Questo protocollo descrive come indurre la steatosi vescicolare epatica in cellule EpaRG differenziate e metodi per il rilevamento e la quantificazione dell'accumulo lipidico. Questo modello di cellule umane in vitro rappresenta una valida alternativa ai modelli di topi in vivo e agli epatociti umani primari. Scongelare un lotto a basso passaggio crioconservato di azoto di cellule HepaRG immergendole in un bagno di 37 gradi Celsius fino a quando non viene scongelato.
Trasferire rapidamente le cellule in un tubo da 15 millilitri contenente 10 millilitri di mezzo proliferano. Dopo aver centrifugato per cinque minuti, scartare il supernatante e rimescolare le cellule in cinque millilitri di mezzo proliferano. Contare le cellule e diluire per placcare 250.000 cellule per centimetro quadrato.
Placcare le cellule su piatti di coltura cellulare da 100 millimetri e rinnovare il mezzo ogni due o tre giorni. Le cellule proliferano con un tempo di raddoppio di circa 24 ore. Una volta che le cellule HepaRG raggiungono l'80% di confluenza, staccarle attraverso un'incubazione da tre a cinque minuti con una soluzione di tripside allo 0,05%.
Raccogliere le cellule in mezzo proliferano e centrifugare per cinque minuti come prima. Scartare il supernatante e rimescolare le cellule con cinque millilitri di mezzo proliferano. Ancora una volta, contare le cellule e diluire per placcare 250.000 celle per centimetro quadrato.
In questa fase, amplificare le cellule ripetendo questi passaggi per raggiungere un numero appropriato di celle per avviare esperimenti. Per crioconservare le cellule HepaRG, staccare le cellule 24 ore dopo la placcatura attraverso un'incubazione da tre a cinque minuti con una soluzione di tripside allo 0,05%. Raccogliere le cellule in mezzo proliferano e centrifugare per cinque minuti come prima.
Scartare il supernatante, rimescolare le cellule in un millilitro per lotto di mezzo di congelamento e crioconservare i lotti in azoto liquido. Il giorno zero, seminare cellule HepaRG a 250.000 cellule per centimetro quadrato in piatti trattati con coltura con un volume appropriato di mezzo di proliferazione. Due piatti devono essere placcati per ogni saggio, uno per le celle di controllo e uno per le cellule trattate con oleati.
Il secondo e il quarto giorno, cambiare il mezzo con un volume appropriato di mezzo di proliferazione e lasciare che le cellule crescano fino a raggiungere la confluenza. Il settimo giorno, le celle devono essere confluenti al 100%. Lavare le celle una volta con 1X PBS.
Quindi, rimuovere il PBS 1X e aggiungere un volume appropriato di mezzo di differenziazione. Nei giorni otto, nove, 12, 15 e 18, lavare le cellule una volta con 1X PBS prima di aggiungere un volume appropriato di mezzo di differenziazione. Il giorno 21, osservare le cellule HepaRG al microscopio e assicurarsi che le cellule siano colture differenziate confluenti.
Come controllo, raccogli una piastra di controllo per eseguire l'analisi dell'espressione genica dei geni marcatori di differenziazione. Al giorno 21, le cellule EpaRG differenziate possono essere crioconservate in azoto liquido. Il giorno 21, diluire l'oleato di sodio con un volume appropriato di mezzo di differenziazione completo fino a una concentrazione finale di 250 micromolare.
Aggiungere il 99% di metanolo con un rapporto da uno a 400 in un'altra aliquota di mezzo di differenziazione per effettuare il trattamento di controllo del veicolo. Lavare le cellule una volta con 1X PBS e aggiungere veicolo o mezzo oleato di sodio. Il giorno 23 e il giorno 25, cambiare il mezzo con il volume appropriato di mezzo appena preparato.
Il giorno 26, osservare le cellule per microscopia ottica. Le goccioline lipidiche si accumulano nelle cellule trattate con oleato di sodio e sono facilmente visibili come goccioline traslucide nel citoplasma. Per eseguire la colorazione Oil Red O, lavare prima le celle una volta con 1X PBS e rimuovere completamente il PBS 1X.
Aggiungere il 4% di paraformaldeide e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere la paraformaldeide e lavare le cellule due volte con 1X PBS. Dopo aver rimosso il PBS, incubare le cellule con il 60% di isopropanolo per cinque minuti a temperatura ambiente.
