Gli anticorpi vengono regolarmente utilizzati nelle tecniche di laboratorio e le loro applicazioni terapeutiche e diagnostiche si stanno rapidamente espandendo. La caratterizzazione rapida e accurata del legame antigene-anticorpo è di fondamentale importanza per queste applicazioni. La fotometria di massa misura rapidamente le affinità di legame utilizzando quantità estremamente piccole di materiale.
Non è richiesta alcuna etichettatura o immobilizzazione e le informazioni sull'oligomerizzazione e la purezza delle proteine possono essere ottenute dallo stesso esperimento. Questo protocollo può essere utilizzato non solo per studiare gli anticorpi, ma anche per misurare forti legami proteina-proteina per proteine con una massa molecolare superiore a 50 kilodalton. Inizia usando le forcep a punta morbida e lava le bottiglie per risciacquare in sequenza le coverlips da 24 per 50 millimetri dall'alto verso il basso con acqua distillata, etanolo, acqua distillata, isopropanolo e acqua distillata.
Dopo l'ultimo lavaggio, asciugare i copricapo con un flusso di azoto pulito nella stessa direzione per evitare di trasferire la contaminazione dalle forcep. Risciacquare 24 per 24 millimetri di coverslips con acqua distillata ed etanolo come dimostrato, seguito dall'essiccazione con un flusso di azoto pulito. Dopo l'asciugatura, posizionare un coverslip di 24 per 24 millimetri su un pezzo di foglio di alluminio e posizionare strisce di nastro a doppia parte sul coverslip.
Quindi tagliare il coverslip da 24 per 24 millimetri dal foglio e premere delicatamente il foglio sul lato di lavoro del coverslip da 24 per 50 millimetri. Per preparare campioni anticorpo-antigene per le misurazioni dell'affinità, filtrare almeno due millilitri di PBS attraverso un filtro siringa da 0,22 micron per rimuovere particelle e aggregati di polvere e centrifugare le scorte di anticorpi e antigeni di interesse. Misurare l'assorbanza UV di 280 nanometri delle scorte di anticorpi e antigeni per determinarne le concentrazioni effettive e preparare una serie di miscela anticorpo-antigene all'intervallo appropriato di concentrazioni di antigene in un volume finale di 50 microlitri per campione.
Quindi incubare le miscele antigene-anticorpo per circa 10 minuti a temperatura ambiente per consentire alla reazione di legame di raggiungere l'equilibrio chimico. Per valutare l'affinità anticorpo-antigene mediante fotometria di massa, applicare una goccia di olio ad immersione al microscopio all'obiettivo dello strumento e posizionare la camera di flusso sullo stadio del microscopio. Aggiungere 10 microlitri di PBS filtrato a un'estremità del canale della camera di flusso.
Il buffer entrerà nel canale per azione capillare. Nella scheda di controllo dello stato attivo del software di raccolta dati, utilizzare i pulsanti di movimento grossolano dello stadio su e giù per effettuare le regolazioni iniziali e fare clic sulla nitidezza per visualizzare la lettura del segnale di nitidezza. Utilizzare i pulsanti di regolazione fine su e giù per massimizzare il valore di nitidezza e fare clic su imposta messa a fuoco e blocca messa a fuoco per attivare la funzione di tracciamento dello stato attivo.
L'immagine di una diapositiva pulita deve avere un valore di segnale pari o inferiore allo 0,05%Caricare 20 microlitri del primo campione anticorpo-antigene come dimostrato, gonfiando il liquido dall'altra estremità con un piccolo pezzo di carta assorbente. Immediatamente dopo il caricamento, fare clic su record per acquisire il numero appropriato di frame equivalenti a 100 secondi di dati. Alla fine del periodo di raccolta dati immettere un nome di file per i dati e fare clic su OK, quindi eseguire l'esempio per salvare il file.
