Ringraziamo il Dr. Xiao Fan per le utili discussioni durante la definizione di questi metodi presso Scripps Research. B.B. è stato sostenuto da una borsa di ricerca post-dottorato della Hewitt Foundation for Medical Research. W.C. è supportato da una borsa di studio pre-dottorato della National Science Foundation. Il D.E.P. è supportato dalla sovvenzione del National Institutes of Health (NIH) NS095892 a G.C.L. Questo progetto è stato sostenuto anche dalle sovvenzioni NIH GM142196, GM143805 e S10OD032467 a G.C.L.

Rivestimento delle griglie TEM con un monostrato di grafene

<ol>
	<li>Li, X., Zheng, S. Q., Egami, K., Agard, D. A., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+electron+dose+rate+on+electron+counting+images+recorded+with+the+K2+camera.">Influence of electron dose rate on electron counting images recorded with the K2 camera.</a> Journal of Structural Biology. 184 (2), 251-260 (2013).</li><li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN2:+An+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy.">EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li><li>Zivanov, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+automated+high-resolution+cryo-EM+structure+determination+in+RELION-3.">New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3.</a> eLife. 7, 1-22 (2018).</li><li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CryoSPARC:+Algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination.">CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li><li>Grigorieff, N., Harrison, S. 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F., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+individual+atoms+of+protein+complex+by+cryo-electron+microscopy.">Resolving individual atoms of protein complex by cryo-electron microscopy.</a> Cell Research. 30 (12), 1136-1139 (2020).</li><li>Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic-resolution+protein+structure+determination+by+cryo-EM.">Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM.</a> Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).</li><li>Schultz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+specimens.">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 21 (2), 129-228 (1988).</li><li>Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+blot-and-plunge+freezing+of+biological+specimens+for+single-particle+cryogenic+electron+microscopy.">Manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. 2022 (180), 1-16 (2022).</li><li>Glaeser, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins,+interfaces,+and+cryo-em+grids.">Proteins, interfaces, and cryo-em grids.</a> Current Opinion in Colloid &amp; Interface Science. 25 (3), 289-313 (2016).</li><li>Glaeser, R. M., Han, B. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opinion:+hazards+faced+by+macromolecules+when+confined+to+thin+aqueous+films.">Opinion: hazards faced by macromolecules when confined to thin aqueous films.</a> Biophysics Reports. 3 (1-3), 1-7 (2017).</li><li>Han, B. G., Watson, Z., Cate, J. H. D., Glaeser, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayer-crystal+streptavidin+support+films+provide+an+internal+standard+of+cryo-EM+image+quality.">Monolayer-crystal streptavidin support films provide an internal standard of cryo-EM image quality.</a> Journal of Structural Biology. 200 (3), 307-313 (2017).</li><li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routine+single+particle+CryoEM+sample+and+grid+characterization+by+tomography.">Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography.</a> eLife. 7, 1-42 (2018).</li><li>Drulyte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+altering+particle+distributions+in+cryo-electron+microscopy+sample+preparation.">Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74 (6), 560-571 (2018).</li><li>Liu, N., Wang, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Better+cryo-EM+specimen+preparation:+how+to+deal+with+the+air-water+interface.">Better cryo-EM specimen preparation: how to deal with the air-water interface.</a> Journal of Molecular Biology. 435 (9), 167926 (2022).</li><li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+effects+of+particle+adsorption+to+the+air-water+interface+in+cryo-EM.">Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM.</a> Nature Methods. 15 (10), 793-795 (2018).</li><li>Palovcak, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+robust+procedure+for+preparing+graphene-oxide+cryo-EM+grids.">A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-EM grids.</a> Journal of Structural Biology. 204 (1), 80-84 (2018).</li><li>Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+graphene+oxide+coating+improves+cryo-EM+sample+preparation+and+data+collection+from+tilted+grids.">Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Marr, C. R., Benlekbir, S., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+carbon+films+with+~500nm+holes+for+cryo-EM+with+a+direct+detector+device.">Fabrication of carbon films with ~500nm holes for cryo-EM with a direct detector device.</a> Journal of Structural Biology. 185 (1), 42-47 (2014).</li><li>Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graphene+oxide:+A+substrate+for+optimizing+preparations+of+frozen-hydrated+samples.">Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples.</a> Journal of Structural Biology. 170 (1), 152-156 (2010).</li><li>Pantelic, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graphene:+substrate+preparation+and+introduction.">Graphene: substrate preparation and introduction.</a> Journal of Structural Biology. 174 (1), 234-238 (2011).</li><li>Russo, C. J., Passmore, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+towards+an+optimal+specimen+support+for+electron+cryomicroscopy.">Progress towards an optimal specimen support for electron cryomicroscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 37, 81-89 (2016).</li><li>Passmore, L. A., Russo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specimen+preparation+for+high-resolution+cryo-EM.">Specimen preparation for high-resolution cryo-EM.</a> Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yield+monolayer+graphene+grids+for+near-atomic+resolution+cryoelectron+microscopy.">High-yield monolayer graphene grids for near-atomic resolution cryoelectron microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (2), 1009-1014 (2020).</li><li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+ultraclean+atomically+thin+membranes+for+atomic-resolution+electron+microscopy.">Robust ultraclean atomically thin membranes for atomic-resolution electron microscopy.</a> Nature Communications. 11 (1), 541 (2020).</li><li>Ahn, E., Kim, B., Cho, U. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Batch+production+of+high-quality+graphene+grids+for+cryo-EM:+cryo-EM+structure+of+Methylococcus+capsulatus+soluble+methane+monooxygenase+hydroxylase.">Batch production of high-quality graphene grids for cryo-EM: cryo-EM structure of Methylococcus capsulatus soluble methane monooxygenase hydroxylase.</a> bioRxiv. (Cvd), (2021).</li><li>Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+graphene+supports+for+electron+cryomicroscopy.">Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (24), 11718-11724 (2019).</li><li>Fan, H., Sun, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+graphene+grids+for+cryoelectron+microscopy.">Developing graphene grids for cryoelectron microscopy.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 937253 (2022).</li><li>D'Imprima, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+denaturation+at+the+air-water+interface+and+how+to+prevent+it.">Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it.</a> eLife. 8, e42747 (2019).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+copper+step+beams+during+graphene+growth+by+CVD+method.">Evolution of copper step beams during graphene growth by CVD method.</a> Applied Surface Science. 610, 155518 (2023).</li><li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uniform+thin+ice+on+ultraflat+graphene+for+high-resolution+cryo-EM.">Uniform thin ice on ultraflat graphene for high-resolution cryo-EM.</a> Nature Methods. 20 (1), 123-130 (2023).</li><li>Fujita, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epoxidized+graphene+grid+for+highly+efficient+high-resolution+cryoEM+structural+analysis.">Epoxidized graphene grid for highly efficient high-resolution cryoEM structural analysis.</a> Scientific Reports. 13, 2279 (2023).</li><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalized+graphene+grids+with+various+charges+for+single-particle+cryo-EM.">Functionalized graphene grids with various charges for single-particle cryo-EM.</a> Nature Communications. 13, 6718 (2022).</li></ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

