Questo lavoro è stato supportato da un premio per l'innovazione e lo sviluppo tecnologico del Center for the Development of Therapeutics presso il Broad Institute del MIT e di Harvard. Gli autori desiderano ringraziare i membri del senior leadership team e il comitato di revisione per il loro sostegno a questo lavoro.

Tutte le proteine sono risultate sovraespresse in E.coli con buona resa e purezza (>80%) seguendo i protocolli di letteratura18. La biotinilazione è stata effettuata utilizzando una reazione catalizzata da BirA18. Tutte le piccole molecole sono state preparate in soluzioni madre da 1 mM in DMSO al 100%. Le procedure qui descritte non richiedono attrezzature di sicurezza o precauzioni di laboratorio specializzate. Devono essere utilizzati dispositivi di protezione individuale (DPI) standard da laboratorio (ad es. camice da laboratorio, occhiali di sicurezza e guanti).
Le proteine applicate in questo studio sono elencate di seguito: VHL: complesso biotinilato VHL(53-213)/ElonginB (1-104)/ElonginC(17-112) con Avi-tag all'estremità C di ElonginB. Brd4BD2: Brd4BD2 senza tag (333-460) CRBN: CRBN biotinilato (319-442) con Avi-tag all'estremità N PPM1D: PPM1D(1-420) senza tag o con doppio tag His8 all'estremità N
Le piccole molecole applicate in questo studio sono elencate di seguito: MZ1 (MW = 1002.6 Da): PROTAC che si lega a VHL e Brd4BD2 BRD-2512 (MW = 841.4 Da): CRBN KD ~3 μM, non si lega a PPM1D BRD-5110 (MW = 872.0 Da): CRBN K D ~3 μM, PPM1D KD = 1-2 nM BRD-4761 (MW = 476.6 Da): non si lega a CRBN, PPM1D KD = 1-2 nM
1. Metodo 1: ITC (calorimetria isotermica di titolazione)
NOTA: Le titolazioni vengono eseguite utilizzando un microcalorimetro con autoiniezione.
<ol><li>Preparazione del tampone: Preparare 3 L di tampone contenente 20 mM di HEPES, 150 mM di NaCl, 1 mM di TCEP, pH 7,5.</li>
	<li>Dialisi: Dializzare VHL e Brd4BD2 (~ 500 μL a 150 μM ciascuno) rispetto a 1 L del tampone preparato nella fase 1.1, 3 volte a 4 °C, rispettivamente per 4 ore, 2 ore e circa 16 ore. Conservare il tampone dopo l'ultima dialisi per utilizzarlo nelle fasi successive.</li>
	<li>Preparare i campioni su una piastra a 96 pozzetti con un coperchio di plastica.<ol><li>Per ogni titolazione, preparare 400 μL di soluzione per la cella, 125 μL per la siringa e 400 μL di tampone per la pulizia. Aggiungere i campioni a tre pozzetti consecutivi sulla piastra. Poiché il brodo composto viene preparato a 1 mM in DMSO al 100%, aggiungere la stessa percentuale di DMSO alle soluzioni proteiche per garantire il tampone corrispondente nella cellula e nella siringa. Aggiungere il 2% di DMSO alle soluzioni finali.<ol><li>Campione per la titolazione di VHL in MZ1: Preparare una soluzione cellulare contenente 392 μL di tampone, 4 μL di MZ1 a 1 mM (concentrazione finale di 10 μM) e 4 μL di DMSO al 100%. Preparare una soluzione siringa contenente 122,5 μL di VHL a 85,7 μM, 2,5 μL di DMSO al 100% (concentrazione finale 84 μM).</li>
			<li>Campioni per la titolazione di VHL nel tampone (i dati saranno utilizzati per la sottrazione di fondo dei dati generati dal campione 1.3.1.1): Preparare una soluzione cellulare contenente 392 μL di tampone, 8 μL di DMSO al 100%. Preparare una soluzione siringa contenente 122,5 μL di VHL a 85,7 μM (concentrazione finale di 84 μM) e aggiungere 2,5 μL di DMSO al 100%.</li>
			<li>Campioni per la titolazione di VHL in MZ1 e Brd4 BD2: Preparare una soluzione cellulare contenente 392 μL di 17,1 μM Brd4BD2 (concentrazione finale 16,8 μM), 3,36 μL di MZ1 a 1 mM (concentrazione finale 8,4 μM) e 4,64 μL di DMSO al 100%. Preparare una soluzione siringa contenente 122,5 μL di VHL a 85,7 μM (concentrazione finale di 84 μM) e 2,5 μL di DMSO al 100%.</li>
