Gli autori ringraziano Robert Schuster per l'assistenza nella verifica dei dati.

Il flusso di lavoro di alto livello per mAbScale è illustrato nella Figura 2. Ogni fase ha rami decisionali interni più sofisticati, cicli e combinatoria. Un flusso di lavoro algoritmico dettagliato che descrive il processo di calcolo è presentato nella Figura 1 supplementare. L'output dell'applicazione viene salvato in formato foglio di calcolo nella cartella selezionata dall'utente. Il file di output è costituito da più fogli di lavoro separati, che possono essere classificati come input dell'utente, calcoli del peso molecolare e riferimenti per le derivazioni di massa isotopiche medie (l'output di esempio è fornito in tabelle supplementari). I fogli di lavoro di input dell'utente includono le sequenze di amminoacidi proteici e altre informazioni inserite dall'utente, le masse elementari medie e le masse dei glicani, che vengono utilizzate per calcolare la composizione elementare e i diversi pesi molecolari. I fogli di calcolo del peso molecolare includono la composizione chimica di varie forme, la massa ridotta con e senza glicosilazione e modificazione chimica e la massa intatta con e senza glicosilazione e modificazione chimica. I fogli contenenti le masse di semi-anticorpi verranno generati automaticamente se l'utente inserisce due diversi HC e/o due diversi LC nella pagina di input dell'utente, poiché i semianticorpi sono impurezze primarie che devono essere identificate e quantificate rispetto all'eterodimero desiderato. È possibile accedere al codice sorgente di mAbScale tramite il seguente repository: https://github.com/kkhatri99/mAbScale.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65298/65298fig02.jpg"> Figura 2: Panoramica dei passaggi coinvolti nel calcolo delle composizioni elementari e delle masse utilizzando l'applicazione. La codifica a colori può essere utilizzata per collegarsi al flusso di processo descritto nella Figura 1 supplementare. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65298/65298fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
1. Apertura dell'applicazione mAbscale
<ol><li>Aprire l'applicazione software facendo doppio clic sull'icona del file eseguibile.</li>
</ol>2. Inserimento della sequenza
<ol><li>Immettere le sequenze di catene pesanti e catene leggere nelle rispettive caselle di testo contrassegnate con 1 senza spazi.<ol><li>Per i bsAbs, aggiungi altre catene pesanti o leggere nella seconda serie di caselle di testo contrassegnate con 2. Lasciare 2 vuoti per gli anticorpi monoclonali con catene pesanti identiche e catene leggere.</li>
		<li>Selezionare le caselle di controllo N-Terminal Cyclization e/o C-Terminal Clipping , se queste varianti di terminali a catena pesante sono applicabili.</li>
		<li>Aggiungere eventuali modifiche chimiche, inclusi linker e payload per le molecole ADC, alle caselle di testo Heavy Chain Chem Mod e/o Light Chain Chem Mod.<ol><li>Specificate le modifiche come composizioni elementari, ad esempio CaCl2. La modifica verrà aggiunta alla rispettiva subunità o catena proteica. NOTA: Una composizione chimica può anche essere sottratta da una subunità o catena anteponendo alla composizione elementare un segno -. Ad esempio, -H2O sottrarrà una molecola d'acqua dalla composizione e dalla massa della subunità.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>3. Specificare il numero di legami disolfuro
<ol><li>Specificare il numero di legami disolfuro nelle molecole proteiche nella casella di testo Numero totale di disolfuri.</li>
	<li>Immettere il numero di disolfuri di HC non ridotti nella casella di testo Disolfuri di HC non ridotti e il numero di disolfuri LC non ridotti nella casella di testo Disolfuri LC non ridotti, a seconda dell'entità della riduzione (completa o parziale). NOTA: L'analisi della massa ridotta delle subunità di anticorpi monoclonali comporta la riduzione/separazione delle catene pesanti e leggere legate al disolfuro.</li>
	<li>Se la glicosilazione è presente sulla catena leggera mAb, selezionare la casella di controllo La catena leggera è glicosilata .</li>
</ol>4. Impostazione della cartella di output ed esecuzione dell'applicazione
<ol><li>Fare clic sul pulsante Sfoglia per selezionare una cartella di output per la casella di testo Cartella di output .</li>
	<li>Immettere il nome del file di output senza estensione (viene salvato automaticamente come .xlsx) nella casella di testo File Excel (no ext). </li>
	<li>Fare clic sul pulsante Invia per avviare l'applicazione. Il file di output si trova nella cartella designata. NOTA: Le masse elementari e l'elenco dei glicani possono essere personalizzati modificando i file di testo delimitati Element_Mass.csv (Supplementary Coding File 1) e Glycan.csv (Supplementary Coding File 2), rispettivamente. Questi file devono essere inseriti nella stessa cartella del file eseguibile mAbScale.exe (Supplementary Coding File 3) per l'esecuzione dell'applicazione. L'applicazione verrà chiusa automaticamente dopo un'esecuzione. L'utente dovrà riavviare l'app se è necessario un secondo calcolo.</li>
</ol>