La conservazione di campioni biologici in un sottile strato di ghiaccio vitreo è un passaggio di fondamentale importanza per la determinazione della struttura crioEM ad alta risoluzione. Tuttavia, i ricercatori incontrano spesso problemi derivanti dalle interazioni con l'AWI, che introduce l'orientamento preferenziale, il disassemblaggio complesso, la denaturazione e l'aggregazione. Inoltre, i campioni non possono sempre essere concentrati a sufficienza per popolare il sottile ghiaccio sospeso attraverso i fori di una pellicola fenestrata. Diversi gruppi di ricerca hanno sviluppato metodi per rivestire le griglie EM con un monostrato di grafene per aiutare a superare alcune di queste limitazioni 24,25,26,27,28,29,30 e le griglie di grafene sono state utilizzate con grande successo. Qui, forniamo istruzioni dettagliate per preparare efficacemente lotti di griglie di grafene internamente ed esaminare la qualità delle griglie di grafene mediante TEM. Sottolineiamo che è necessario prestare particolare attenzione durante alcuni dei passaggi critici, che descriviamo di seguito.
Il grafene ha una forte tendenza ad attirare i contaminanti presenti nell'aria. Pertanto, durante il processo di fabbricazione della griglia di grafene, è importante assicurarsi che tutti gli strumenti che entrano in contatto con il foglio di grafene/Cu o le griglie siano puliti e privi di polvere. I vetrini coprioggetto utilizzati per trasferire il grafene possono essere puliti risciacquando con etanolo e acqua deionizzata o utilizzando uno spolverino ad aria. Si consiglia inoltre di lavorare sotto una cappa aspirante e di tenere sempre i fogli e le griglie di grafene coperti con un foglio di alluminio o una lastra di vetro pulita. Polvere o contaminanti sulle griglie possono impedire al grafene di aderire completamente alle griglie EM. Quando si maneggiano griglie rivestite di grafene o grafene, è importante essere collegati a terra elettricamente per evitare danni al film di grafene dovuti a scariche elettrostatiche. Le scariche elettrostatiche possono essere evitate utilizzando una cinghia di messa a terra da polso, toccando un oggetto metallico collegato a terra ogni volta che si maneggiano grafene o griglie di grafene e/o non indossando un guanto sulla mano che tiene le pinzette24.
Poiché un monostrato di grafene è molto sottile (la larghezza di un atomo di carbonio), è importante supportare il grafene con uno strato organico come MMA o poli-MMA (PMMA) durante il trasferimento del grafene alle griglie. Il PMMA è il materiale più utilizzato per il trasferimento del grafene. Tuttavia, il PMMA ha una forte affinità con il grafene e spesso può provocare la contaminazione del polimero sul film di grafene. L'MMA viene utilizzato in questo protocollo, in quanto lascia meno contaminazione residua25. Tuttavia, sia il PMMA che l'MMA hanno lo svantaggio di formare rughe e crepe che possono essere osservate in alcune aree del film di grafene (Figura 3B). Può essere difficile evitare queste rughe poiché si verificano comunemente durante la crescita del grafene con il metodo CVD31. Recentemente è stato sviluppato un metodo per la coltivazione di grafene ultrapiatto senza rughe, in cui la lamina di rame viene sostituita da un wafer di Cu(111)/zaffiro come substrato di crescita32.
Sulla base della nostra esperienza, è meglio acquistare fogli di grafene/Cu e supportare il grafene con MMA internamente piuttosto che acquistare fogli di rame ricoperti di polimeri dai produttori, che diventano fragili dopo l'incisione su rame e sono difficili da maneggiare nelle fasi successive. Lo spin coater che abbiamo usato per il rivestimento MMA può essere costruito a basso costo utilizzando parti di un negozio di computer/ferramenta locale, come descritto in precedenza25.
Durante la fase del rivestimento MMA, è importante coprire l'intera superficie del grafene sul foglio di grafene Cu con MMA. Dopo che il Cu è stato inciso, il grafene MMA diventerà semitrasparente e le aree prive di copertura MMA appariranno come fori vuoti. Per evitare il rivestimento MMA sul lato del rame, è importante posizionare un piccolo pezzo di carta assorbente sotto di esso durante il rivestimento in modo che assorba l'MMA in eccesso che fuoriesce dalla pellicola CVD.
Dopo l'incisione e il risciacquo, il foglio MMA/grafene è pronto per essere trasferito alle griglie EM utilizzando un sistema di abbeveratoio commerciale o fatto in casa con una siringa o una pompa peristaltica per controllare il livello dell'acqua. Prima della fase di trasferimento, è importante presciacquare accuratamente le griglie in bagni successivi di cloroformio, acetone e alcool isopropilico. La cottura di griglie rivestite di grafene a 65 °C aiuta a preservare l'integrità del grafene e promuove l'adsorbimento del grafene alle griglie. Infine, per prevenire la contaminazione da MMA sulle griglie, è importante rimuovere accuratamente l'MMA in un bagno di acetone e pulire le griglie in alcool isopropilico. Eventuali residui di MMA non lavati saranno osservati sulle griglie EM e diminuiranno il rapporto segnale/rumore delle immagini (Figura 3C). Il processo di lavaggio acetone-IPA può essere ripetuto per pulire ulteriormente le superfici in grafene.
Per rendere idrofile le griglie di grafene, abbiamo esposto le griglie ai raggi UV/ozono. Diversi modelli di detergenti UV/ozono possono richiedere un'ottimizzazione per ossigenare sufficientemente lo strato di grafene per la preparazione del campione crioEM senza danneggiare il grafene. Indipendentemente dal sistema, è fondamentale utilizzare queste griglie per l'applicazione di campioni crioEM subito dopo il trattamento UV/Ozono. Metodi alternativi per rendere idrofile le griglie di grafene sono descritti in altri studi33,34.