			<li>Campioni per la titolazione di VHL in Brd4 BD2 (sfondo di 1.3.1.3): Preparare una soluzione cellulare contenente 392 μL di 17,1 μM Brd4BD2 (concentrazione finale 16,8 μM) e 8 μL di DMSO al 100%. Preparare una soluzione siringa contenente 122,5 μL di VHL a 85,7 μM (concentrazione finale di 84 μM) e 2,5 μL di DMSO al 100%.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Eseguire tutte e quattro le titolazioni sul microcalorimetro. Ciascuna consiste in 19 iniezioni di soluzione siringa da 2 μL alla velocità di 2 μL/s a intervalli di tempo di 120 s. Effettuare un'iniezione iniziale di proteina (0,4 μL) e scartarla durante l'analisi dei dati. Eseguire tutti gli esperimenti a 25 °C, agitando a 600 giri/min.</li>
	<li>Analisi dei dati: adattare i dati a un modello a singolo sito di legame per ottenere la stechiometria (n), la costante di dissociazione (KD) e l'entalpia di legame (ΔH) utilizzando il software di analisi fornito dal produttore (Figura 2).</li>
</ol>2. Metodo 2: BLI (interferometria a biostrato)
<ol><li>Eseguire esperimenti BLI utilizzando sensori rivestiti di streptavidina (SA) a temperatura ambiente (RT) con una velocità di acquisizione di 5 Hz. Durante l'esperimento BLI automatizzato, assicurarsi che i sensori siano stazionari all'interno di una singola colonna e che si muovano tra le diverse colonne di una piastra nera a fondo piatto a 96 pozzetti con un volume massimo di 392 μL. Riempire ogni pozzetto della piastra utilizzata nell'esperimento con 200 μL di soluzione. NOTA: BLI è utile solo per rilevare le interazioni proteina-proteina (cioè la formazione di complessi ternari). Non è abbastanza sensibile da rilevare le interazioni tra proteine e piccole molecole.<ol><li>Preparazione del tampone: Preparare 100 mL di tampone contenente 20 mM di HEPES, 150 mM di NaCl, 1 mM di TCEP, 0,05% di P20, pH 7,5.</li>
		<li>Ottimizzazione per la fase di immobilizzazione: Caricare il sensore di prova a 1-3 nm, come raccomandato dal produttore. Per le procedure qui descritte viene utilizzato un carico di ~1,0 nm. A tale scopo, immergere il sensore in una soluzione contenente VHL a 1,5 μg/mL per 80 s.</li>
		<li>Eseguire misure cinetiche BLI applicando sette sensori SA utilizzando la seguente sequenza:<ol><li>Per la prima fase di base, immergere nel buffer per 60 s.</li>
			<li>Per la fase di immobilizzazione, immergere in una soluzione di VHL a 1,5 μg/mL per 80 s.</li>
			<li>Per la seconda fase di base, immergere nel buffer per 60 s.</li>
			<li>Per la fase di associazione, immergere in soluzione una concentrazione fissa di Brd4BD2 a 2 μM, una concentrazione fissa di DMSO al 2% e concentrazioni variabili di MZ1 a 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12,5 nM, 6,3 nM, 3,1 nM e 0 nM (sensore di riferimento) per 300 s.</li>
			<li>Per la fase di dissociazione, immergere nel tampone per 600 s.</li>
		</ol></li>
		<li>Eseguire l'analisi dei dati utilizzando il software del produttore. k on, k off e kD sono riportati per l'adattamento dei dati (Figura 3).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Metodo 3: SPR (risonanza plasmonica di superficie)
NOTA: Tutti gli esperimenti SPR vengono eseguiti utilizzando chip sensore rivestiti di streptavidina (SA) a RT. Sebbene il chip NTA sia utilizzato per la rilevazione tra proteine e piccole molecole, deve essere utilizzato con cautela quando viene applicato al complesso ternario, poiché si osserva un fondo molto più alto rispetto al chip SA, probabilmente a causa delle interazioni elettrostatiche tra la superficie del chip caricato e la proteina nell'analita.
