Questo protocollo consentirà al ricercatore di sezionare l'arteria di interesse e isolare le cellule vascolari per eseguire una vasta gamma di test funzionali. Il ricercatore può studiare diversi letti vascolari e tipi di cellule per espandere la conoscenza della biologia delle cellule vascolari e del meccanismo della disfunzione vascolare. Questo metodo è più applicabile ai ricercatori che studiano la biologia delle cellule vascolari di base, così come la disfunzione delle cellule vascolari in modelli animali di malattia.
Prestare particolare attenzione per ottimizzare il protocollo di digestione, specialmente dove i letti vascolari di interesse differiscono da quelli presentati qui. Per iniziare, fissare il mouse usando perni di dissezione e spruzzare la superficie ventrale con etanolo al 70%. Utilizzare una pinza per sollevare la pelle proprio sopra i genitali e fare una piccola incisione di circa due millimetri nella pelle.
Inserire la punta delle forbici nel sito di incisione e fare un'incisione della linea mediana lunga da quattro a cinque centimetri iniziando dall'incisione iniziale e sezionando cranialmente alla base dello sterno. Fai un'incisione di un centimetro che si estende lateralmente dalla linea mediana immediatamente sotto l'arto anteriore. Fai un'incisione diagonale di un centimetro tra l'arto posteriore e i genitali.
Fai piccoli tagli lungo le incisioni cutanee della linea mediana per rimuovere il tessuto connettivo associato ed esporre il deposito adiposo sottocutaneo. Identificare il tessuto adiposo sottocutaneo a forma di C e l'arteria o la vena che corre perpendicolarmente alla cavità addominale. Inizia dal fondo della forma a C vicino ai genitali e afferra delicatamente il tessuto adiposo per esporre i tessuti connettivi.
Fai piccoli tagli nel tessuto connettivo per separare il grasso dalla pelle ed evitare di disturbare la vascolarizzazione esposta. Continuare a sezionare il tessuto connettivo fino a quando il tessuto adiposo sottocutaneo può essere rimosso intatto. Separare accuratamente l'arteria esposta dal tessuto connettivo circostante.
Conservare l'adiposo sottocutaneo isolato nel tampone HEPES sul ghiaccio. Ripetere la dissezione per il rimanente deposito adiposo sottocutaneo posteriore. Per isolare il deposito adiposo mesenterico, utilizzare la pinza Graefe per sollevare la sottile parete della cavità peritoneale sopra la vescica urinaria e fare una piccola incisione usando le forbici dritte.
Sollevare lentamente la parete della cavità peritoneale e inserire le forbici dell'iride dritte nel sito di incisione. Fai un'incisione di quattro o cinque centimetri dalla vescica urinaria allo sterno. Quindi fare due incisioni orizzontali di un centimetro con le forbici dell'iride dritte che si estendono lateralmente dalla linea mediana immediatamente sopra l'arto posteriore e sotto l'arto anteriore.
Utilizzare la pinza di Graefe per staccare la muscolatura addominale ed esporre i visceri peritoneali. Utilizzare un paio di pinze numero cinque per sollevare l'intestino dalla cavità viscerale per rivelare l'adiposo mesenterico. Usa le forbici curve e la pinza numero cinque per separare l'adiposo lungo il colon, partendo dal cieco fino a dove il colon scende dalla vista.
Quindi, separare l'adiposo lungo l'intestino tenue fino al pancreas. Rimuovere una piccola parte del pancreas per isolare completamente l'adiposo mesenterico. Conservare l'adiposo mesenterico isolato nel tampone HEPES sul ghiaccio.
Per isolare le arterie, trasferire prima il tessuto adiposo in un piatto di dissezione contenente 10 millilitri di tampone HEPES freddo. Sotto uno stereomicroscopio, posizionare il tessuto adiposo sottocutaneo per esporre la coppia di vene arteriose. Posizionare il tessuto adiposo viscerale per esporre la forma del cavolfiore e la rispettiva coppia di vene arteriose.