La microscopia elettronica criogenica a singola particella (cryoEM) è una tecnologia sempre più applicabile utilizzata per studiare le strutture 3D delle biomacromolecole. I progressi tecnologici nell'ottica del microscopio elettronico, nel rilevamento diretto di elettroni1 e negli algoritmi informatici 2,3,4 nell'ultimo decennio hanno permesso agli utenti di cryoEM di determinare le strutture di complessi macromolecolari biochimicamente stabili con una risoluzione quasi atomica 5,6,7,8 . Nonostante questi progressi, permangono notevoli ostacoli alla conservazione dei campioni per l'imaging crioEM, che impediscono alla maggior parte dei campioni biologici di essere risolti a risoluzioni così elevate.
La preparazione del campione per l'analisi crioEM ad alta risoluzione comporta l'intrappolamento di macromolecole distribuite uniformemente in un'ampia gamma di orientamenti all'interno di un sottile strato di ghiaccio vetrificato. I metodi di congelamento "blot and plunge" sono i metodi più utilizzati per generare film sottili di campioni biologici su griglie per studi crioEM 9,10. Questi metodi prevedono l'applicazione di alcuni microlitri di soluzione campione a una griglia EM contenente un film fenestrato che è stato reso idrofilo e successivamente l'eliminazione della maggior parte del campione con carta da filtro prima di immergere rapidamente la griglia in un criogeno di etano liquido o miscela di etano e propano9.
Sebbene questo metodo sia stato utilizzato con successo per determinare le strutture di un'ampia gamma di campioni biologici, tutti i metodi di preparazione dei campioni crioEM comunemente usati espongono i campioni all'interfaccia aria-acqua idrofobica (AWI), che spesso introduce problemi che limitano la determinazione della struttura ad alta risoluzione. È stato stabilito che i campioni biologici hanno un'elevata propensione alla denaturazione se esposti all'AWI, che può portare a complesse aggregazioni e disassemblaggi11,12,13,14. Inoltre, le macchie idrofobiche sulle superfici dei campioni biologici fanno sì che le particelle adottino orientamenti preferenziali nel ghiaccio12. In molti scenari, una singola regione idrofobica del campione costringe tutte le particelle ad adottare un orientamento singolare nel ghiaccio, abolendo così la capacità di generare una ricostruzione affidabile. Oltre ai problemi con l'AWI, i campioni possono dimostrare un'affinità per la superficie dello strato fenestrato di pellicola, limitando il numero di particelle sospese nel ghiaccio all'interno dei fori15.
Diverse soluzioni metodologiche e tecnologiche sono state sviluppate per ridurre questi problemi derivanti dalle interazioni con l'AWI o i film16,17. Un approccio popolare è quello di rivestire il film fenestrato delle griglie EM con un sottile strato (decine di nanometri) di carbonio amorfo. Questo rivestimento fornisce una superficie continua attraverso i fori a cui le particelle possono adsorbirsi, con il vantaggio di schermare parzialmente il campione dalle interazioni con l'AWI15,18,19,20. Tuttavia, lo strato di carbonio aggiuntivo aumenta la quantità di segnale di fondo nelle regioni riprese, introducendo rumore che può compromettere la risoluzione raggiungibile, in particolare per campioni di piccole dimensioni (<150 kDa). Negli ultimi anni, l'uso di scaglie di ossido di grafene (GO) per produrre film di supporto su griglie crioEM ha dimostrato di avere vantaggi rispetto al carbonio amorfo tradizionale. I fiocchi di GO sono prodotti attraverso l'ossidazione di strati di grafite, dando luogo a fogli pseudocristallini di grafite monostrato che sono idrofili a causa del loro notevole contenuto di ossigeno sotto forma di gruppi carbossilici, ossidrilici ed epossidici sulle superfici e sui bordi. I fiocchi di GO commerciali in sospensione acquosa sono poco costosi e ci sono numerosi metodi pubblicati per applicare i fiocchi di GO alle griglie EM18,21. Tuttavia, questi metodi spesso si traducono in griglie che sono solo parzialmente coperte da fiocchi di GO, nonché regioni che contengono più strati di scaglie di GO. Inoltre, i fiocchi di GO contribuiscono con un notevole segnale di fondo alle immagini crioEM che è vicino a quello osservato con il carbonio amorfosottile 22,23.
