Questo lavoro è stato sostenuto dall'Istituto di Biologia Molecolare, dall'Academia Sinica e dal Consiglio Nazionale per la Scienza e la Tecnologia di Taiwan. L'officina meccanica dell'Istituto di Fisica dell'Academia Sinica ha contribuito alla fabbricazione di parti progettate su misura. Vogliamo anche ringraziare P. Argast (Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research, Basilea, Svizzera) per la progettazione del meccanismo di bloccaggio rapido dello stadio di testa.

Tutte le procedure sugli animali sono state approvate ed eseguite in conformità con le linee guida del Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Academia Sinica. I dettagli degli strumenti di ricerca sono disponibili nella Tabella dei materiali.
1. Preparazione della camera di registrazione
<ol><li>Preparare un serbatoio semiesagonale, una piastra di base e uno stadio di testa (Figura 1A; Fascicoli supplementari 1-3). Lo stadio di testa è costituito da due pali metallici fissati a una piastra circolare. La piastra circolare contiene scanalature che possono essere bloccate sulla piastra di base. Dopo essere stati bloccati insieme, lo stadio di testa e la piastra di base vengono posati sul fondo del serbatoio semiesagonale.</li>
	<li>Posizionare il serbatoio semiesagonale sulla piattaforma sperimentale del microscopio. La piattaforma dovrebbe essere in grado di muoversi nelle direzioni X e Y senza raggiungere il limite della fase di traslazione.</li>
	<li>Puntare la luce a infrarossi (IR) da 810 nm e la telecamera sul tavolino principale per la registrazione comportamentale. Assicurarsi che il campo visivo della fotocamera sia sufficientemente ampio da contenere un pesce zebra adulto.<ol><li>Per evitare che il laser a due fotoni e lo stimolo visivo interferiscano con la registrazione comportamentale, impostare rispettivamente un filtro passa-corto da 875 nm e un filtro passa-lungo da 700 nm davanti alla telecamera.</li>
	</ol></li>
	<li>Per presentare lo stimolo visivo, fissare delle pellicole di retroproiezione sul lato interno delle tre pareti del serbatoio semiesagonale (Figura 1A).</li>
	<li>Puntare i tre proiettori verso le tre superfici del serbatoio. Le tre immagini devono essere allineate per formare una scena visiva continua. Per evitare che le luci del proiettore contaminino il segnale di fluorescenza del calcio, posizionare un filtro a densità neutra e un filtro di colore rosso (600 nm, passa-lungo) davanti a ciascun proiettore e posizionare un filtro passa-banda (510/80 nm) davanti al tubo fotomoltiplicatore (PMT).</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65526/65526fig1v8.jpg"> Figura 1: Strumenti necessari per l'intervento chirurgico del poggiatesta. (A) Il meccanismo di bloccaggio rapido tra la piastra circolare del tavolino di testa e la piastra di base all'interno del serbatoio semiesagonale. I file CAD (Computer-Aided Design) delle parti personalizzate sono disponibili nei file supplementari 1-4. (B) Poggiatesta a forma di Ω per il poggiatesta. (C) Il micromanipolatore a tre assi utilizzato per posizionare la barra di testa sul sito di attacco. Riquadro: orientamento della barra di testa nell'argilla. (D) Cannone per trattenere il pesce durante l'intervento chirurgico. Riquadro: orientamento dei pesci all'interno del cannone. (E) Modulo di caricamento del pesce e micromanipolatore utilizzato per caricare il pesce sul palco di testa. Riquadro: orientamento dei pesci all'interno del modulo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65526/65526fig1v8large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
2. Chirurgia del poggiatesta
<ol><li>Preparare una barra per la testa a forma di Ω (Figura 1B; Fascicolo supplementare 4) per il poggiatesta zebrafish. Per fare ciò, attacca un pezzo di argilla da modellare a base di olio a un micromanipolatore a tre assi. Assicurarsi che l'argilla sia abbastanza solida da sostenere la barra per la testa, ma abbastanza morbida da staccarsi dalla barra per la testa dopo il poggiatesta.</li>
	<li>Inserire un braccio della barra di testa nell'argilla e orientare la barra di testa orizzontalmente (Figura 1C). Ciò garantirà che il successivo fissaggio della barra di testa sul pesce zebra sarà livellato. NOTA: La barra di testa può essere realizzata in titanio (24 mg) o acciaio inossidabile (43 mg) e può essere riutilizzata per più esperimenti. Il materiale della barra per la testa non influisce sul comportamento del pesce zebra adulto (il peso varia da 300 a 1.000 mg) sotto un poggiatesta.</li>
	<li>Preparare il cannone, un tubo cavo per tenere in posizione il corpo del pesce durante l'intervento chirurgico (Figura 1D).</li>
	<li>Preparare lo 0,03% e lo 0,01% di metansolfonato di tricaina (TMS; vedere la tabella dei materiali) nell'acqua dell'acquario. Questo verrà utilizzato per anestetizzare e mantenere il pesce in uno stato sedato durante l'intervento chirurgico.</li>
