Questo protocollo consente la differenziazione efficiente e riproducibile di adipociti bruni che esprimono fattori chiave di trascrizione adipogenica, marcatori adipocitari maturi e hanno un potenziale termogenico e un fenotipo morfologico degli adipociti bruni maturi. Si tratta di una procedura di differenziazione in due fasi semplice e replicabile per ottenere cellule con caratteristiche di adipociti bruni maturi da tessuto adiposo bruno interscapolare di topi neonati. Questo protocollo permette di studiare i meccanismi di attivazione del tessuto adiposo bruno come bersaglio per il trattamento dell'obesità.
È stato un modello per determinare i meccanismi coinvolti nella fisiopatologia della lipodistrofia. L'esecuzione di questa tecnica per la prima volta dovrebbe essere impegnativa. È essenziale avere un protocollo dettagliato e sottolineare i punti critici per avere risultati di successo.
Per iniziare, posiziona il topo soppresso in posizione prona e fai un'incisione cutanea lunga un centimetro a metà della schiena dell'animale usando forbici affilate. Rimuovere la pelle con cura, staccare chirurgicamente l'iBAT dalla carcassa utilizzando piccole forbici. Raccogli entrambi i lobi iBAT usando una pinza a punta curva per rimuovere i lobi in modo indipendente.
Mettere i due lobi in una provetta di plastica con 1,5 millilitri di PBS sterile a temperatura ambiente. Incubare i tessuti iBAT in tampone digestivo collagenasi di tipo due per 45 minuti a 37 gradi Celsius con agitazione delicata continua a 800 giri/min. Interrompere meccanicamente la sospensione tissutale nel tampone di digestione collagenasi di tipo 2 pipettando su e giù utilizzando una micropipetta P1000 e puntali filtranti.
Utilizzare una nuova punta per ogni campione. Passare i tessuti desegregati attraverso singoli filtri cellulari da 100 micrometri in nuove provette da 1,5 millilitri. Aggiungere 500 microlitri di tampone ACK ai campioni di tessuto filtrati.
Capovolgere le provette quattro o cinque volte e incubare a temperatura ambiente per quattro minuti. Quindi passare le sospensioni attraverso un filtro cellulare da 40 micrometri in nuove provette da 1,5 millilitri utilizzando una micropipetta P1000 e puntali filtrati. Centrifusion rimette in sospensione il pellet come descritto nel manoscritto del testo.
Quindi seminare ogni campione in sei pozzetti di una piastra di coltura a 24 pozzetti aggiungendo un millilitro della sospensione a ciascun pozzetto. I preadipociti indifferenziati presentavano livelli molto bassi o non rilevabili di ppar-gamma, C/ebp-alfa, perilipina 1 e CD36. Al contrario, questi marcatori erano significativamente più alti il settimo giorno di differenziazione.
L'accumulo di più goccioline lipidiche nei preadipociti bruni era coerente con i risultati precedentemente pubblicati. Un aumento significativo è stato osservato nel marcatore di massa mitocondriale TOM 20 e nei livelli proteici del complesso di fosforilazione ossidativa al settimo giorno di differenziazione. UCP1, un marcatore autentico di questo tipo di cellule, non è stato rilevato nei preadipociti indifferenziati, mentre è stato sostanzialmente espresso negli adipociti bruni maturi al settimo giorno di differenziazione.
I mitocondri si sono evoluti da una forma tubolare allungata al giorno zero a una forma arrotondata o simile a un fagiolo al settimo giorno. Anche la struttura interna mitocondriale è stata modificata dall'adipogenesi, con conseguente maggiore densità delle cristae impacchettate parallelamente. È importante sottolineare che i mitocondri erano intimamente associati alle goccioline lipidiche negli adipociti bruni differenziati, quindi non è stato possibile rilevare alcuna distanza distinguibile tra la membrana esterna dei mitocondri e le superfici delle goccioline lipidiche, anche con la microscopia elettronica a trasmissione ad alta risoluzione.
La rimozione chirurgica del tessuto adiposo interscapolare è fondamentale. Una quantità inefficiente di tessuto limita la disponibilità di cellule che verranno differenziate. Questa tecnica di imaging aiuta a caratterizzare la morfologia degli adipociti bruni differenziati in vitro.
È possibile eseguire saggi per la funzione mitocondriale, l'attivazione beta androgenica e l'inibizione autofagica.