Uno strumento basato su Python per il calcolo accurato della massa di entità bioterapeutiche

<ol>
	<li>Reichert, J. M., Valge-Archer, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+trends+for+monoclonal+antibody+cancer+therapeutics.">Development trends for monoclonal antibody cancer therapeutics.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 6 (5), 349-356 (2007).</li><li>Kintzing, J. R., Filsinger Interrante, M. V., Cochran, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+strategies+for+developing+next-generation+protein+therapeutics+for+cancer+treatment.">Emerging strategies for developing next-generation protein therapeutics for cancer treatment.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 37 (12), 993-1008 (2016).</li><li>Wang, M. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2:+Structure,+biology,+and+structure-based+therapeutics+development.">SARS-CoV-2: Structure, biology, and structure-based therapeutics development.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 587269 (2020).</li><li>ICH Q8 (R2) Pharmaceutical Development - Scientific Guideline. European Medicines Agency Available from: <a target="_blank" href="https://www.ema.europa.eu/en/ch-q8-r2-pharmaceutical-development-scientific-guideline">https://www.ema.europa.eu/en/ch-q8-r2-pharmaceutical-development-scientific-guideline</a> (2018)</li><li>Donnelly, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Best+practices+and+benchmarks+for+intact+protein+analysis+for+top-down+mass+spectrometry.">Best practices and benchmarks for intact protein analysis for top-down mass spectrometry.</a> Nature Methods. 16 (7), 587-594 (2019).</li><li>Gadgil, H. S., Pipes, G. D., Dillon, T. M., Treuheit, M. J., Bondarenko, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+mass+accuracy+of+high+performance+liquid+chromatography/electrospray+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry+of+intact+antibodies.">Improving mass accuracy of high performance liquid chromatography/electrospray ionization time-of-flight mass spectrometry of intact antibodies.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 17 (6), 867-872 (2006).</li><li>Beck, A., Sanglier-Cianf&#233;rani, S., Van Dorsselaer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosimilar,+biobetter,+and+next+generation+antibody+characterization+by+mass+spectrometry.">Biosimilar, biobetter, and next generation antibody characterization by mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 84 (11), 4637-4646 (2012).</li><li>Camperi, J., Goyon, A., Guillarme, D., Zhang, K., Stella, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-dimensional+LC-MS:+the+next+generation+characterization+of+antibody-based+therapeutics+by+unified+online+bottom-up,+middle-up+and+intact+approaches.">Multi-dimensional LC-MS: the next generation characterization of antibody-based therapeutics by unified online bottom-up, middle-up and intact approaches.</a> Analyst. 146 (3), 747-769 (2021).</li><li>Liu, H., May, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide+bond+structures+of+IgG+molecules.">Disulfide bond structures of IgG molecules.</a> mAbs. 4 (1), 17-23 (2012).</li><li>Jakes, C., F&#252;ssl, F., Zaborowska, I., Bones, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+analysis+of+biotherapeutics+using+protein+a+chromatography+coupled+to+orbitrap+mass+spectrometry.">Rapid analysis of biotherapeutics using protein a chromatography coupled to orbitrap mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 93 (40), 13505-13512 (2021).</li><li>Robotham, A. C., Kelly, J. F., Matte, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+1+-+LC-MS+characterization+of+antibody-based+therapeutics:+Recent+highlights+and+future+prospects.">Chapter 1 - LC-MS characterization of antibody-based therapeutics: Recent highlights and future prospects.</a> Approaches to the Purification, Analysis and Characterization of Antibody-Based Therapeutics. , 1-33 (2020).</li><li>Valeja, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unit+mass+baseline+resolution+for+an+intact+148+kDa+therapeutic+monoclonal+antibody+by+fourier+transform+ion+cyclotron+resonance+mass+spectrometry.">Unit mass baseline resolution for an intact 148 kDa therapeutic monoclonal antibody by fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 83 (22), 8391-8395 (2011).</li><li>Fornelli, L., Ayoub, D., Aizikov, K., Beck, A., Tsybin, Y. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Middle-down+analysis+of+monoclonal+antibodies+with+electron+transfer+dissociation+orbitrap+fourier+transform+mass+spectrometry.">Middle-down analysis of monoclonal antibodies with electron transfer dissociation orbitrap fourier transform mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 86 (6), 3005-3012 (2014).</li><li>Berglund, M., Wieser, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotopic+compositions+of+the+elements+2009+(IUPAC+Technical+Report).">Isotopic compositions of the elements 2009 (IUPAC Technical Report).</a> Pure and Applied Chemistry. 83 (2), 397-410 (2011).</li><li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ame2012+atomic+mass+evaluation.">The Ame2012 atomic mass evaluation.</a> Chinese Physics C. 36 (12), 1603-2014 (2012).</li><li>Peri, S., Steen, H., Pandey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPMAW--A+software+tool+for+analyzing+proteins+and+peptides.">GPMAW--A software tool for analyzing proteins and peptides.</a> Trends in Biochemical Sciences. 26 (11), 687-689 (2001).</li><li>Tipton, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+intact+protein+isoforms+by+mass+spectrometry.">Analysis of intact protein isoforms by mass spectrometry.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (29), 25451-25458 (2011).</li><li>De Leoz, M. L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=interlaboratory+study+on+glycosylation+analysis+of+monoclonal+antibodies:+Comparison+of+results+from+diverse+analytical+methods.">interlaboratory study on glycosylation analysis of monoclonal antibodies: Comparison of results from diverse analytical methods.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 19 (1), 11-30 (2020).</li><li>Cymer, F., Beck, H., Rohde, A., Reusch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+monoclonal+antibody+N-glycosylation+-+Structure,+function+and+therapeutic+potential.">Therapeutic monoclonal antibody N-glycosylation - Structure, function and therapeutic potential.</a> Biologicals. 52, 1-11 (2018).</li><li>Baker, P. R., Trinidad, J. C., Chalkley, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+site+localization+scoring+integrated+into+a+search+engine.">Modification site localization scoring integrated into a search engine.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 10 (7), (2011).</li><li>Chalkley, R. J., Clauser, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+site+localization+scoring:+Strategies+and+performance.">Modification site localization scoring: Strategies and performance.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 11 (5), 3-14 (2012).</li></ol>