	<li>Preparare quattro tamponi di tessuto per rimuovere la pelle e l'acqua in eccesso dai siti di attacco sul cranio. Per preparare ogni tampone, taglia un tovagliolo di carta in un quadrato di 3 cm e piegalo lungo la sua diagonale per produrre una struttura simile a un tubo. Attorcigliare le estremità del tubo in una punta sottile. Il sito di attacco è molto piccolo, quindi una punta fine consente un controllo più preciso del tampone.</li>
	<li>Preparare un modulo di caricamento del pesce per il micromanipolatore (Figura 1E). NOTA: Il modulo è costituito da due pali in acciaio tenuti insieme da un morsetto per palo ad angolo retto. Un palo si attacca al micromanipolatore, mentre l'altro palo contiene un morsetto rotante che trasporta il pesce. Il modulo viene utilizzato per posizionare il pesce sul palco di testa con un controllo fine. Il morsetto rotante funge da regolatore del passo per modificare l'angolo di beccheggio del pesce.</li>
	<li>Anestetizzare il pesce con lo 0,03% di TMS nell'acqua dell'acquario. Durante i passaggi seguenti, utilizzare una siringa per erogare lo 0,01% di TMS nell'acqua dell'acquario alla bocca con brevi impulsi ogni 90 secondi. Il flusso d'acqua dalla perfusione dovrebbe indurre il movimento branchiale. Ciò consentirà al pesce di sopravvivere per più di 40 minuti durante l'intervento chirurgico. NOTA: Tg[neuroD:GCaMP6f] viene utilizzato a causa della sua ampia espressione dell'indicatore di calcio nel prosencefalo sia allo stadio larvale che adulto10. NOTA: Facoltativamente, utilizzare la perfusione gravitazionale per fornire un flusso d'acqua costante alla bocca durante i periodi dell'intervento chirurgico in cui entrambe le mani sono occupate.</li>
	<li>Avvolgere il pesce in una capsula (Figura 2A) che trattiene il pesce all'interno del cannone.<ol><li>Avvolgere il pesce anestetizzato in un pezzo di carta velina umida partendo dalla punta della coda fino a circa 1 mm caudale fino alla branchia. Assicurarsi che l'involucro sia ben stretto per evitare che il pesce scivoli fuori dal tessuto.</li>
		<li>Avvolgere un tubo di plastica morbida con una fessura longitudinale (ad esempio, una guaina termorestringente di medie dimensioni tagliata aperta) attorno al fazzoletto di carta per coprire il pesce dall'estremità della coda fino a circa 2 mm caudalmente fino alla branchia. Il tubo assicura che il corpo del pesce rimanga dritto per tutta la durata dell'intervento.</li>
		<li>Avvolgi un tovagliolo di carta attorno al tubo a un diametro approssimativamente simile al diametro del cannone.</li>
		<li>Avvolgere un tubo di plastica morbida tagliato dal bulbo di una pipetta di trasferimento di plastica attorno al tovagliolo di carta. Ciò garantisce che la capsula possa essere caricata senza problemi nel cannone.</li>
		<li>Carica il pesce nel cannone.</li>
	</ol></li>
	<li>Utilizzare un bisturi per rimuovere la pelle che copre i siti di attacco, due aree triangolari del cranio rostrolaterali al cervelletto e sopra le branchie (Figura 2B), quindi rimuovere la pelle che copre la regione tra i siti di attacco. Utilizzare tamponi di tessuto per asciugare i siti di attacco e rimuovere la pelle rimanente.<ol><li>Utilizzare una piattaforma regolabile per sostenere la testa durante la rimozione della pelle, ma la piattaforma non deve entrare in contatto con gli occhi per evitare lesioni agli occhi durante l'operazione. NOTA: La rimozione accurata della pelle nei siti di attacco è fondamentale per ridurre gli artefatti da movimento durante l'imaging.</li>
	</ol></li>
	<li>Applicare una goccia di colla per tessuti (vedere la tabella dei materiali) al centro di ciascun sito di attacco utilizzando un puntale per pipette da 10 μL. NOTA: La colla per tessuti copre i siti di fissaggio e si asciuga rapidamente. La colla tissutale fornisce un'interfaccia di legame tra il cranio e il cemento dentale utilizzato per incollare la barra della testa e impedisce all'acqua delle branchie di raggiungere il sito di attacco.</li>
	<li>Mettere il corpo del pesce in posizione verticale e posizionare la barra di testa leggermente al di sopra e caudale rispetto ai siti di attacco in preparazione per l'incollaggio della barra di testa.</li>
	<li>Preparare il cemento dentale (vedere la tabella dei materiali) e utilizzarlo immediatamente per incollare la barra della testa al cranio (Figura 2C). La procedura è urgente e deve essere eseguita entro 45 s.<ol><li>Mescolare un cucchiaino di polimero con quattro gocce di monomero rapido e una goccia di catalizzatore V. Mescolare uniformemente la miscela per 15 s.</li>
		<li>Utilizzare una micropipetta e un puntale da 10 μL per applicare la miscela sui siti di attacco e sulla regione tra i siti. Evitare di coprire le branchie e gli occhi.</li>
		<li>Premere delicatamente la barra di testa sul cemento utilizzando il micromanipolatore. Coprire la barra di testa con il cemento rimanente.</li>
		<li>Attendere 12 minuti per consentire l'indurimento del cemento dentale. Evitare il contatto dell'acqua con il cemento.</li>
	</ol></li>