Per analizzare i dati della fotometria di massa, aprire il file di interesse e fare clic su analizza. Fare clic su carica per caricare la funzione di calibrazione e fare clic sul file e salvare i risultati come per salvare i dati analizzati. Per ottenere le concentrazioni relative di ciascuna specie nel campione, aprire gli eventi idonei.
csv, copiare i dati nella colonna M nel software di plottaggio e analisi appropriato e utilizzare la funzione istogramma delle statistiche del grafico per tracciare la distribuzione della massa molecolare. Fare doppio clic sull'istogramma per aprire la finestra delle proprietà del tracciato, disattivare l'binning automatico e selezionare una dimensione del contenitore di 2,5 kilodalton. Per creare i centri collocazione e contare i dati, fare clic su applica e vai.
Per adattare l'istogramma alle funzioni gaussiane, selezionate i centri collocazione e le colonne di conteggio e fate clic sui picchi di analisi e sulla funzione di menu di adattamento multiplo di picco previsto. Fate doppio clic per indicare le posizioni di picco approssimative nel grafico di distribuzione e fate clic su Apri adattamento NL (Open NL fit). Controllare le caselle di controllo fisse per i centri di picco XC e impostare i loro valori sulle masse molecolari previste dell'anticorpo libero e dei complessi antigene-anticorpo singoli e doppi.
Controllare l'opzione di condivisione per i parametri di larghezza e fare clic su adatta. I valori di altezza di picco montati dei componenti gaussiani rappresentano la concentrazione relativa di ciascuna specie nel campione. Quindi usa l'equazione per calcolare la frazione di concentrazione di ogni specie dai valori dell'altezza di picco.
Per calcolare le costanti di equilibrio utilizzando un programma foglio di calcolo, aprire il calcolo della dissociazione costante. foglio di lavoro xlsx. In questo foglio di lavoro, i valori delle celle evidenziate in giallo nelle righe da 1 a 10 possono essere modificati per eseguire i calcoli delle costanti di equilibrio.
Immettere i valori costanti di dissociazione stimati nelle unità nanomolari nelle celle B1 e B2. Se i valori costanti di dissociazione stimati non sono noti, lasciare invariati i valori predefiniti nelle celle B1 e B2. Immettere l'anticorpo totale e le concentrazioni totali di antigeni nelle unità nanomolari nelle cellule D2 ed E2 e immettere i valori di frazione calcolati per ogni specie nelle cellule F2, G2 e H2. Quando si esegue un'analisi globale della titolazione, aggiungere i valori appropriati della frazione di dati nelle righe da 2 a 10. Nella finestra parametri risolutore selezionare la cella B15 per la casella obiettivo impostata e le celle da B1 a B2 per la casella modificando celle variabili.
Selezionare il pulsante min per l'opzione a e selezionare la casella di controllo rendi non negative le variabili non vincolate, quindi selezionare GRG non lineare come metodo di risoluzione e fare clic su risolvi. I valori costanti di dissociazione più adatti saranno mostrati nelle celle B1 e B2. E la somma finale degli errori al quadrato verrà mostrata nella cella B15. In questo esperimento rappresentativo, una serie di titolazione con l'anticorpo anti-umano trombina ad una concentrazione fissa di 25 nanomolare e 0, 7,5, 15, 30, 60 e 120 concentrazioni di alfa-trombina umana nanomolare sono state eseguite per ottenere le distribuzioni di massa molecolare delle miscele antigene-anticorpo e del campione solo anticorpale.
I parametri di altezza di picco più adatti dei componenti gaussiani sono stati normalizzati per ottenere frazioni di concentrazione delle specie. I valori della frazione di concentrazione sono stati quindi idonei a livello globale per ottenere le affinità di legame antigene-anticorpo. Le frazioni sperimentali di concentrazione e i risultati di adattamento globale per l'anticorpo libero, il singolo complesso antigene-anticorpo e il doppio complesso di antigeni potrebbero quindi essere tracciati.
Per ottenere valori KD accurati, le concentrazioni proteiche devono essere accuratamente selezionate per popolare tutte le specie di reazione. Si consiglia di preparare una serie di titolazione utilizzando una gamma di concentrazioni di antigeni. Dopo aver raccordo i dati, il metodo di proiezione degli errori può essere utilizzato per ottenere l'errore di raccordo, ma è meglio ripetere l'esperimento e calcolare le deviazioni standard dei valori medi di affinità di associazione.