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mAbScale fornisce un'interfaccia utente intuitiva con la flessibilità di modificare gli elementi costitutivi per i calcoli di massa ed elementari. Ci si aspetta che gli utenti abbiano una conoscenza di base della molecola bersaglio per utilizzare l'applicazione, derivare le masse corrette e interpretare i risultati. Ad esempio, il foglio di uscita di massa intatto o ridotto può essere travolgente a causa delle numerose file di masse intatte o ridotte, poiché il database predefinito dei glicani contiene 88 glicani lega...

Negli ultimi due decenni, la bioterapia si è evoluta fino a diventare un pilastro della moderna industria farmaceutica. La pandemia di SARS-CoV2 e altre condizioni potenzialmente letali hanno ulteriormente aumentato la necessità di uno sviluppo più rapido e più ampio di molecole biofarmaceutiche 1,2,3.
Il peso molecolare bioterapeutico è fondamentale per l'identificazione della molecola, in combinazione con altri saggi analitici. Le masse delle subunità intatte e ridotte sono utilizzate durante tutto il ciclo di vita della scoperta e dello sviluppo come parte delle strategie di controllo volte a mantenere la qualità, come descritto nel QTPP (Quality Target Product Profile)4.
Lo sviluppo analitico nell'industria biofarmaceutica si basa in larga misura sulle misurazioni di massa per l'analisi della massa intatta e la caratterizzazione profonda utilizzando la mappatura dei peptidi o il monitoraggio con il metodo multi-attributo (MAM). Al centro di queste tecniche che utilizzano le moderne piattaforme di spettrometria di massa (MS) c'è la capacità di fornire misurazioni di massa accurate ad alta risoluzione (HR/AM). La maggior parte degli strumenti HR/AM produce precisioni di massa nell'intervallo di 0,5-5 ppm, che scalano con l'intervallo di massa. La capacità di misurare con precisione le masse per le grandi molecole intatte consente l'identificazione rapida e sicura delle terapie a grandi molecole. Poiché la risoluzione isotopica non può essere raggiunta utilizzando le condizioni sperimentali tipiche per molecole di grandi dimensioni (>10 kDa), è necessario calcolare le masse medie per il confronto e l'identificazione 5,6.
Un tipico spettro di massa di proteine intatte o subunità rappresenta il profilo complessivo della proteoforma, che contiene informazioni composite sulle varie forme molecolari risultanti da modificazioni post-traduzionali (PTM) e da eventuali differenze di struttura primarie, come clip o varianti di sequenza. La natura relativamente semplice e ad alta produttività di queste misure le rende interessanti per la caratterizzazione e come controlli di monitoraggio in-process 7,8. L'analisi dei dati per questi esperimenti di solito richiede all'utente di definire lo spazio di ricerca per le forme molecolari (gamma di PTM o altre forme molecolari). Per le proteine glicosilate, questo spazio di ricerca è in gran parte guidato dall'eterogeneità dei glicoformi. Le combinazioni di più PTM, le configurazioni del legame disolfuro e altre variazioni lungo la struttura primaria rendono il calcolo di tutte le possibili forme molecolari un compito noioso. Pertanto, il calcolo manuale delle possibili forme molecolari è un processo che richiede tempo e risorse con un alto potenziale di errore umano.
Qui presentiamo uno strumento di calcolo della massa che è stato sviluppato considerando le caratteristiche più importanti delle molecole bioterapeutiche, come mAbs, bsAbs, ADC, ecc. Lo strumento consente di incorporare facilmente le variabili dello spazio di ricerca per il calcolo coerente delle masse e delle composizioni elementari. La natura modulare di questo strumento consentirà di svilupparlo ulteriormente e di applicarlo al calcolo della massa e alla corrispondenza della massa per altre modalità.
Il modulo GUI consente all'utente di specificare l'input per il calcolo della massa, come mostrato in Figura 1; In particolare, l'utente inserisce sequenze di amminoacidi di una sola lettera per catene di anticorpi leggeri e pesanti. Le modifiche comuni per la ciclizzazione N-terminale a catena pesante e il clipping della lisina con terminale C sono incluse come caselle di controllo. Inoltre, la formula chimica/composizione elementare può essere aggiunta/sottratta da queste catene proteiche attraverso la rispettiva casella di testo Chem Mod . Ciò consente all'utente la flessibilità di aggiungere una composizione elementare che include più modifiche post-traduzionali o un carico utile di piccole molecole nel caso di un ADC. Poiché la maggior parte degli anticorpi monoclonali terapeutici sono progettati per rimuovere i siti di glicosilazione nella catena leggera, la glicosilazione nella catena leggera è lasciata facoltativa e può essere specificata utilizzando una casella di controllo sulla GUI.