Il grafene monostrato incontaminato, che consiste in una singola matrice cristallina 2D di atomi di carbonio, si distingue dal GO in quanto non produce contrasto di fase al microscopio elettronico. Il grafene monostrato può quindi essere utilizzato per generare uno strato di supporto invisibile per l'imaging di campioni biologici. Il grafene monostrato è anche più resistente del GO e può essere applicato come singolo monostrato su una griglia EM e i recenti progressi nella fabbricazione di griglie EM rivestite di grafene hanno reso possibile la preparazione interna di griglie di grafene monostrato ad alta copertura 24,25,26,27,28,29,30 . Tuttavia, nonostante i vantaggi dell'utilizzo di griglie rivestite di grafene per la determinazione della struttura crioEM, non sono ampiamente utilizzate a causa dei costi proibitivi delle opzioni commerciali e della complessità della produzione interna. Qui, descriviamo una guida passo passo per produrre efficacemente griglie EM ricoperte da un monostrato di grafene per la determinazione della struttura crioEM di campioni biologici (Figura 1). Seguendo questo protocollo dettagliato, i ricercatori di cryoEM possono preparare in modo riproducibile dozzine di griglie di supporto del grafene di alta qualità in un solo giorno. La qualità delle griglie rivestite di grafene può essere facilmente esaminata utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione (TEM) di fascia bassa dotato di un filamento LaB6.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>70% EtOH</td>
			<td>Pharmco (190 pf EtOH)</td>
			<td>241000190CSGL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>650501-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>215589-500g</td>
			<td>Hazardous; use extreme caution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C2432-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamping TEM Grid Holder Block for 45 Grids</td>
			<td>PELCO</td>
			<td>16830-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer fan</td>
			<td>Amazon (Noctua)</td>
			<td>B07CG2PGY6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slip</td>
			<td>Bellco Glass</td>
			<td>1203J71</td>
			<td>Standard cover slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallizing dish</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>3140-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronics duster</td>
			<td>Falcon Safety Products</td>
			<td>75-37-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Dust-off Air Duster</td>
			<td>Staples</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter papers</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine tip tweezer</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0508-L4-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>4980-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fork</td>
			<td>Supermarket</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphene/Cu</td>
			<td>Graphenea</td>
			<td>N/A</td>
			<td>CVD monolayer graphene cu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid Coating Trough</td>
			<td>Ladd Research Industries</td>
			<td>10840</td>
			<td>Fragile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>67-63-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapton Tape</td>
			<td>Amazon (MYJOR)</td>
			<td>MY-RZY001</td>
			<td>Polyimide tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Long twzeer</td>
			<td>Cole Parmer Essentials</td>
			<td>UX-07387-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal grid holder</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16820-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMA(8.5)MMA EL 6</td>
			<td>KAYAKU Advanced Materials</td>
			<td>M31006 0500L 1GL</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 10 Lab Oven</td>
			<td>Quincy Lab, Inc.</td>
			<td>FO19013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>3610-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner (Solarus 950)</td>
			<td>Gatan, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fiskars</td>
			<td>194813-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Analog Orbital Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltrAuFoil R1.2/1.3 - Au300</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Holey gold grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet Ozone Cleaning Systems</td>
			<td>UVOCS</td>
			<td>model T10X10/OES</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of monolayer graphene-coated grids for cryoelectron microscopy