	<li>Per migliorare l'accesso ottico al prosencefalo per l'imaging del calcio, rimuovere la pelle sopra il telencefalo. La rimozione della pelle può essere eseguita in 3 minuti con cinque tagli utilizzando un bisturi (Figura 2D). Assicurarsi che le goccioline lipidiche che aderiscono alla superficie dei crani vengano rimosse.</li>
	<li>Dopo l'indurimento, rimuovere l'argilla dalla barra di testa.</li>
	<li>Trasferire l'intera capsula dal cannone al regolatore di beccheggio nel modulo di caricamento del pesce del micromanipolatore.</li>
	<li>Usa il micromanipolatore per posizionare il pesce. La barra di testa deve essere posizionata sopra i montanti metallici del palco di testa. Aumentare leggermente l'angolo di beccheggio del pesce in modo che la superficie del prosencefalo possa essere meglio allineata al piano ottico durante l'imaging a due fotoni.</li>
	<li>Incolla la barra di testa ai montanti metallici con colla polimerizzabile a raggi ultravioletti (UV). Un'esposizione ai raggi UV di 15 s è sufficiente per l'indurimento.</li>
	<li>Estrarre il pesce dalla capsula e bloccare lo stadio di testa sulla piastra di base all'interno della vasca semiesagonale.</li>
	<li>Immergi l'animale nell'acqua dell'acquario. Il pesce dovrebbe iniziare a respirare e riprendersi dall'anestesia entro 1-2 minuti. NOTA: Facoltativamente, utilizzare la perfusione della siringa per erogare acqua fresca alla bocca.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65526/65526fig02.jpg"> Figura 2: Passaggi chiave durante l'intervento chirurgico di poggiatesta . (A) Composizione della capsula all'interno del cannone. (B) Siti di attacco sul cranio (rosso). Le frecce rosse specificano i siti dei vasi sanguigni. (C) In alto: barra della testa attaccata al teschio del pesce. Fondo: pesce caricato sul palco di testa. (D) Tagli necessari per rimuovere la pelle sopra il prosencefalo. I numeri indicano la sequenza di taglio. Evitare la rimozione della pelle nel sito contrassegnato (punta di freccia) per evitare il sanguinamento dell'animale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65526/65526fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
3. Imaging a due fotoni
<ol><li>Accendere il laser e attendere 30 minuti affinché l'alimentazione si stabilizzi. Impostare la lunghezza d'onda a 920 nm e la potenza a circa 50 mW sul campione. NOTA: Il raggio laser controllato dallo scanner risonante si muove lentamente nei punti di inversione del percorso di scansione. Per prevenire danni ai tessuti, viene utilizzata una cella di Pockels per ridurre la potenza del laser nei punti di turnaround.</li>
	<li>Posizionare la camera di registrazione contenente il pesce zebra trattenuto dalla testa sulla piattaforma sperimentale (Figura 3A). La piattaforma dovrebbe essere in grado di muoversi nelle direzioni X e Y senza raggiungere il limite della fase di traslazione.</li>
	<li>Posizionare la lente dell'obiettivo il più vicino possibile alla superficie del prosencefalo. La lente dell'obiettivo deve essere puntata verso il bordo anteriore della pupilla (Figura 3B).</li>
	<li>Aprire l'otturatore laser e abilitare il PMT. Sollevare gradualmente la lente dell'obiettivo (~1 mm) fino a rivelare il prosencefalo dorsale nell'immagine a fluorescenza (Figura 3C).</li>
	<li>Per aumentare il numero di neuroni registrati, utilizzare un attuatore piezoelettrico per acquisire immagini a più profondità (sei piani dell'immagine, a 15 μm di distanza). Ciò aumenterà la resa dei dati a scapito della frequenza dei fotogrammi. Abilita la scansione rapida dell'asse Z per controllare l'attuatore piezoelettrico (modalità uniforme, numero di fette = 6, dimensione del passo = 15 μm, forma d'onda = dente di sega, tempo di flyback = 4 ms, ritardo dell'attuatore = 8 ms).</li>
	<li>Per la registrazione del comportamento, accendere le luci a infrarossi (IR) da 810 nm su entrambi i lati del serbatoio. Regolare l'angolazione per illuminare l'intero corpo, che dovrebbe essere chiaramente visibile nella fotocamera.</li>
	<li>Accendere i proiettori.</li>
	<li>Avviare la registrazione dei dati.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65526/65526fig3v2.jpg"> Figura 3: Configurazione per eseguire l'imaging del calcio, la registrazione del comportamento e la visualizzazione dello stimolo visivo. (A) Tre proiettori presentano uno stimolo visivo sulle pareti della vasca semiesagonale. Le luci IR laterali vengono utilizzate per illuminare il corpo del pesce zebra. (B) Posizionamento della lente dell'obiettivo. A sinistra: vista frontale. A destra: vista laterale. La distanza tra l'obiettivo 16x e la regione cerebrale bersaglio è di circa 2,5 mm. (C) Esempio di immagine a due fotoni. A sinistra: massima proiezione dell'intero prosencefalo dorsale in Tg[neuroD:GCaMP6f]. A destra: immagine ingrandita per rivelare i neuroni in più regioni del cervello. Riquadro: un ingrandimento maggiore da una diversa regione del cervello. Le immagini sono medie di 10 s di dati registrati a 5Hz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65526/65526fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Monitoraggio del comportamento e modello di attività neurale nel proencefalo del pesce zebra