Rimuovere l'isopropanolo e lasciare asciugare completamente le cellule a temperatura ambiente. Ora aggiungi la soluzione di lavoro Oil Red O alle cellule e incuba a temperatura ambiente per 30 minuti. Il volume di soluzione di lavoro richiesto per ciascun campione corrisponde al volume di supporti utilizzati per coltivare le cellule.
Rimuovere la soluzione Oil Red O e aggiungere immediatamente acqua a doppia distillazione. Dopo aver lavato le cellule quattro volte con acqua doppia distillata, acquisire immagini al microscopio per l'analisi. Per elusare il colorante Oil Red O, rimuovere tutta l'acqua e lasciare asciugare.
Quindi, aggiungere un millilitro di isopropanolo al 100% e incubare per 10 minuti con scuotimenti delicati a temperatura ambiente. Pipettare l'isopropanolo con olio diluito Red O colorante su e giù più volte, assicurando che tutto l'Olio Rosso O sia nella soluzione. Trasferire la soluzione in una cuvetta.
Misurare la densità ottica a 500 nanometri mediante spettrofotometria e utilizzare l'isopropanolo al 100% come vuoto. Lavare le celle una volta con 1X PBS. Quindi, incubare con 100 nanomolari di Bodipy diluito in 1X PBS al buio per 40 minuti a 37 gradi Celsius.
Nelle misurazioni della citometria del flusso deve essere incluso un controllo non macchiato. Rimuovere la soluzione di colorazione e lavare le celle una volta con 1X PBS. Quindi, lavare di nuovo le celle e rimuovere completamente il PBS.
Aggiungere il 4% di paraformaldeide e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere la paraformaldeide e lavare i campioni tre volte per cinque minuti in PBS. Le celle possono essere conservate in 1X PBS a quattro gradi Celsius o immediatamente immagini.
Per lo stoccaggio, avvolgere con Parafilm e coprire con un foglio di alluminio per evitare che le cellule si asciughino. Per verificare l'induzione efficiente della steatosi, le cellule HepaRG trattate con oleato e di controllo sono state macchiate con colorante Oil Red O. Dopo la colorazione, le goccioline lipidiche sono facilmente visibili come goccioline rosse.
La colorazione può essere quantificata mediante misurazione spettrofotometrica del colorante Oil R O eluito con isopropanolo. L'assorbanza dell'olio diluito Red O dalle cellule è direttamente proporzionale all'accumulo di goccioline lipidiche citoplasmatiche. La concentrazione di oleato di sodio e il tempo di esposizione sono stati determinati dal saggio di vitalità delle cellule colorimetriche MTT.
Il prodotto formosano è quantificato dalla sua assorbanza a 490 nanometri ed è direttamente proporzionale al numero di cellule viventi in coltura. Il trattamento con oleato di sodio è stato confrontato con il trattamento con palmitato di sodio. Il farmaco apoptotico doxorubicina è stato usato come controllo.
Per quantificare l'aumento del contenuto lipidico cellulare dopo il trattamento con oleato di sodio, la colorazione con colorante Bodipy è stata utilizzata per etichettare le goccioline lipidiche. Utilizzando l'analisi citofluorometrica, è possibile quantificare il contenuto di trigliceridi per intensità fluorescente media di Bodipy, che è più alta nelle cellule trattate con oleati rispetto alle cellule di controllo. Ciò indica un efficiente accumulo di grasso dopo il trattamento con oleato.
In effetti, le immagini delle cellule macchiate di Bodipy mostrano goccioline lipidiche fluorescenti verde brillante in cellule trattate con oleati che non sono visibili nelle cellule di controllo. Per caratterizzare ulteriormente l'accumulo di goccioline lipidiche dopo il trattamento con oleato di sodio, la microscopia CARS può essere eseguita come descritto nel protocollo di testo che consente la quantificazione delle goccioline lipidiche senza etichettatura. Questo modello basato su cellule può aumentare la conoscenza dei meccanismi molecolari coinvolti nella malattia epatica grassa non oncotica e potrebbe portare allo sviluppo di nuovi marcatori per la diagnosi precoce e nuove strategie di trattamento.