<ol><li>SPR per l'interazione VHL-MZ1<ol><li>Preparazione del tampone.<ol><li>Preparare un tampone da 1 L contenente 20 mM di HEPES, 150 mM di NaCl, 1 mM di TCEP, 0,005% P20, pH7,5 e farlo passare attraverso un'unità filtrante da 0,2 μm.</li>
			<li>Rimuovere 20 mL di tampone per un uso futuro (tampone privo di DMSO) e riempire con 20 mL di DMSO (2% di DMSO nel tampone finale in esecuzione). Mantenere il DMSO al 2% in tutti i campioni descritti di seguito (passaggi 3.1 e 3.2)</li>
		</ol></li>
		<li>Attivare il chip SA seguendo il protocollo del produttore e immobilizzare VHL a ~2000 RU (iniettare una soluzione proteica di 5 μg/mL a 5 μL/min).</li>
		<li>Preparare MZ1 in una diluizione seriale a 8 punti a 3 punti con la concentrazione massima a 10 μM su una piastra in polipropilene traslucido a fondo conico a 384 pozzetti con un volume massimo di 130 μL. Coprire la piastra con fogli di plastica autoadesivi, trasparenti compatibili con micropiastre in polipropilene.<ol><li>Preparare la concentrazione massima con il tampone privo di DMSO per garantire il 2% di DMSO alla concentrazione finale. A 147 μL di tampone privo di DMSO, aggiungere 1,5 μL di MZ1 stock a 1 mM e 1,5 μL di DMSO al 100%.</li>
			<li>Preparare la diluizione seriale a 3 pieghe con il tampone in esecuzione contenente il 2% di DMSO. A 100 μL del tampone corrente, aggiungere 50 μL di soluzione alla concentrazione massima preparata al punto 3.1.3.1 e mescolare bene per preparare la 2aconcentrazione più alta .</li>
			<li>Quindi trasferire 50 μL della soluzione preparata al punto 3.1.3.2 ai successivi 100 μL di tampone corrente, mescolare bene per preparare la 3aconcentrazione più alta e così via.</li>
		</ol></li>
		<li>Eseguire SPR utilizzando la configurazione multiciclo: Modalità: Alte prestazioni; tempo di contatto: 120 s; tempo di dissociazione: 300 s; portata: 50 μL/min.</li>
		<li>Eseguire l'analisi dei dati utilizzando il software di valutazione fornito dal produttore dello strumento. L'analisi allo stato stazionario ha indicato K,D = 26 (± 3) nM e Rmax di ~91% (± 5%) di legame raggiunto (Figura 4A)</li>
	</ol></li>
	<li>SPR per VHL: MZ1: complesso ternario Brd4BD2<ol><li>Preparare il tampone come descritto al punto 3.1.1.</li>
		<li>Attivare il chip SA seguendo il protocollo del produttore e immobilizzare VHL a ~100 RU. Iniettare una soluzione proteica di 0,5 μg/mL VHL a una velocità di flusso di 5 μL/min e un tempo di contatto compreso tra 1-5 min fino a raggiungere una densità superficiale di ~100 RU.</li>
		<li>Preparare i campioni per due iniezioni a ciclo singolo a 5 punti in una piastra a fondo rotondo in polistirene trasparente a 96 pozzetti con un volume massimo di 323 μL e coprirla con fogli di plastica autoadesivi, trasparenti, compatibili con le micropiastre in polistirene come descritto nelle fasi da 3.2.3.1 a 3.2.3.2.<ol><li>Controllo negativo: l'analita contiene solo Brd4BD2 .<ol><li>Preparare la concentrazione massima a 25 μM in tampone di funzionamento con un volume di 200 μL (#A5)</li>
				<li>Aggiungere 160 μL ciascuno di Brd4BD2 a 2 μM nel buffer di funzionamento ai successivi 4 pozzetti a sinistra (#A1-A4)</li>
				<li>Trasferire 40 μL da A5 ad A4. Mescolare bene.</li>
				<li>Trasferire 40 μL di A4 in A3. Mescolare bene. Continuate così fino ad A1.</li>
			</ol></li>
			<li>Formazione di complessi ternari: l'analita contiene MZ1 e Brd4BD2.<ol><li>Preparare la concentrazione massima aggiungendo 4 μL di MZ1 a 20 μM in soluzione di DMSO al 100% a 196 μL contenenti 25,5 μM di Brd4BD2 in tampone privo di DMSO (#B5). Le concentrazioni finali sono 25 μM Brd4BD2, 100 nM MZ1 e 2% DMSO.</li>
				<li>Aggiungere 160 μL ciascuno di Brd4BD2 a 2 μM nel tampone di funzionamento ai successivi 4 pozzetti a sinistra (#B1-B4)</li>