<ol>
	<li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+in+neurons.">Imaging calcium in neurons.</a> Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).</li><li>Chow, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+three-photon+imaging+of+the+brain+in+intact+adult+zebrafish.">Deep three-photon imaging of the brain in intact adult zebrafish.</a> Nature Methods. 17 (6), 605-608 (2020).</li><li>Mittmann, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+calcium+imaging+of+evoked+activity+from+L5+somatosensory+neurons+in+vivo.">Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo.</a> Nature Neuroscience. 14 (8), 1089-1093 (2011).</li><li>Friedrich, R. W., Jacobson, G. A., Zhu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circuit+neuroscience+in+zebrafish.">Circuit neuroscience in zebrafish.</a> Current Biology. 20 (8), R371-R381 (2010).</li><li>Kappel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+recognition+of+social+signals+by+a+tectothalamic+neural+circuit.">Visual recognition of social signals by a tectothalamic neural circuit.</a> Nature. 608 (7921), 146-152 (2022).</li><li>Bartoszek, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ongoing+habenular+activity+is+driven+by+forebrain+networks+and+modulated+by+olfactory+stimuli.">Ongoing habenular activity is driven by forebrain networks and modulated by olfactory stimuli.</a> Current Biology. 31 (17), 3861-3874 (2021).</li><li>Valente, A., Huang, K. H., Portugues, R., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+of+classical+and+operant+learning+behaviors+in+zebrafish.">Ontogeny of classical and operant learning behaviors in zebrafish.</a> Learning &amp; Memory. 19 (4), 170-177 (2012).</li><li>Buske, C., Gerlai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+shoaling+behavior+is+accompanied+by+changes+in+the+dopaminergic+and+serotoninergic+systems+in+zebrafish.">Maturation of shoaling behavior is accompanied by changes in the dopaminergic and serotoninergic systems in zebrafish.</a> Developmental Psychobiology. 54 (1), 28-35 (2012).</li><li>Huang, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+virtual+reality+system+to+analyze+neural+activity+and+behavior+in+adult+zebrafish.">A virtual reality system to analyze neural activity and behavior in adult zebrafish.</a> Nature Methods. 17 (3), 343-351 (2020).</li><li>Rupprecht, P., Prendergast, A., Wyart, C., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+z-scanning+with+a+macroscopic+voice+coil+motor+for+fast+3D+multiphoton+laser+scanning+microscopy.">Remote z-scanning with a macroscopic voice coil motor for fast 3D multiphoton laser scanning microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 7 (5), 1656-1671 (2016).</li><li>Papadopoulos, I. N., Jouhanneau, J. -. S., Poulet, J. F. A., Judkewitz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scattering+compensation+by+focus+scanning+holographic+aberration+probing+(F-SHARP).">Scattering compensation by focus scanning holographic aberration probing (F-SHARP).</a> Nature Photonics. 11 (2), 116-123 (2017).</li><li>Torigoe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+capable+of+generating+future+state+prediction+error+show+improved+active+avoidance+behavior+in+virtual+reality.">Zebrafish capable of generating future state prediction error show improved active avoidance behavior in virtual reality.</a> Nature Communications. 12 (1), 5712 (2021).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per trattenere la testa del pesce zebra adulto per l'imaging del calcio a due fotoni. Ci sono due passaggi critici per ottenere un poggiatesta sufficientemente stabile per l'imaging a scansione laser. Innanzitutto, la barra della testa deve essere incollata ai siti di attacco specifici dei teschi. Altre parti del cranio sono spesso troppo sottili per fornire stabilità meccanica e possono anche essere fratturate durante i forti movimenti del corpo. In secondo luogo, la pelle sop...