Una variante tipica dell'analisi della massa intatta per gli anticorpi è un'analisi di massa a subunità ridotte, in cui la catena leggera viene staccata dalla catena pesante riducendo i legami disolfuro intercatena. A seconda della forza dell'agente riducente utilizzato, i legami disolfuro intracatena possono essere scissi o meno. Gli utenti hanno la flessibilità di inserire il numero totale di legami disolfuro a seconda del sottotipo di IgG o nel caso di un ADC9 coniugato con cisteina.
L'applicazione calcola le masse in modo bottom-up, in cui le composizioni elementari vengono prima calcolate per le singole catene pesanti e catene leggere. Successivamente, la ciclizzazione N-terminale della catena pesante (HC) Lys-clipping viene presa in considerazione regolando le composizioni elementari calcolate. Eventuali modifiche chimiche specificate vengono quindi applicate alle catene pesanti e/o leggere. A seconda del tipo di analisi e dei modelli di legame disolfuro specificati dall'utente, il numero di idrogeni viene regolato per le due catene polipeptidiche. Le masse glicosilate HC e catene leggere (LC) (facoltative) vengono calcolate in base all'input dell'utente. Infine, vengono combinate più masse HC e LC e i numeri di legame disolfuro vengono aggiornati automaticamente per il calcolo della massa intatta.
Con molecole più grandi come le proteine intatte, le masse monoisotopiche non possono essere misurate a causa del difetto di massa additivo quando si utilizzano spettrometri di massa con il tipico potere risolutivo. Invece, le masse nominali o medie sono misurate o riportate 5,10,11,12,13. Le masse elementari medie possono variare in base alla fonte utilizzata per le masse curate14,15. Sebbene le differenze nelle masse elementari possano essere piccole, possono sommarsi a valori significativi per i calcoli del peso molecolare di grandi molecole. Le masse elementari medie utilizzate per impostazione predefinita nell'applicazione software sono mostrate nella Tabella supplementare 1. Per gli ambienti regolamentati come il campo della ricerca e sviluppo biofarmaceutico (R&S), è importante mantenere masse molecolari coerenti perché le variazioni delle masse possono implicare modifiche all'entità molecolare durante i depositi normativi. Per garantire la coerenza nell'uso delle masse elementari, un dizionario delle masse elementari è incluso nello strumento software come file di testo con valori separati da virgole (csv): Element_Mass.csv (Supplementary Coding File 1). Allo stesso modo, è incluso un elenco curato di composizioni di glicani tipicamente viste sugli anticorpi monoclonali: Glycan.csv (Supplementary Coding File 2). Entrambi i file vengono salvati nella stessa cartella di un'applicazione eseguibile e possono essere modificati dall'utente per utilizzare uno specifico elenco di masse elementari o una libreria di glicani.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65298/65298fig01.jpg"> Figura 1: Interfaccia GUI per l'applicazione mAbScale. Il modulo GUI consente all'utente di specificare l'input per il calcolo della massa. L'utente inserisce sequenze di amminoacidi di una sola lettera per le catene di anticorpi leggeri e pesanti. Le modifiche comuni per la ciclizzazione N-terminale a catena pesante e il clipping della lisina C-terminale sono incluse come caselle di controllo. Le formule chimiche/composizioni elementari possono essere aggiunte/sottratte tramite la rispettiva casella di testo Chem Mod . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65298/65298fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acquity UPLC system&#160;</td>
			<td>Waters Corp., Milford, MA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Modular system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody-drug conjugate (ADC)</td>
			<td>GlaxoSmithKline</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Proprietory molecule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEH 200 SEC column&#160;</td>
			<td>Waters Corp., Milford, MA</td>
			<td>176003904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bispecific mAb</td>
			<td>GlaxoSmithKline</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Proprietory molecule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Byos</td>
			<td>Protein Metrics, Cupertino, CA</td>
			<td>https://proteinmetrics.com/byos/ 
			Version 4.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GPMAW</td>
			<td>GPMAW</td>
			<td>http://www.gpmaw.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS grade water&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>W6-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mAb standard&#160;</td>
			<td>Waters Corp., Milford, MA</td>
			<td>186009125</td>
			<td>Waters Humanized mAb Mass Check Standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mAbScale</td>
			<td>GlaxoSmithKline</td>
			<td>Apache License, Version 2.0&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xevo G2 Q-TOF mass spectrometer</td>
			<td>Waters Corp., Milford, MA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Modular system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an open-source framework for mass calculation of antibody-based therapeutic molecules