				<li>Trasferire 40 μL di B5 a B4. Mescolare bene.</li>
				<li>Trasferire 40 μL di B4 a B3. Mescolare bene. Continuate così fino a B1.</li>
			</ol></li>
		</ol></li>
		<li>Eseguire SPR utilizzando la configurazione a ciclo singolo: Tempo di contatto: 100 s; tempo di dissociazione: 720 s; portata: 50 μL/min. Applicare tre iniezioni di tampone prima di ogni campione per garantire uno sfondo stabile.</li>
		<li>Analisi dei dati: applicare la terza iniezione del buffer come sfondo per la sottrazione. Come controllo negativo, quando MZ1 non è presente, la risposta SPR tra VHL e Brd4BD2 è trascurabile. Quando MZ1 è presente, l'adattamento cinetico indica che l'interazione tra VHL e il complessoBD2 MZ1-Brd4 ha k on = 7.9 (± 1.5) *107 /M/s, koff = 0.014 s-1 e KD = 1 nM. (Figura 4B)</li>
	</ol></li>
	<li>SPR per CRBN e interazioni con piccole molecole<ol><li>Preparazione del tampone.<ol><li>Preparare un tampone da 1 L contenente 50 mM Tris, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl 2, 0,5 mM TCEP, 0,005% P20, pH 7,5 e farlo passare attraverso un'unità filtro da0,2 μm.</li>
			<li>Rimuovere 20 mL di tampone e rabboccare 20 mL di DMSO al 100% (2% di DMSO nel tampone finale in esecuzione). È importante mantenere il DMSO al 2% in tutti i campioni descritti di seguito (passaggi 3.3, 3.4 e 3.5).</li>
		</ol></li>
		<li>Attivare il chip SA seguendo il protocollo del produttore e immobilizzare CRBN a ~800 RU.</li>
		<li>Preparare i composti in diluizione seriale a 3 punte e 6 punti su una piastra da 384 pozzetti con una concentrazione massima di 30 μM, come descritto al punto 3.1.3.</li>
		<li>Eseguire SPR utilizzando la configurazione multiciclo: Modalità: Alte prestazioni, tempo di contatto: 60 s, tempo di dissociazione: 90 s; portata: 50 μL/min. Per questo sistema, tre iniezioni di tampone sono sufficienti per ottenere un fondo stabile. Per altri sistemi di analisi, potrebbe essere necessario eseguire ulteriori iniezioni di tampone.</li>
		<li>Eseguire l'analisi dei dati utilizzando il software del produttore. NOTA: L'analisi allo stato stazionario indica cheK D di BRD-2512 e BRD-5110 sono entrambi intorno a 3 μM. Tuttavia, il legame ha raggiunto solo ~ 70% di legamemassimo R alla concentrazione massima. Sia la debole affinità che la forma del sensorgram indicano che è probabile che si verifichi l'insolubilità del composto ad alte concentrazioni. Pertanto, il KD effettivo potrebbe essere superiore a 3 μM. BRD-4761, che non si lega al CRBN, è stato incluso come controllo negativo.</li>
	</ol></li>
	<li>SPR per PPM1D e interazioni con piccole molecole<ol><li>Preparare il buffer come descritto al punto 3.3.1. Utilizzare un chip sensore di acido nitriloacetico (NTA).</li>
		<li>Applicare a ciclo singolo perché la testata PPM1D ha un kacceso e kspento lento. Rigenerare il chip NTA utilizzando la configurazione predefinita del produttore e immobilizzare PPM1D a ~ 1000 RU dopo ogni iniezione di composto (iniettare una soluzione proteica di 5 μg/mL a 5 μL/min).</li>
		<li>Preparare i composti in diluizione seriale a 5 punti con la concentrazione massima a 400 nM come descritto al punto 3.1.3.</li>
		<li>Eseguire SPR utilizzando la configurazione a ciclo singolo: Modalità: ad alte prestazioni; tempo di contatto: 90 s; tempo di dissociazione: 600 s; portata: 50 μL/min. Applicare tre iniezioni di tampone prima di ogni composto per garantire uno sfondo stabile.</li>
		<li>Analisi dei dati. Applicare la terza iniezione del tampone come sfondo per la sottrazione. Come controllo negativo, BRD-2512 non mostra legame con PPM1D. Per BRD-4761 e BRD-5110, il montaggio cinetico indicava che il KD per entrambi era 1-2 nM.</li>
	</ol></li>
	<li>SPR per CRBN:PROTAC: complesso ternario PPM1D<ol><li>Preparare il buffer come descritto al punto 3.3.1.</li>