L'imaging a fluorescenza del calcio con indicatori geneticamente codificati o coloranti sintetici è stato un potente metodo per misurare l'attività neuronale negli animali comportamentali, inclusi primati non umani, roditori, uccelli einsetti. L'attività di centinaia di cellule, fino a circa 800 μm sotto la superficie cerebrale, può essere misurata simultaneamente utilizzando l'imaging multi-fotone 2,3. L'attività di specifici tipi cellulari può anche essere misurata esprimendo indicatori di calcio in popolazioni neuronali geneticamente definite. L'applicazione del metodo di imaging per modelli di piccoli vertebrati apre nuove possibilità nel campo del calcolo neuronale in tutte le regioni del cervello.
I pesci zebra sono un sistema modello ampiamente utilizzato nella ricerca neuroscientifica. Le larve di pesce zebra a circa 6 giorni dopo la fecondazione sono state utilizzate per l'imaging del calcio a causa del loro cervello in miniatura e del corpo trasparente4. I giovani pesci zebra (3-4 settimane di vita) sono utilizzati anche per studiare i meccanismi neurali alla base delle vie sensomotorie 5,6. Tuttavia, il livello massimo di prestazione per i comportamenti complessi, compreso l'apprendimento associativo e i comportamenti sociali, viene raggiunto a un'età più avanzatadi 7,8 anni. Pertanto, è necessario un protocollo affidabile per studiare molteplici funzioni cognitive nel cervello del pesce zebra adulto utilizzando metodi di imaging. Mentre la larva di zebrafish e il pesce zebra giovane possono essere incorporati nell'agarosio per l'imaging in vivo, il pesce zebra adulto di 2 mesi o più soffre di ipossia in tali condizioni e sono fisicamente troppo forti per essere trattenuti dall'agarosio. Pertanto, è necessaria una procedura chirurgica per stabilizzare il cervello e consentire all'animale di respirare liberamente attraverso le branchie.
Qui, descriviamo un protocollo di poggiatesta che prevede un nuovo design di una singola barra per la testa. Il tempo di intervento ridotto di 25 minuti è due volte più veloce rispetto al metodoprecedente 9. Descriviamo anche il design della camera di registrazione (serbatoio semi-esagonale), lo stadio di testa e un meccanismo di bloccaggio rapido per combinare le due parti9. Infine, viene anche descritta la configurazione per presentare uno stimolo visivo immersivo per studiare l'attività cerebrale e i comportamenti attivati visivamente. Nel complesso, le procedure qui descritte possono essere utilizzate per eseguire l'imaging del calcio a due fotoni in popolazioni cellulari geneticamente definite in un pesce zebra adulto con la testa trattenuta, consentendo lo studio delle attività cerebrali durante vari paradigmi comportamentali.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acquisition card</td>
			<td>MBF Bioscience</td>
			<td>Vidrio vDAQ</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Back-projection film</td>
			<td>Kimoto</td>
			<td>Diland screen - GSK</td>
			<td>present visual stimulus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band-pass filter (510/80 nm)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET510/80m</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Base plate for the semi-hexagonal tank</td>
			<td>custom made</td>
			<td>see supplemental files</td>
			<td>recording chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera filter (&#60;875 nm)</td>
			<td>Edmund optics</td>
			<td>#86-106</td>
			<td>Behavior recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera filter (&#62;700 nm)</td>
			<td>Edmund optics</td>
			<td>#43-949</td>
			<td>Behavior recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MVL50M23</td>
			<td>Behavior recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chameleon Vision-S</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Vision-S</td>
			<td>Laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular plate for the head stage</td>
			<td>custom made</td>
			<td>see supplemental files</td>
			<td>recording chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controller for piezo actuator</td>
			<td>Physik Instrumente&#160;</td>
			<td>E-665. CR</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Current amplifier</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TIA60</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elitedent Q-6</td>
			<td>Rolence Enterprise</td>
			<td>Q-6</td>
			<td>Surgery: UV lamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission Filter 510/80 nm</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET510/80m</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head bar</td>
			<td>custom made</td>
			<td>see supplemental files</td>
			<td>recording chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared light</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>M810L3</td>
			<td>Behavior recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED projector</td>
			<td>AAXA</td>
			<td>P2B LED Pico Projector</td>
			<td>present visual stimulus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moist paper tissue (Kimwipe)</td>
			<td>Kimtech Science</td>
			<td>34155</td>
			<td>Surgery: moist paper tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized XY sample stage</td>
			<td>Zaber</td>
			<td>X-LRM050</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Density Filters (50% Transmission)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>NE203B</td>
			<td>present visual stimulus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#216;1/2&#34; Post Holder</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>PH1.5V</td>
			<td>Surgery: hollow tube for cannon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#216;1/2&#34; Stainless Steel Optical Post</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>TR150/M</td>
			<td>Surgery: fish loading module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens 16x, 0.8NA</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CF175</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil-based modeling clay</td>
			<td>Ly Hsin Clay</td>
			<td>C4086</td>
			<td>Surgery: head bar holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical adhesive</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>NOA68</td>
			<td>Surgery: UV curable glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomultiplier tube</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>H11706P-40</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezo actuator</td>
			<td>Physik Instrumente&#160;</td>
			<td>P-725.4CA PIFOC</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pockels Cell</td>
			<td>Conoptics</td>
			<td>M350-80-LA-BK-02</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Wratten filter (&#62; 600 nm)</td>
			<td>Edmund optics</td>
			<td>#53-699</td>
			<td>present visual stimulus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resonant-Galvo Scan System</td>
			<td>INSS</td>
			<td>RGE-02</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right-Angle Clamp for &#216;1/2&#34; Post</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>RA90/M</td>
			<td>Surgery: fish loading module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating Clamp for &#216;1/2&#34; Post</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>SWC/M</td>
			<td>Surgery: fish loading module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScanImage</td>
			<td>MBF Bioscience</td>
			<td>Basic version</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-hexagonal tank</td>
			<td>custom made</td>
			<td>see supplemental files</td>
			<td>recording chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super-Bond C&#38;B Kit</td>
			<td>Sun Medical Co.</td>
			<td>Super-Bond C&#38;B</td>
			<td>Surgery: dental cement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>Surgery: anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB Camera</td>
			<td>FLIR</td>
			<td>BFS-U3-13Y3M-C</td>
			<td>Behavior recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td>Surgery: tissue glue</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-photon calcium imaging of forebrain activity in behaving adult zebrafish