Le masse bioterapeutiche sono un mezzo per verificare l'identità e l'integrità strutturale. La spettrometria di massa (MS) di proteine intatte o subunità proteiche fornisce un semplice strumento analitico per le diverse fasi dello sviluppo biofarmaceutico. L'identità della proteina è confermata quando la massa sperimentale della MS è all'interno di un intervallo di errore di massa predefinito della massa teorica. Sebbene esistano diversi strumenti computazionali per il calcolo dei pesi molecolari di proteine e peptidi, non sono stati progettati per l'applicazione diretta a entità bioterapeutiche, hanno limitazioni di accesso a causa di licenze a pagamento o richiedono il caricamento di sequenze proteiche su server host. 
Abbiamo sviluppato una routine modulare di calcolo della massa che consente di determinare facilmente le masse medie o monoisotopiche e le composizioni elementari delle glicoproteine terapeutiche, compresi gli anticorpi monoclonali (mAb), gli anticorpi bispecifici (bsAb) e i coniugati anticorpo-farmaco (ADC). La natura modulare di questo framework di calcolo basato su Python consentirà in futuro l'estensione di questa piattaforma ad altre modalità come vaccini, proteine di fusione e oligonucleotidi, e questo framework potrebbe anche essere utile per l'interrogazione di dati di spettrometria di massa top-down. Creando un'applicazione desktop autonoma open source con un'interfaccia utente grafica (GUI), speriamo di superare le restrizioni relative all'uso in ambienti in cui le informazioni proprietarie non possono essere caricate su strumenti basati sul Web. Questo articolo descrive gli algoritmi e l'applicazione di questo strumento, mAbScale, a diverse modalità terapeutiche basate su anticorpi.