		<li>Attivare il chip SA seguendo il protocollo del produttore e immobilizzare CRBN a ~35 RU (iniettare una soluzione proteica di 0,5 μg/mL a 5 μL/min).</li>
		<li>Preparare tre composti in diluizione seriale a 6 punti con una concentrazione massima di 30 μM mantenendo [PPM1D] a 1 μM in tutti i campioni, compresi i bianchi, utilizzando il metodo descritto al punto 3.2.3.</li>
		<li>Eseguire SPR utilizzando la configurazione multiciclo: Modalità: Alte prestazioni; tempo di contatto: 60 s; tempo di dissociazione: 90 s; portata: 50 μL/min.</li>
		<li>Eseguire l'analisi dei dati utilizzando il software del produttore. NOTA: Mentre BRD-2512 e BRD-4761 mostrano una risposta assente o trascurabile, BRD-5110 mostra chiaramente l'"effetto gancio" allo stato stazionario con cinetica on/off rapida (Figura 5A-C). La risposta di legame sperimentale di BRD-5110 (Figura 5C) è intermedia tra la risposta prevista dalla simulazione quando si assume che K D (CRBN, cpd) sia di 3 o 10 μM (Figura 5E), suggerendo che il K D ternario e il KD binario sono molto simili. Non c'è apparente cooperatività di PPM1D: BRD-5110: formazione del complesso CRBN.</li>
	</ol></li>
</ol>

Caratterizzazione della formazione di complessi ternari in PROTAC mediante saggi biofisici

<ol>
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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+PROTAC+cooperative+recognition+for+selective+protein+degradation.">Structural basis of PROTAC cooperative recognition for selective protein degradation.</a> Nature Chemical Biology. 13 (5), 514-521 (2017).</li><li>Nahta, R., Castellino, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatase+magnesium-dependent+1+&#948;+(PPM1D),+serine/threonine+protein+phosphatase+and+novel+pharmacological+target+in+cancer.">Phosphatase magnesium-dependent 1 &#948; (PPM1D), serine/threonine protein phosphatase and novel pharmacological target in cancer.</a> Biochemical Pharmacology. 184, 114362 (2021).</li><li>Douglass, E. F., Miller, C. J., Sparer, G., Shapiro, H., Spiegel, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+mathematical+model+for+three-body+binding+equilibria.">A comprehensive mathematical model for three-body binding equilibria.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (16), 6092-6099 (2013).</li><li>Zorba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delineating+the+role+of+cooperativity+in+the+design+of+potent+PROTACs+for+BTK.">Delineating the role of cooperativity in the design of potent PROTACs for BTK.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (31), E7285-E7292 (2018).</li><li>Fairhead, M., Howarth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+biotinylation+of+purified+proteins+using+BirA.">Site-specific biotinylation of purified proteins using BirA.</a> Methods in Molecular Biology. 1266, 171-184 (2015).</li><li>Nowak, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+in+binding+confers+selectivity+in+ligand-induced+protein+degradation.">Plasticity in binding confers selectivity in ligand-induced protein degradation.</a> Nature Chemical Biology. 14 (7), 706-714 (2018).</li></ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti o altri conflitti di interesse.

La caratterizzazione biofisica delle interazioni binarie e ternarie tra le molecole PROTAC e i loro partner di legame proteico può fornire informazioni uniche e complementari relative a sistemi cellulari ampiamente utilizzati. Comprendere l'affinità tra ciascuna testata di una molecola PROTAC e i suoi partner di legame proteico può aiutare a guidare gli sforzi della chimica farmaceutica verso l'ottimizzazione di tali interazioni. Strutture cristalline di complessi ternari PROTAC pubblicate in precedenza hanno rivelato...