Il pesce zebra adulto (Danio rerio) mostra un ricco repertorio di comportamenti per lo studio delle funzioni cognitive. Hanno anche un cervello in miniatura che può essere utilizzato per misurare le attività nelle regioni del cervello attraverso metodi di imaging ottico. Tuttavia, i rapporti sulla registrazione dell'attività cerebrale nel comportamento del pesce zebra adulto sono stati scarsi. Il presente studio descrive le procedure per eseguire l'imaging del calcio a due fotoni nel prosencefalo dorsale di zebrafish adulti. Ci concentriamo sulle misure per impedire al pesce zebra adulto di muovere la testa, il che fornisce stabilità che consente la scansione laser dell'attività cerebrale. Gli animali con la testa trattenuta possono muovere liberamente le parti del corpo e respirare senza aiuti. La procedura mira a ridurre i tempi dell'intervento chirurgico di poggiatesta, ridurre al minimo il movimento cerebrale e massimizzare il numero di neuroni registrati. Qui viene descritta anche una configurazione per presentare un ambiente visivo immersivo durante l'imaging del calcio, che può essere utilizzata per studiare i correlati neurali alla base dei comportamenti attivati visivamente.

Calcium fluorescence imaging with genetically encoded indicators or synthetic dyes has been a powerful method of measuring neuronal activity in behaving animals, including non-human primates, rodents, birds, and insects1. The activity of hundreds of cells, up to approximately 800 &#181;m below the brain surface, can be measured simultaneously using multi-photon imaging2,3. The activity of specific cell types can also be measured by expressing calcium indicators in genetically defined neuronal populations. Application of the imaging method for small vertebrate models opens up new possibilities in the field of neuronal computation across brain regions.
Zebrafish are a widely used model system in neuroscience research. Larval zebrafish at around 6 days post-fertilization have been used for calcium imaging due to their miniature brain and transparent body4. Juvenile zebrafish (3-4 weeks old) are also used for studying the neural mechanisms underlying sensorimotor pathways5,6. However, the maximal performance level for complex behaviors, including associative learning and social behaviors, is reached at an older age7,8. Thus, a reliable protocol is required to study multiple cognitive functions in the brains of adult zebrafish using imaging methods. While zebrafish larva and juvenile zebrafish can be embedded in agarose for in vivo imaging, adult zebrafish at 2 months or older suffer from hypoxia in such conditions and are physically too strong to be restrained by agarose. Therefore, a surgical procedure is required to stabilize the brain and enable the animal to breathe freely through the gills. 
Here, we describe a head restraint protocol that involves a novel design of a single head bar. The reduced surgery time of 25 min is twice as fast as the previous method9. We also describe the design of the recording chamber (semi-hexagonal tank), the head stage and a quick-lock mechanism to combine the two parts9. Finally, the setup to present an immersive visual stimulus to study visually triggered brain activity and behaviors is also described. Overall, the procedures described here can be used to perform two-photon calcium imaging in genetically defined cell populations in a head-restrained adult zebrafish, enabling the investigation of brain activities during various behavioral paradigms.

