L'aneuploidia è la principale causa genetica di aborto spontaneo precoce negli esseri umani. La maggior parte degli errori nella segregazione cromosomica si verificano durante la meiosi negli ovociti. Pertanto, la valutazione del checkpoint di assemblaggio del fuso negli ovociti è fondamentale per capire perché gli ovociti sono soggetti a errori.
Qui descriviamo tre tecniche per valutare in modo completo l'integrità del SAC negli ovociti di topo esaminando diversi passaggi critici al checkpoint utilizzando una combinazione di imaging dal vivo e immunofluorescenza. A dimostrare la procedura sarà la dottoressa Cecilia Blengini, ricercatrice associata del mio laboratorio. Per iniziare preparare un millilitro di terreno di coltura contenente nocodazolo e reversine con DMSO come controllo come descritto nel manoscritto.
Per la maturazione degli ovociti e l'imaging dal vivo utilizzare una piastra preriscaldata a 96 pozzetti in un'incubatrice. E caricare il primo, il secondo e il terzo pozzo con 150 microlitri del controllo DMSO, nocodazolo e nocodazolo più trattamento reversine rispettivamente. Mantenendo la lastra nell'incubatore nelle condizioni descritte nel manoscritto.
Per iniziare la maturazione miotica, rimuovere milrinone trasferendo sequenzialmente gli ovociti attraverso 6 gocce di 100 microlitri di terreni di coltura liberi da milrinone contenenti DMSO. E mettili nel pozzetto corrispondente della piastra a 96 pozzetti. Uso di una pipetta azionata a mano o a bocca durante la visualizzazione degli ovociti al microscopio stereo.
Visualizzare gli ovociti utilizzando un microscopio a campo luminoso dotato di una camera di incubatrice con un ambiente controllato a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica e 80% di umidità. Acquisire immagini sul piano intermedio degli ovociti ad intervalli di 20 minuti per 24 ore. Dopo aver quantificato il numero di ovociti che estrudono un corpo polare identificando le cellule che attraversano citochine asimmetriche con una piccola cellula accanto all'uovo e all'interno della zona pellucida condivisa.
Visualizza le immagini utilizzando il software di imaging. Microiniettare ovociti arrestati pro-fase uno con 100 nanogrammi per microlitri di cRNA securin-gfp precedentemente preparato. Dopo la microiniezione, lasciare che gli ovociti recuperino e traducano l'RNA nell'incubatore di anidride carbonica per almeno tre ore.
Quindi caricare 150 microlitri di terreni di coltura con o senza cinque micromolari di nocodazolo. E 150 microlitri di terreno di coltura con 0,5 micromolari di reversine in tre diversi pozzetti di una piastra da 96 pozzetti. Lavare gli ovociti microiniettati attraverso sei gocce di terreno di coltura libero da milrinone E trasferire un terzo degli ovociti in ogni trattamento.
Tenere la piastra nell'incubatrice a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica e l'80% di umidità fino a quando gli ovociti non riprendono la meiosi, circa tre ore dopo il lavaggio del milrinone. Registrare immagini della maturazione degli ovociti utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di una camera di incubatrice. Utilizzare software di analisi delle immagini per quantificare la distruzione securin-gfp e aprire le immagini del canale GFP, a partire dal tempo 0.1.
Nel software di analisi preferito, utilizzare lo strumento selezione o forma per contrassegnare ogni ovocita e generare una regione di interesse per ogni cellula. Utilizza la stessa area di interesse per selezionare un'area di sfondo da sottrarre in seguito e misurare l'intensità dei pixel GFP in ogni regione di interesse in tutti i punti temporali. Infine, ad ogni valore GFP, sottrarre la misura della regione di interesse sullo sfondo.
Dopo aver diviso la meiosi in tre gruppi, trasferire ciascun gruppo di meiosi in gocce da 100 microlitri di terreni di coltura liberi da milrinone. Coprire le gocce con olio minerale e metterle nell'incubatore per tre, cinque e sette ore per raggiungere rispettivamente la fase di prometafase uno, la prometafase uno tardiva e la fase di metafase uno. Nei punti temporali assegnati, fissare gli ovociti trasferendoli in gocce da 500 microlitri di paraformaldeide al 2% in tampone PME per 20 minuti a temperatura ambiente utilizzando un piatto di vetro a nove pozzetti.