La poliubiquitinazione delle proteine nella cellula è un processo strettamente regolato che coinvolge gli enzimi della famiglia delle ubiquitina ligasi 1,2. Gli enzimi terminali nella via sono le ubiquitina ligasi E3 che legano covalentemente le molecole di ubiquitina ai loro partner che legano le proteine3. La poliubiquitinazione di questi partner di legame proteico li indirizza alla degradazione proteolitica da parte del proteasoma4. Questo sistema fa parte del processo di omeostasi proteica che è stato sfruttato terapeuticamente per indurre la degradazione delle proteine coinvolte nella malattia5. Le piccole molecole che inducono l'interazione tra le ubiquitina ligasi E3, come la ligasi E3 di Von Hippel-Lindau (VHL) o il cereblon (CRBN), sono tipicamente composte da una testata legante la ligasi E3 collegata da un linker flessibile a una testata che si lega alla proteina bersaglio per la degradazione. Queste molecole eterobifunzionali sono comunemente indicate come chimere mirate alla proteolisi o PROTACS6.
Lo sviluppo di PROTACS comporta la valutazione della capacità delle molecole di indurre la degradazione delle proteine nelle cellule. Sono stati sviluppati molti sistemi di saggi cellulari che monitorano l'interazione indotta tra la proteina bersaglio e i componenti della ligasi E3, come VHL o CRBN, dopo il trattamento delle cellule con una molecola PROTAC. Uno di questi saggi cellulari, il sistema nanoluc-Halotag7, coinvolge una ligasi E3 fusa all'accettore Halotag e una proteina bersaglio marcata con un donatore nanoluc. La formazione del complesso ternario porta il donatore di nanoluc e l'accettore di Halotag in prossimità, consentendo il trasferimento di energia dal donatore all'accettore con conseguente emissione di luce. Le variazioni di questo sistema possono essere utilizzate per valutare la permeabilità cellulare delle molecole PROTACS8 o i cambiamenti nel livello relativo di ubiquitinazione della proteina bersaglio9. Mentre questi sistemi cellulari sono essenziali per guidare l'ottimizzazione di PROTACS, la formazione di complessi tra le ligasi E3 e le proteine mirate alla degradazione è un processo a più fasi10,11. La cinetica e la termodinamica delle interazioni binarie e ternarie coinvolte contribuiscono all'ubiquitinazione dell'efficienza e alla conseguente degradazione della proteina12,13,14.
Di seguito sono descritti protocolli che possono essere adattati per la caratterizzazione biofisica della formazione di complessi ternari indotti da PROTACS utilizzando la risonanza plasmonica di superficie (SPR), l'interferometria del biostrato (BLI) e la calorimetria di titolazione isotermica (ITC). I protocolli SPR e ITC per la molecola MZ1 PROTAC che induce la formazione di complessi ternari tra Brd4,BD2 e VHL derivati dai rapporti di letteratura13,15 e qui descritti sono stati in grado di ricapitolare i risultati riportati con alcune modifiche alle procedure riportate, che verranno discusse. In questo rapporto è inclusa una descrizione di un saggio BLI utilizzato per valutare la formazione di complessi ternari tra MZI, Brd4BD2 e VHL. Le misurazioni dell'affinità da BLI sono risultate coerenti con quelle osservate in SPR e ITC. Viene inoltre descritto un protocollo precedentemente pubblicato in cui è stato sviluppato un saggio SPR per valutare la formazione di complessi ternari indotti da PROTAC tra PPM1D, una proteina fosfatasi Ser/Thr la cui espressione è indotta in modo p53-dipendente16, e CRBN. In questo caso, la molecola PROTAC ha un'affinità nanomolare per PPM1D ma solo un'affinità micromolare per CRBN. In questo caso, il legame della molecola PROTAC al CRBN non è saturabile, con conseguente "effetto gancio" comunemente osservato. L'effetto gancio è una proprietà di tre sistemi di corpi in cui ci sono due specie che possono formare un complesso eterotrimerico quando entrambe sono legate a una molecola ponte (Figura 1)17. L'effetto gancio si osserva quando la specie ponte è in concentrazione eccessiva rispetto alle altre due specie. Lo stato risultante è quello in cui le interazioni binarie superano le interazioni ternarie. I sistemi in cui si osserva l'effetto gancio richiedono specifiche considerazioni di progettazione sperimentale discusse in questo rapporto. Vengono forniti i concetti generali e i requisiti dei reagenti per la valutazione dell'utilizzo di saggi biofisici per la valutazione della formazione di complessi ternari indotti da PROTAC.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655076</td>
			<td>flat-bottom, black plates used In BLI experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>73520-120</td>
			<td>Plate use for ITC sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>650101</td>