Utilizzare una pinza numero 55 per rimuovere con cura il parenchimale adiposo dall'arteria. Rimuovere piccoli pezzi di adiposo alla volta senza danneggiare la vascolarizzazione di interesse. Continuare fino a quando le arterie sono completamente prive di tessuto adiposo parenchimale.
Utilizzare una pinza numero cinque per trasferire le arterie pulite in un nuovo tubo con tampone HEPES fresco e tenere in ghiaccio fino al momento della digestione. In primo luogo, aggiungere un milligrammo ciascuno di dispase ed elastasi a un tubo micro centrifuga da due millilitri. Aggiungere due millilitri di soluzione di dissociazione, vortice e incubare a 37 gradi Celsius fino a completa dissoluzione.
Utilizzare la pinza numero cinque per trasferire le arterie pulite alle rispettive provette campione. Incubare i tubi a 37 gradi Celsius per un'ora con delicata agitazione per inversione ogni 10-15 minuti. Nel frattempo, aggiungere un milligrammo di collagenasi di tipo uno per campione alle nuove provette.
Dopo l'incubazione, lasciare che le arterie si depositino sul fondo del tubo e trasferiscano 500 microlitri del tampone dall'alto nei tubi contenenti collagenasi. Vortex e restituire questa soluzione alle rispettive provette di campionamento. Incubare i campioni a 37 gradi Celsius per 15 minuti.
Assicurarsi che le arterie si separino in pezzi agitando la provetta. Utilizzando una pipetta di vetro, triturare vigorosamente il tessuto digerito da 10 a 15 volte per dissociare meccanicamente le cellule. Far passare i campioni digeriti attraverso un filtro cellulare da 70 micron o un filtro a tubo per citometria a flusso per ottenere sospensioni a singola cellula.
Centrifugare la sospensione monocellulare e rimuovere il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in un millilitro di PBS con 5% BSA per 30 minuti. Aggiungere un microlitro di macchia di vitalità cellulare e incubare al buio per 30 minuti.
Centrifugare la sospensione cellulare e risospendere il pellet cellulare in 200 microlitri di PBS con 1% BSA. Aggiungere anticorpi primari coniugati a CD31 e CD45 e incubare su un bilanciere in frigorifero per 15 minuti. Lavare le cellule aggiungendo un millilitro di PBS con 1% BSA direttamente alla sospensione cellulare.
Centrifugare la sospensione cellulare e risospendere il pellet in 200 microlitri di 1% formaldeide con 0,1% BSA. Coprire i tubi con un foglio di alluminio e conservare in frigorifero fino al momento della citometria a flusso. I preparati cellulari ottenuti da arterie adipose sottocutanee digerite sono stati utilizzati per identificare le popolazioni di cellule endoteliali utilizzando la citometria a flusso.
Le cellule CD31 CD45 negative sono state identificate come cellule endoteliali. La colorazione di vitalità cellulare ha permesso l'identificazione solo di quelle cellule vitali che sono sopravvissute al protocollo di isolamento e digestione prima della fissazione. Per identificare le differenze nell'espressione proteica di membrana e nelle cellule endoteliali da distinte vascolarizzazione adiposa di deposito, le cellule isolate sono state sondate per la translocasi CD36 degli acidi grassi.
Le cellule endoteliali CD36 positive sono state identificate nell'adiposo sottocutaneo e mesenterico. La quantificazione dell'espressione di CD36 e delle cellule endoteliali sottocutanee e mesenteriche ha rivelato che sia la percentuale di cellule endoteliali che esprimono CD36 sia l'intensità dell'espressione di CD36 erano maggiori nelle cellule endoteliali sottocutanee. È fondamentale sezionare, identificare e pulire attentamente le arterie.
Ancora più importante, il protocollo di digestione dovrebbe produrre una resa sufficiente di cellule vitali per le applicazioni a valle. Seguendo questa procedura, la popolazione cellulare isolata può essere utilizzata per applicazioni che includono, ma non solo, elettrofisiologia, profilazione molecolare e generazione di linee cellulari primarie per lo screening di farmaci in vitro.