La microscopia elettronica criogenica (cryoEM) è emersa come una potente tecnica per sondare la struttura atomica dei complessi macromolecolari. La preparazione del campione per cryoEM richiede la conservazione dei campioni in un sottile strato di ghiaccio vitreo, tipicamente sospeso all'interno dei fori di una pellicola di supporto fenestrata. Tuttavia, tutti gli approcci di preparazione del campione comunemente utilizzati per gli studi crioEM espongono il campione all'interfaccia aria-acqua, introducendo un forte effetto idrofobico sul campione che spesso si traduce in denaturazione, aggregazione e dissociazione complessa. Inoltre, le interazioni idrofobiche preferite tra le regioni del campione e l'interfaccia aria-acqua hanno un impatto sugli orientamenti adottati dalle macromolecole, dando luogo a ricostruzioni 3D con risoluzione direzionale anisotropa. 
È stato dimostrato che l'adsorbimento di campioni crioEM a un monostrato di grafene aiuta a mitigare le interazioni con l'interfaccia aria-acqua, riducendo al minimo l'introduzione del rumore di fondo. I supporti in grafene offrono anche il vantaggio di ridurre sostanzialmente la concentrazione richiesta di proteine necessarie per l'imaging crioEM. Nonostante i vantaggi di questi supporti, le griglie rivestite di grafene non sono ampiamente utilizzate dalla comunità crioEM a causa dei costi proibitivi delle opzioni commerciali e delle sfide associate alla produzione interna su larga scala. Questo documento descrive un metodo efficiente per la preparazione di lotti di griglie crioEM che hanno una copertura quasi completa di grafene monostrato.