Quindi trasferire le cellule in un pozzetto pulito contenente una goccia da 500 microlitri di soluzione bloccante. Per continuare la rilevazione MAD2, trasferire gli ovociti in un pozzetto pulito contenente una goccia da 500 microlitri di soluzione di permeabilizzazione. Dopo l'incubazione per 20 minuti a temperatura ambiente, trasferire le cellule in un nuovo pozzetto di soluzione bloccante e incubare per 10 minuti.
Trasferire gli ovociti in una goccia da 30 microlitri di soluzione bloccante con anticorpo anti-MAD2 e anticorpo anti-centromero e incubare per due ore a temperatura ambiente. Per lavare gli anticorpi primari in eccesso dopo aver trasferito le cellule a 30 microlitri di tampone PME integrato con Tritone 0,5%, incubare per 10 minuti nella camera umidificata. Trasferire le cellule in una goccia da 30 microlitri di soluzione bloccante contenente anticorpi secondari come anti-umano 633 e anti-coniglio 568.
E incubare per un'ora a temperatura ambiente. Per montare le celle sul vetrino del microscopio, trasferire le cellule su una goccia da 10 microlitri di supporto di montaggio contenente DAPI. Aggiungi piccoli punti di vaselina ad ogni angolo del foglietto di copertina.
Posizionarli con cautela sopra la goccia del supporto di montaggio e premere lentamente per distribuire. Sigillare la sottoveste di copertura sulla diapositiva con smalto trasparente. Cinetocori di immagini utilizzando un microscopio confocale dotato di un obiettivo 40 o 63X.
E utilizzando il segnale anticorpale anti-centromero determinare la gamma Z che consente l'imaging dell'intera area cromosomica. Gli ovociti di controllo trattati con DMSO hanno estruso un corpo polare circa 14 ore dopo il rilascio dal milrinone. Dopo l'attivazione del SAC, gli ovociti trattati con nocodazolo sono stati arrestati nella prima metafase e non hanno estrudito un corpo polare.
Tuttavia, in assenza di attivazione SAC, gli ovociti hanno estruso un corpo polare nonostante non avessero attaccamenti microtubuli cinetocori. È stato valutato il tasso di degradazione della securina-gfp durante la maturazione miotica. In cui l'intensità di controllo degli ovociti trattati con DMSO inizia a diminuire a circa 10 ore dopo il washout del milrinone.
Quando gli ovociti sono stati maturati in presenza dell'agente attivante SAC, nocodazolo, i livelli di securina-gfp erano stabili durante l'intero periodo di maturazione miotica. Al contrario, quando si previene l'attivazione del SAC con il trattamento reversino, il pattern securina-gfp accelera e la degradazione inizia circa quattro ore dopo il washout del milrinone coerente con l'inibizione del SAC. L'imaging confocale è stato impiegato per rilevare centromeri e MAD2 di ovociti maturati all'inizio della prometafase uno, alla prometafase uno tardiva e alla metafase uno.
Per valutare la forza del segnale SAC, è stata quantificata l'intensità dei pixel MAD2 localizzata cinetocora. Livelli significativi di reclutamento di MAD2 nei cinetocori si verificano nella prima prometafase uno, quando la maggior parte dei cinetocori non erano attaccati ai microtubuli. I livelli di MAD2 si sono ridotti nella prometafase successiva ed erano quasi assenti alla metafase uno, quando tutti i cinetocori erano stabilmente attaccati ai microtubuli.
È importante sottolineare che ognuna di queste tecniche ha i suoi limiti e la sua interpretazione. E suggeriamo di eseguire una combinazione di questi metodi per valutare l'integrità del SAC. Questi tre saggi consentono ai ricercatori di valutare la severità del sacco negli ovociti fornendo informazioni su una potenziale causa di aneuploidia nelle uova umane.