Autore in primo piano: Progressi nella ricerca sul cervello del pesce zebra adulto 

Imaging del calcio a due fotoni dell'attività del prosencefalo nel comportamento del pesce zebra adulto

The fish fore-brain hosts areas suspected to be homologous to mammalian brain regions involved in complex behavior. These include the hippocampus, the cortex, and the amygdala. We are currently trying to understand the effect of sensory information on the activity of these brain regions.Current research in zebra fish neuroscience uses two photon calcium imaging of immobilized larvae. Combined with virtual reality based behavior essays, to study sensory motor processing in the brain. Most research on the zebra fish brain is done on larvae, however some complex behaviors in fish do not fully develop until adulthood.Our protocol allows the study of brain activity in the adult during behavior. This protocol reduced surgery times by fifty percent compared to the previous method. It's a more efficient approach for restraining the head of adult zebra fish for a better image.This head restraint protocol opened an opportunity to perform an in vivo experiment on the adult zebra fish brain. In addition to the two-photon calcium image, head restraint potentially allows the opto-genetic manipulation, electro-physiology, and even ultra-sound imaging of live fish.

Il protocollo si compone di due parti: l'intervento chirurgico del poggiatesta e l'imaging a due fotoni delle attività neuronali nel prosencefalo. Il successo dell'intervento chirurgico è definito dalla sopravvivenza dell'animale e dalla stabilità del poggiatesta. Il tasso di sopravvivenza può essere notevolmente migliorato dalla frequente perfusione della soluzione TMS allo 0,01% attraverso la bocca durante l'intervento chirurgico. I pesci dovrebbero riprendersi dall'anestesia e respirare attivamente entro 1-2 minut...

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Qui, presentiamo un protocollo per eseguire l'imaging del calcio a due fotoni nel prosencefalo dorsale di zebrafish adulto.

Adult zebrafish (Danio rerio) exhibit a rich repertoire of behaviors for studying cognitive functions. They also have a miniature brain that can be used ...

Il prosencefalo del pesce ospita aree sospettate di essere omologhe alle regioni cerebrali dei mammiferi coinvolte in comportamenti complessi. Questi includono l'ippocampo, la corteccia e l'amigdala. Attualmente stiamo cercando di capire l'effetto delle informazioni sensoriali sull'attività di queste regioni cerebrali.L'attuale ricerca nel campo delle neuroscienze del pesce zebra utilizza l'imaging a due fotoni di larve immobilizzate. In combinazione con saggi comportamentali basati sulla realtà virtuale, per studiare l'elaborazione motoria sensoriale nel cervello. La maggior parte delle ricerche sul cervello del pesce zebra viene condotta sulle larve, tuttavia alcuni comportamenti complessi nei pesci non si sviluppano completamente fino all'età adulta.Il nostro protocollo permette lo studio dell'attività cerebrale nell'adulto durante il comportamento. Questo protocollo ha ridotto i tempi chirurgici del cinquanta percento rispetto al metodo precedente. È un approccio più efficiente per trattenere la testa del pesce zebra adulto per un'immagine migliore.Questo protocollo di poggiatesta ha aperto l'opportunità di eseguire un esperimento in vivo sul cervello di pesce zebra adulto. Oltre all'immagine del calcio a due fotoni, il poggiatesta consente potenzialmente la manipolazione optogenetica, l'elettrofisiologia e persino l'imaging ecografico di pesci vivi.

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Neuroscience

Two-Photon Calcium Imaging of Forebrain Activity in Behaving Adult Zebrafish

1.5K Views.  Academia Sinica. Il prosencefalo del pesce ospita aree sospettate di essere omologhe alle regioni cerebrali dei mammiferi coinvolte in comportamenti complessi. Questi includono l'ippocampo, la corteccia e l'amigdala. Attualmente stiamo cercando di capire l'effetto delle informazioni sensoriali sull'attività di queste regioni cerebrali.L'attuale ricerca nel campo delle neuroscienze del pesce zebra utilizza l'imaging a due fotoni di larve immobilizzate. In combinazione con saggi comportamentali basati s...

Video: Autore in primo piano: Progressi nella ricerca sul cervello del pesce zebra adulto 

Adult zebrafish (Danio rerio) exhibit a rich repertoire of behaviors for studying cognitive functions. They also have a miniature brain that can be used for measuring activities across brain regions through optical imaging methods. However, reports on the recording of brain activity in behaving adult zebrafish have been scarce. The present study describes procedures to perform two-photon calcium imaging in the dorsal forebrain of adult zebrafish. We focus on steps to restrain adult zebrafish from moving their heads, which provides stability that enables laser scanning imaging of the brain activity. The head-restrained animals can freely move their body parts and breathe without aids. The procedure aims to shorten the time of head restraint surgery, minimize brain motion, and maximize the number of neurons recorded. A setup for presenting an immersive visual environment during calcium imaging is also described here, which can be used to study neural correlates underlying visually triggered behaviors.