Single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) is an increasingly applicable technology used to investigate the 3D structures of biomacromolecules. Technological advances in electron microscope optics, direct electron detection1, and computer algorithms2,3,4 over the past decade have enabled cryoEM users to determine the structures of biochemically stable macromolecular complexes to near-atomic resolution5,6,7,8. Despite these advances, there remain notable barriers to preserving samples for cryoEM imaging, which prevent the majority of biological specimens from being resolved to such high resolutions.
Sample preparation for high-resolution cryoEM analysis involves trapping macromolecules that are evenly distributed in a wide range of orientations within a thin layer of vitrified ice. The &#34;blot and plunge&#34; methods of freezing are the most widely used methods employed to generate thin films of biological samples on grids for cryoEM studies9,10. These methods involve applying a few microliters of sample solution to an EM grid containing a fenestrated film that has been made hydrophilic and subsequently blotting away the majority of the sample with filter paper before rapidly plunging the grid into a cryogen of liquid ethane or ethane-propane mixture9.
While this method has successfully been used to determine structures of a wide range of biological specimens, all commonly used cryoEM specimen preparation methods expose specimens to the hydrophobic air-water interface (AWI), which often introduces&#160;issues that limit high-resolution structure determination. It is established that biological specimens have a high propensity to denature when exposed to the AWI, which can lead to complex aggregation and disassembly11,12,13,14. Furthermore, hydrophobic patches on the surfaces of biological specimens cause particles to adopt preferred orientations in the ice12. In many scenarios, a single hydrophobic region of the sample forces all particles to adopt a singular orientation in the ice, thereby abolishing the ability to generate a reliable reconstruction. In addition to issues with the AWI, specimens may demonstrate an affinity for the surface of the fenestrated layer of film, limiting the number of particles suspended in the ice within the holes15.
Several methodological and technological solutions have been developed to diminish these issues arising from interactions with the AWI or the films16,17. One popular approach is to coat the fenestrated film of the EM grids with a thin (tens of nanometers) layer of amorphous carbon. This coating provides a continuous surface across the holes to which particles can adsorb, with the benefit of partially shielding the sample from interactions with the AWI15,18,19,20. However, the additional carbon layer elevates the amount of background signal in the imaged regions, introducing noise that can compromise attainable resolution, particularly for small (&#60;150 kDa) specimens. In recent years, the use of graphene oxide (GO) flakes to produce supporting films on cryoEM grids has been shown to have advantages over traditional amorphous carbon. GO flakes are produced through the oxidation of graphite layers, resulting in pseudo-crystalline sheets of monolayer graphite that are hydrophilic due to their substantial oxygen content in the form of carboxyl, hydroxyl, and epoxy groups on the surfaces and edges. Commercial GO flakes in aqueous suspensions are inexpensive, and there are numerous published methods for applying GO flakes to EM grids18,21. However, these methods often result in grids that are only partially covered with GO flakes, as well as regions that contain multiple layers of GO flakes. Further, GO flakes contribute a noticeable background signal to cryoEM images that is close to that observed with thin amorphous carbon22,23.
Pristine monolayer graphene, which consists of a single 2D crystalline array of carbon atoms, is distinct from GO in that it does not produce phase contrast in the electron microscope. Monolayer graphene thus can be used to generate an invisible support layer for imaging biological samples. Monolayer graphene is also stronger than GO and can be applied as a single monolayer on an EM grid, and recent advancements in the fabrication of graphene-coated EM grids have made it possible to prepare high-coverage monolayer graphene grids in-house24,25,26,27,28,29,30. However, despite the benefits of using graphene-coated grids for cryoEM structure determination, they are not widely used due to the prohibitive expense of commercial options and the complexity of in-house production. Here, we describe a step-by-step guide to effectively producing EM grids covered with a monolayer of graphene for cryoEM structure determination of biological specimens (Figure 1). By following this detailed protocol, cryoEM researchers can reproducibly prepare dozens of high-quality graphene support grids in a single day. The quality of the graphene-coated grids can be readily examined using a low-end transmission electron microscope (TEM) equipped with a LaB6 filament.