Over the past two decades, biotherapeutics have evolved to become a mainstay of the modern pharmaceutical industry. The SARS-CoV2 pandemic and other life-threatening conditions have further increased the need for the faster and broader development of biopharmaceutical molecules1,2,3.
The biotherapeutic molecular weight is critical for the identification of the molecule, in combination with other analytical assays. The intact and reduced subunit masses are used throughout the discovery and development lifecycles as part of control strategies aimed at maintaining the quality, as described in the QTPP (Quality Target Product Profile)4.
Analytical development in the biopharmaceutical industry relies heavily on mass measurements for intact mass analysis and deep characterization using peptide mapping or multi-attribute method (MAM) monitoring. At the center of these techniques utilizing modern mass spectrometry (MS) platforms is the ability to provide high-resolution accurate mass (HR/AM) measurements. Most HR/AM instruments yield mass accuracies in the range of 0.5-5 ppm, which scale with the mass range. The ability to measure masses accurately for intact large molecules enables the quick and confident identification of large-molecule therapeutics. As isotopic resolution cannot be attained using typical experimental conditions for large molecules (&#62;10 kDa), average masses must be calculated for comparison and identification5,6.
A typical intact or subunit protein mass spectrum represents the overall proteoform profile, which contains composite information on the various molecular forms resulting from post-translational modifications (PTM) and any primary structure differences, such as clips or sequence variants. The relatively easy and high-throughput nature of these measurements make them attractive for characterization and as in-process monitoring controls7,8. Data analysis for these experiments usually requires the user to define the search space for molecular forms (range of PTMs or other molecular forms). For glycosylated proteins, this search space is largely driven by glycoform heterogeneity. Combinations of multiple PTMs, disulfide bond configurations, and other variations along the primary structure make calculating all the possible molecular forms a tedious task. Therefore, the manual calculation of the possible molecular forms is a time and resource-consuming process with a high potential for human error.
Here, we present a mass calculation tool that was developed considering the most important features of biotherapeutic molecules, such as mAbs, bsAbs, ADCs, etc. The tool allows the easy incorporation of search-space variables for the consistent calculation of masses and elemental compositions. The modular nature of this tool will enable it to be further developed and applied to mass calculation and mass matching for other modalities.
The GUI module allows the user to specify the input for the mass calculation, as shown in Figure 1; specifically, the user enters single-letter amino acid sequences for light and heavy antibody chains. Common modifications for heavy-chain N-terminal cyclization and C-terminal lysine clipping are included as check boxes. Further, the chemical formula/elemental composition can be added/subtracted from these protein chains through the respective Chem Mod text box. This allows the user the flexibility to add an elemental composition that includes multiple post-translational modifications or a small-molecule payload in the case of an ADC. As most therapeutic mAbs are engineered to remove the glycosylation sites in the light chain, glycosylation in the light chain is left optional and can be specified using a check box on the GUI.
A typical variation on intact mass analysis for antibodies is a reduced subunit mass analysis, where the light chain is detached from the heavy chain by reducing the interchain disulfide bonds. Depending on the strength of the reducing agent used, the intrachain disulfide bonds may or may not be cleaved. The users have the flexibility of entering the total number of disulfide bonds depending on the IgG subtype or in case of a cysteine-conjugated ADC9.
The application calculates masses in a bottom-up manner, in which the elemental compositions are first calculated for the individual heavy chains and light chains. Next, heavy chain (HC) N-terminal cyclization Lys-clipping is accounted for by adjusting the calculated elemental compositions. Any specified chemical modifications are then applied to the heavy and/or light chains. Depending on the type of analysis and the disulfide-bond patterns specified by the user, the number of hydrogens is adjusted for the two polypeptide chains. The glycosylated HC and light chain (LC) (optional) masses are calculated based on the user&#39;s input. Finally, multiple HC and LC masses are combined, and the disulfide bond numbers are automatically updated for the intact mass calculation.
With larger molecules such as intact proteins, monoisotopic masses cannot be measured due to the additive mass defect when using mass spectrometers with typical resolving power. Instead, nominal or average masses are measured or reported5,10,11,12,13. The average elemental masses can vary based on the source used for the curated masses14,15. While the differences in elemental masses may be small, they can add up to significant values for large-molecule molecular weight calculations. The average elemental masses used by default in the software application are shown in Supplementary Table 1. For regulated environments like the biopharmaceutical research and development (R&#38;D) field, it is important to maintain consistent molecular masses because changes in masses may imply changes to the molecular entity during regulatory filings. To enable consistency in the use of elemental masses, a dictionary of elemental masses is included with the software tool as a comma-separated value (csv) text file: Element_Mass.csv (Supplementary Coding File 1). Similarly, a curated list of glycan compositions typically seen on mAbs is included: Glycan.csv (Supplementary Coding File 2). Both files are saved in the same folder location as an executable application and can be modified by the user to use a specific elemental mass list or glycan library.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65298/65298fig01.jpg" /> 
Figure 1: GUI interface for the mAbScale application. The GUI module allows the user to specify the input for the mass calculation. The user enters single-letter amino acid sequences for the light and heavy antibody chains. Common modifications for the heavy-chain N-terminal cyclization and C-terminal lysine clipping are included as check boxes. Chemical formulas/elemental compositions can be added/subtracted through the respective Chem Mod text box. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65298/65298fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