Here, we present a protocol to perform two-photon calcium imaging in the dorsal forebrain of adult zebrafish.

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Neuroscienze

Preparation of Recording Chamber for Zebrafish Imaging

To begin, prepare a semi-hexagonal tank, a base plate, and a head stage. Place the semi-hexagonal tank on the experimental platform of the microscope. Aim the 810 nanometer infrared light and the camera to the head stage for behavioral recording.Then, set up an 875 nanometer short-pass filter, and a 700 nanometer long-pass filter in front of the camera to prevent the two-photon laser and the visual stimulus from interfering with behavioral recording. To present the visual stimulus, attach back projection films to the inner side of the three walls of the semi-hexagonal tank. Aim the three projectors at the three surfaces of the tank.

Preparazione della camera di registrazione per l'imaging del pesce zebra

Head-Fixation Surgery in Zebrafish

To prepare an omega-shaped head bar for the zebrafish head restraint, attach a piece of oil-based modeling clay to a three-axis micro manipulator. Then insert an arm of the head bar into the clay and orient the head bar horizontally. Prepare the cannon for holding the fish's body in place during surgery.To remove excess skin and water from the skull's attachment sites, prepare four tissue swabs by cutting a paper towel into a three centimeter square. Then fold the paper squares along their diagonal to produce a tube-like structure and twist the ends of the tube into a fine point. After anesthetizing the fish with 0.03%TMS, perform syringe perfusion with 0.01%TMS to maintain sedation throughout the procedure.Wrap the fish in moist paper tissue starting from the tip of the tail to around one millimeter caudal to the gill. Then wrap a soft plastic tubing with a longitudinal slit around the paper tissue covering the fish from the end of the tail to around two millimeter caudal to the gill. Wrap the paper towel around the tubing.Then wrap a soft plastic tube cut from the bulb of a plastic transfer pipette around the paper towel. Load the wrapped fish into the cannon. Next, using a scalpel, remove the skin covering the attachment sites, two triangular areas of the skull rostrolateral to the cerebellum and above the gills.Then use tissue swabs to dry the attachment sites and clear any remaining skin. Using a 10 microliter pipette tip, apply a drop of tissue glue at the center of each attachment site. Place the fish body in an upright position and position the head bar slightly above and caudal to the attachment sites.Next, prepare dental cement by mixing one small spoon of polymer with four drops of quick monomer and one drop of catalyst five. Stir the mixture evenly for 15 seconds. Immediately after mixing, use a micropipette and a 10 microliter pipette tip to apply the cement onto the attachment sites and the region between the sites.Then using a micro manipulator, gently press the head bar onto the cement. Cover the head bar with the remaining cement and wait for 12 minutes to allow the curing of the cement. Next, to improve optical access to the forebrain for calcium imaging, use a scalpel to remove the skin above the telencephalon.After curing, remove the clay from the head bar. Next, prepare a fish loading module for the micro manipulator. Then transfer the entire capsule from the cannon to the pitch adjuster in the fish loading module.Using the micro manipulator, position the fish with the head bar placed on top of the metal posts of the head stage. Slightly increase the pitch angle of the fish. Apply ultraviolet curable glue to secure the head bar to the metal posts.Then pull out the fish from the capsule and lock the head stage onto the base plate within the semi hexagonal tank. After surgery, immerse the animal in fish tank water to recover from anesthesia.

Chirurgia di fissazione della testa nel pesce zebra

Two-Photon Imaging of Zebrafish Forebrain 

Turn on the laser and wait for 30 minutes for the power to stabilize. Set the wavelength to 920 nanometers and power to approximately 50 milliwatts at the sample. Place the recording chamber with the head-restrained zebrafish on the experimental platform.Position the objective lens close to the forebrain surface. For behavior recording, turn on the 810 nanometer infrared lights on both sides of the tank. Select the input source for VR display and start recording data.Then, open the laser shutter and enable the photo multiplier tube. Gradually elevate the objective lens until the dorsal forebrain is revealed. Use a piezo actuator to acquire images at multiple depths to increase the number of neurons recorded.Two photon calcium imaging records individual neuron activity in the dorsal forebrain up to 200 microns deep through intact skulls. The imaging range includes the paleo areas, Dm, cDc, rDc, and part of the Dl covering 30%of the adult zebrafish forebrain. Simultaneous behavioral recording performed during brain imaging enables the identification of neuronal correlates of motor outputs.During imaging, tail movements should not cause visible motion artifacts.