Autore in primo piano: Migliorare la risoluzione CryoEM utilizzando griglie rivestite di grafene 

Fabbricazione di griglie monostrato rivestite di grafene per microscopia crioelettronica

L'esecuzione corretta del protocollo di fabbricazione della griglia di grafene qui descritto si tradurrà in griglie EM completamente rivestite con un singolo monostrato di grafene. La copertura di grafene delle griglie può essere verificata utilizzando qualsiasi TEM. Poiché un monostrato di grafene pulito è quasi invisibile nel TEM, è necessario esaminarlo utilizzando la modalità di diffrazione del microscopio e osservare i punti di Bragg corrispondenti all'organizzazione esagonale degli atomi di carbonio che compongono il grafene (Figura 3A). È normale osservare occasionalmente alcune rughe di grafene monostrato, che vengono introdotte durante il rivestimento MMA (Figura 3B). Si può anche controllare il livello di contaminazione presente sul grafene acquisendo un'immagine ad alto ingrandimento al centro di uno dei fori ricoperti di grafene (Figura 3C). Se acquisita con un rivelatore ad alta risoluzione, una trasformata di Fourier di questa immagine dovrebbe contenere macchie di Bragg corrispondenti alla spaziatura carbonio-carbonio a 2,14 Å (Figura 4C). Un monostrato di atomi di carbonio non produce una diffusione di elettroni sufficiente a generare un contrasto di fase, e quindi un'immagine di grafene pulito non presenterà anelli Thon associati alla funzione di trasferimento del contrasto in una trasformata di Fourier dell'immagine. Tuttavia, è molto difficile prevenire la contaminazione delle griglie di grafene dopo che sono state prodotte, e un lavaggio insufficiente delle griglie EM o la rimozione di MMA dopo il rivestimento di grafene si tradurrà in notevoli contaminanti sulle griglie che sono visibili nelle immagini dello spazio reale (Figura 3C). Come mostrato nella Figura 4, le griglie di grafene hanno un effetto concentrante su un campione, come si osserva quando si confrontano 0,5 mg/mL di apoferritina applicati a griglie d'oro bucate con (Figura 4A) e senza il supporto di grafene (Figura 4B). Protocolli di fabbricazione del grafene simili sono stati precedentemente descritti per risolvere le strutture crioEM di proteine come l'apoferritina ad alta risoluzione25,27.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65702/65702fig01.jpg"> Figura 1: Schema per la preparazione di griglie crioEM rivestite di grafene. Vengono illustrati i passaggi chiave del processo di fabbricazione della griglia in grafene. Abbreviazioni: cryoEM = microscopia elettronica criogenica; MMA = metacrilato di metile; APS = persolfato di ammonio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65702/65702fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65702/65702fig02.jpg"> Figura 2: Materiali necessari per la realizzazione di griglie di grafene. (A) I materiali necessari per il rivestimento delle griglie crio-EM sono etichettati di conseguenza. (B) Vista ravvicinata della verniciatrice con foglio di grafene/Cu fissato su una carta assorbente su un vetrino. La spatolatrice può essere assemblata acquistando parti da un negozio di computer/ferramenta locale. (C) Vista ravvicinata della depressione di rivestimento della griglia collegata a una siringa che può essere utilizzata per controllare il livello dell'acqua. Le griglie sono posizionate sopra una carta assorbente su una rete di acciaio inossidabile. La carta assorbente aiuta a manovrare la posizione delle griglie in modo che il foglio di grafene possa essere abbinato ad esso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65702/65702fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65702/65702fig03.jpg"> Figura 3: Un'immagine rappresentativa del modello di diffrazione e immagini in campo chiaro di una griglia di grafene che mostra rughe o contaminazione da MMA . (A) Le griglie EM ricoperte da un monostrato di grafene mostreranno picchi di Bragg corrispondenti al reticolo esagonale del grafene quando vengono ripresi in un TEM in modalità di diffrazione. Il picco di Bragg corrispondente alla spaziatura carbonio-carbonio di 2,14 Å è cerchiato e indicato con una freccia. (B) Un'immagine in campo chiaro di una griglia di grafene monostrato con alcune rughe (indicate con una freccia) nel monostrato di grafene. (C) Un'immagine in campo chiaro di grafene monostrato con contaminazione da MMA (indicata con una freccia). Barre di scala = 100 nm (B,C). Abbreviazioni: EM = microscopia elettronica; MMA = metacrilato di metile. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65702/65702fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65702/65702fig04.jpg"> Figura 4: Apoferritina su griglie d'oro ricoperte di grafene: (A) Micrografia CryoEM di 0,5 mg/mL di apoferritina su griglie d'oro ricoperte di grafene. (B) L'apoferritina fotografata alla stessa concentrazione è visibile a una concentrazione sostanzialmente inferiore quando viene preparata utilizzando griglie d'oro bucate senza grafene. (C) FFT della micrografia crioEM di 0,5 mg/mL di apoferritina su griglie d'oro ricoperte di grafene, con i picchi di Bragg corrispondenti al reticolo esagonale di grafene indicato. Barre della scala = 100 nm (A,B). Abbreviazioni: cryoEM = microscopia elettronica criogenica; FFT = trasformata di Fourier veloce. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65702/65702fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Enhancing CryoEM Resolution Using Graphene-Coated Grids at JoVE.com

Qui, descriviamo un protocollo per l'applicazione di un singolo monostrato di grafene alle griglie di microscopia elettronica e come prepararle per l'uso nella determinazione della struttura crioEM.