Autore in primo piano: Avanzamento del calcolo della massa bioterapeutica con l'introduzione di mAbScale, un'applicazione desktop basata su Python

Un framework open-source per il calcolo della massa di molecole terapeutiche basate su anticorpi

The challenge with accurate mass calculation for large protein molecules is the mass defect associated with the measurement. As a result, only average masses can be measured. Minor elemental mass differences may accumulate causing significant discrepancies in large paratherapeutic molecules like monoclonal antibodies.Our tool explicitly addresses the challenge in the consistent mass calculation for antibody-based therapeutics, such as MAPs, bispecifics, and antibody drug conjugates. Researchers in the commercial biopharmaceutical development space have to rely on manual calculation or tools that don't depend on communication with external servers due to the involvement of proprietary information. Existing tools either require a license or are not built considering the specific needs of biopharmaceutical development.MapScale offers a user-friendly interface and adaptable open source framework for users and developers. It supports maintaining multiple versions of elemental masses and modification lists, and allows list sharing to maintain consistency in calculations. The code can be shared on an enterprise level using internal servers or cloud-based deployment with controlled access to protect proprietary information.

È stata selezionata una varietà di anticorpi monoclonali per rappresentare diversi tipi di anticorpi monoclonali. È stato selezionato uno standard di anticorpi monoclonali disponibile in commercio per rappresentare un anticorpo monoclonale convenzionale con catene pesanti identiche, catene leggere identiche e un sito di glicosilazione legato all'N nella regione Fc. Per ampliare l'utilizzo dell'applicazione sono stati scelti anche un anticorpo monoclonale con un'ulteriore glicosilazione legata all'azoto a catena legger...

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Questo articolo descrive l'uso di un'applicazione software, mAbScale, per il calcolo delle masse per terapie proteiche basate su anticorpi monoclonali.

Biotherapeutic masses are a means of verifying identity and structural integrity. Mass spectrometry (MS) of intact proteins or protein subunits provides ...

La sfida con il calcolo accurato della massa per le grandi molecole proteiche è il difetto di massa associato alla misurazione. Di conseguenza, è possibile misurare solo le masse medie. Piccole differenze di massa elementare possono accumularsi causando discrepanze significative in grandi molecole paraterapeutiche come gli anticorpi monoclonali.Il nostro strumento affronta in modo esplicito la sfida nel calcolo della massa coerente per le terapie a base di anticorpi, come MAP, bispecifici e coniugati farmaco-anticorpo. I ricercatori nello spazio di sviluppo biofarmaceutico commerciale devono fare affidamento su calcoli manuali o strumenti che non dipendono dalla comunicazione con server esterni a causa del coinvolgimento di informazioni proprietarie. Gli strumenti esistenti richiedono una licenza o non sono costruiti tenendo conto delle esigenze specifiche dello sviluppo biofarmaceutico.MapScale offre un'interfaccia user-friendly e un framework open source adattabile per utenti e sviluppatori. Supporta il mantenimento di più versioni delle masse elementari e degli elenchi di modifica e consente la condivisione degli elenchi per mantenere la coerenza nei calcoli. Il codice può essere condiviso a livello aziendale utilizzando server interni o distribuzione basata su cloud con accesso controllato per proteggere le informazioni proprietarie.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Open-Source Framework for Mass Calculation of Antibody-Based Therapeutic Molecules

