un filtro per materiale filtrante rapido posto sopra di essa e mantenere la provetta su ghiaccio. Trasferire i campioni in una provetta da due millilitri. Aggiungere un cocktail di inibitori proteici all'1% e mescolare il contenuto ruotando la provetta su e giù da sette a otto volte prima di centrifugarla.
Una volta fatto, trasferire il surnatante in una nuova provetta da due millilitri e aggiungere il 10% di beta-D-maltoside. Mettere la provetta su ghiaccio per cinque minuti prima di centrifugarla a 20.000 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Per equilibrare la colonna di dissalazione, segnare un lato della colonna e centrifugarlo con il lato contrassegnato rivolto verso l'esterno.
Rimuovere il coperchio superiore e inferiore della colonna e centrifugare nuovamente a 1.000 G per due minuti a quattro gradi Celsius. Scartare la soluzione liquida dalla provetta di raccolta della colonna e lavare la provetta con cinque millilitri di tampone PBS con centrifugazione come precedentemente dimostrato, almeno cinque volte. Aggiungere un millilitro di PBS BSA a 50 microlitri di microsfere magnetiche coniugate con streptavidina-C1 in una provetta da 1,5 millilitri e mescolare accuratamente.
Posiziona il tubo su un supporto magnetico per tre minuti per assorbire le perline verso un lato del tubo. Scartare il surnatante dall'altro lato e ripetere questo lavaggio PBS BSA tre volte. Per arricchire la proteina biotinilata, aggiungere due millilitri di campioni alla colonna.
Dopo la centrifugazione della colonna a 1000 G per otto minuti a quattro gradi Celsius, aggiungere un millilitro di estratto proteico dissalato a 50 microlitri di microsfere magnetiche coniugate con streptavidina-C1. Miscelare accuratamente la soluzione posizionando il tubo contenente le perle magnetiche sul rotatore a velocità normale e a temperatura ambiente per 30 minuti. Quindi, posiziona le perline sulla griglia magnetica per tre minuti a temperatura ambiente o fino a quando non si raccolgono su un lato del tubo.
Rimuovere delicatamente il surnatante e aggiungere un millilitro di tampone di lavaggio. Ruotare la provetta per due minuti su un rotatore e ripetere il passaggio eseguito sulla cremagliera magnetica per rimuovere il surnatante. Allo stesso modo, eseguire i lavaggi con un millilitro di tamponi di lavaggio due e tre come dimostrato in precedenza.
Successivamente, rimuovere il detersivo nei tamponi di lavaggio aggiungendo 1,7 millilitri di 50 millimolari di tris cloridrato e ripetendo il passaggio eseguito sulla griglia magnetica. Somministrare sei lavaggi di due minuti ciascuno utilizzando un millilitro di tampone di bicarbonato di ammonio da 50 millimolari. Una volta fatto, aggiungere 50 microlitri di estratto proteico contenente 50 millimolari di tris cloridrato, 12% di saccarosio, 2% di litio laurilsolfato e 1,5% di ditiotreitolo alle perle e posizionare il tubo nell'incubatrice a 100 gradi Celsius per cinque minuti per dare uno shock termico.
Dopo aver ripetuto il passaggio su un rack magnetico, conservare il surnatante a meno 80 gradi Celsius per l'analisi LCMS/MS. L'analisi western blot delle proteine estratte ha mostrato un'espressione proteica e una biotinilazione di successo nelle foglie di cetriolo infiltrate. Il più alto livello di espressione delle proteine marcate e delle bande extra rispetto al controllo ha confermato il successo della marcatura delle proteine bersaglio del gene di interesse da parte di AirID.
I risultati sono stati confermati utilizzando gli anticorpi Anti-Flag e Anti-Mass che mostrano la banda bersaglio con un anticorpo Anti-Flag in tutti i campioni trasformati. Dopo aver arricchito le proteine biotinilate con microsfere magnetiche coniugate con streptavidina-C1, sono state osservate più proteine di diverse dimensioni. Da tutti i risultati, si è concluso che AirID è un enzima nuovo e ideale per l'analisi delle interazioni proteina-proteina nelle piante.
Durante l'esperimento di marcatura di prossimità, è importante ricordare che la durata della biotina e dell'HR di cinque micromolari è l'ideale. Il protocollo delinea passo dopo passo l'impostazione dell'etichettatura di prossimità basata su AirID nella pianta, compresa la preparazione del campione fogliare, la rimozione della pre-biotina, la quantificazione delle proteine dell'estratto e l'arricchimento delle proteine biotinilate. Si prevede che AirID migliorerà l'accuratezza della biotinilazione indipendente da PPI in combinazione.
Si conclude che AirID è ideale per l'analisi PPI nelle piante.