Cryogenic electron microscopy (cryoEM) has emerged as a powerful technique for probing the atomic structure of macromolecular complexes. Sample ...

Attualmente, la conservazione ottimale dei campioni biologici è una sfida importante per ottenere strutture CryoEM ad alta risoluzione. Durante il processo di preparazione del campione, i campioni sono esposti all'interfaccia idrofobica aria-acqua, che ha effetti denaturanti sui campioni e può far sì che i campioni stabili adottino un orientamento preferenziale nel ghiaccio, impedendo la determinazione della struttura ad alta risoluzione. Il rivestimento delle griglie CryoEM con un sottile strato di carbonio simile all'ossido di grafene molle è stato comunemente utilizzato per risolvere i problemi relativi alle interazioni con l'interfaccia aria-acqua.Tuttavia, questi strati spesso aumentano il rumore di fondo nelle nostre immagini, che compromette le risoluzioni della nostra struttura. Rivestendo la griglia con un monostrato di grafene si ottiene una protezione simile senza introdurre un rumore di fondo significativo. L'utilizzo di griglie CryoEM rivestite di grafene può aiutare a superare i problemi legati alle interazioni con l'interfaccia aria-acqua, tuttavia, le griglie di grafene commerciali sono costose e molti laboratori considerano le griglie di grafene troppo complicate da preparare internamente.I ricercatori nel campo di CryoEM possono ora utilizzare questo protocollo passo-passo per riprodurre dozzine di grafeni di alta qualità completamente prodotti in un giorno.

fabrication-monolayer-graphene-coated-grids-for-cryoelectron

Research

JoVE Journal

Biology

Fabrication of Monolayer Graphene-Coated Grids for Cryoelectron Microscopy

2.0K Views.  Scripps Research. Attualmente, la conservazione ottimale dei campioni biologici è una sfida importante per ottenere strutture CryoEM ad alta risoluzione. Durante il processo di preparazione del campione, i campioni sono esposti all'interfaccia idrofobica aria-acqua, che ha effetti denaturanti sui campioni e può far sì che i campioni stabili adottino un orientamento preferenziale nel ghiaccio, impedendo la determinazione della struttura ad alta risoluzione. Il rivestimento delle griglie CryoEM con un sottile...

Video: Autore in primo piano: Migliorare la risoluzione CryoEM utilizzando griglie rivestite di grafene 

Cryogenic electron microscopy (cryoEM) has emerged as a powerful technique for probing the atomic structure of macromolecular complexes. Sample preparation for cryoEM requires preserving specimens in a thin layer of vitreous ice, typically suspended within the holes of a fenestrated support film. However, all commonly used sample preparation approaches for cryoEM studies expose the specimen to the air-water interface, introducing a strong hydrophobic effect on the specimen that often results in denaturation, aggregation, and complex dissociation. Further, preferred hydrophobic interactions between regions of the specimen and the air-water interface impact the orientations adopted by the macromolecules, resulting in 3D reconstructions with anisotropic directional resolution. 
Adsorption of cryoEM specimens to a monolayer of graphene has been shown to help mitigate interactions with the air-water interface while minimizing the introduction of background noise. Graphene supports also offer the benefit of substantially lowering the required concentration of proteins required for cryoEM imaging. Despite the advantages of these supports, graphene-coated grids are not widely used by the cryoEM community due to the prohibitive expense of commercial options and the challenges associated with large-scale in-house production. This paper describes an efficient method for preparing batches of cryoEM grids that have nearly full coverage of monolayer graphene.

Here, we describe a protocol for applying a single monolayer of graphene to electron microscopy grids and how to prepare them for use in cryoEM structure determination.

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Coating Single-Layer Graphene-Copper Sheet with MMA and Cleaning the Grids

Rivestimento di fogli di grafene-rame monostrato con MMA e pulizia delle griglie

Transferring Grids to a Perforated Tray Under DI Water, Transferring Graphene to the Grids, Removing MMA, and Cleaning the Grids

Trasferimento delle griglie in un vassoio perforato sotto l'acqua deionizzata, trasferimento del grafene alle griglie, rimozione dell'MMA e pulizia delle griglie