1.2K Views.  GlaxoSmithKline. La sfida con il calcolo accurato della massa per le grandi molecole proteiche è il difetto di massa associato alla misurazione. Di conseguenza, è possibile misurare solo le masse medie. Piccole differenze di massa elementare possono accumularsi causando discrepanze significative in grandi molecole paraterapeutiche come gli anticorpi monoclonali.Il nostro strumento affronta in modo esplicito la sfida nel calcolo della massa coerente per le terapie a base di anticorpi, come MAP, bispec...

Video: Autore in primo piano: Avanzamento del calcolo della massa bioterapeutica con l'introduzione di mAbScale, un'applicazione desktop basata su Python

Biotherapeutic masses are a means of verifying identity and structural integrity. Mass spectrometry (MS) of intact proteins or protein subunits provides an easy analytical tool for different stages of biopharmaceutical development. The protein's identity is confirmed when the experimental mass from MS is within a pre-defined mass error range of the theoretical mass. While several computational tools exist for the calculation of protein and peptide molecular weights, they either were not designed for direct application to biotherapeutic entities, have access limitations due to paid licenses, or require uploading protein sequences to host servers. 
We have developed a modular mass calculation routine that enables the easy determination of the average or monoisotopic masses and elemental compositions of therapeutic glycoproteins, including monoclonal antibodies (mAb), bispecific antibodies (bsAb), and antibody-drug conjugates (ADC). The modular nature of this Python-based calculation framework will allow the extension of this platform to other modalities such as vaccines, fusion proteins, and oligonucleotides in the future, and this framework could also be useful for the interrogation of top-down mass spectrometry data. By creating an open-source standalone desktop application with a graphical user interface (GUI), we hope to overcome the restrictions around use in environments where proprietary information cannot be uploaded to web-based tools. This article describes the algorithms and application of this tool, mAbScale, to different antibody-based therapeutic modalities.

This article describes the use of a software application, mAbScale, for the calculation of masses for monoclonal antibody-based protein therapeutics.

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Running the mAbscale Application to Calculate the Masses of Monoclonal Antibody-Based Protein Therapeutics

To begin, open the software application by double clicking on the icon for an executable file. Enter the heavy chain and light chain sequences in the text boxes under the 1 column without any spaces. For bispecific antibodies, add additional heavy or light chains in the second set of text boxes under the 2 column.Leave these boxes blank for monoclonal antibodies with identical heavy chains and light chains. Check the end terminal cyclization and C terminal clipping check boxes if these heavy chain terminal variants are applicable. Add chemical modifications including linker and payload for antibody drug conjugates to the heavy and light chain chemical modification boxes using elemental compositions such as calcium chloride.These modifications will be added to the respective protein subunit or chain. Specify the number of disulfide bonds in the protein molecules in the text box marked total number of disulfides. Enter the number of unreduced heavy chain disulfide bonds into the unreduced heavy chain disulfides text box and the number of unreduced light chain disulfide bonds into the unreduced light chain disulfides text box depending on the extent of reduction.If glycosylation is present on the monoclonal antibodies light chain, check the light chain is glycosylated check box. Click on the Browse button to select an output folder for the output folder text box and enter the output file name without a file extension into the Excel file no extension text box. Then click on the Submit button.A mass calculation report created message will appear on the screen and the output file can be found in the user designated folder. The app will close automatically. The chemical compositions, calculated masses, measured masses and mass errors of various monoclonal antibodies are summarized in this table.A commercially available monoclonal antibody standard was selected to represent a conventional monoclonal antibody with identical heavy chains, identical light chains, and one N-linked glycosylation site in the FC region. A monoclonal antibody with an additional light chain N-linked glycosylation, a bispecific monoclonal antibody, and an antibody drug conjugate monoclonal antibody were also chosen to widen the application usage. The small mass errors between the calculated masses and measured masses were within the normal mass error acceptance criteria, suggesting that the calculated masses were accurate.