			<td>Plate used to prepare samples for SPR experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auto iTC200 micro-calorimeter</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Instrument used to perform ITC experiments. Product discontinued.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biacore S200</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29136649</td>
			<td>Instrument used to perform SPR experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MZ1</td>
			<td>ProbeChem</td>
			<td>PC-60099</td>
			<td>PROTAC that binds to VHL and Brd4BD2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA sensor chip</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>BR100532</td>
			<td>SPR chip used to perform SPR experiments involving PPM1D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octet Red-384</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td></td>
			<td>Instrument used to perform BLI experiments. Product discontinued.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate cover</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>PQA0001</td>
			<td>Cover for Nunc 96-well plate (73520-120)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate cover</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28975816</td>
			<td>Plate cover for Greiner plate (650101)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Series S SA sensor chip</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>BR100531</td>
			<td>SPR chip used to perform SPR experiments involving MZ1:VHL:BRD4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin (SA) Dip and Read Biosensors</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>18-509</td>
			<td>Coated sensors used in BLI experiments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the development and application of biophysical assays for evaluating ternary complex formation induced by proteolysis targeting chimeras (protacs)

Le ligasi E3 e le proteine bersaglio della degradazione possono essere indotte a formare complessi da molecole eterobifunzionali in un processo a più fasi. La cinetica e la termodinamica delle interazioni coinvolte contribuiscono all'efficienza dell'ubiquitinazione e alla conseguente degradazione della proteina. Le tecniche biofisiche come la risonanza plasmonica di superficie (SPR), l'interferometria del biostrato (BLI) e la calorimetria di titolazione isotermica (ITC) forniscono informazioni preziose che possono essere utilizzate nell'ottimizzazione di tali interazioni. Utilizzando due sistemi modello, è stato stabilito un kit di strumenti di analisi biofisica per comprendere la cooperatività della formazione di complessi ternari e l'impatto dell'"effetto gancio" sulla cinetica di legame. In un caso, è stata valutata una molecola di chimera mirata alla proteolisi (PROTAC) che induce la formazione di complessi ternari tra Brd4BD2 e VHL. La molecola eterobifunzionale, MZ1, ha affinità nM sia per la proteina Brd4BD2 (SPR K D = 1 nM, ITC K D = 4 nM) che per il complesso VHL (SPR K D = 29 nM, ITC K D = 66 nM). Per questo sistema, sono stati sviluppati robusti saggi SPR, BLI e ITC che hanno riprodotto i risultati pubblicati che dimostrano la cooperatività della formazione di complessi ternari. Nell'altro caso, è stata studiata una molecola che induce complessi ternari tra una proteina da 46,0 kDa, PPM1D, e il cereblon [CRBN (319-442)]. La molecola eterobifunzionale, BRD-5110, ha un SPR K D = 1 nM per PPM1D ma un legame molto più debole contro il complesso CRBN troncato (319-442) (SPR KD = ~ 3 μM). In quel caso, il legame per CRBN in SPR non era saturabile, determinando un "effetto gancio". Sono stati valutati i requisiti di produttività e reagenti per SPR, BLI e ITC e sono state fornite raccomandazioni generali per la loro applicazione ai progetti PROTAC.

The polyubiquitination of proteins in the cell is a tightly regulated process that involves enzymes in the Ubiquitin Ligase family1,2. The terminal enzymes in the pathway are the E3 ubiquitin ligases that covalently attach ubiquitin molecules to their protein-binding partners3. The polyubiquitination of those protein binding partners targets them for proteolytic degradation by the proteasome4. This system is part of the protein homeostasis process that has been therapeutically leveraged to induce the degradation of proteins involved in disease5. Small molecules that induce the interaction between E3 ubiquitin ligases, such as Von Hippel-Lindau E3 ligase (VHL) or cereblon (CRBN), are typically composed of an E3 ligase binding warhead connected by a flexible linker to a warhead that binds to the protein being targeted for degradation. These heterobifunctional molecules are commonly referred to as proteolysis targeting chimeras or PROTACS6.
The development of PROTACS involves evaluating the ability of molecules to induce the degradation of proteins in cells. Many cellular assay systems have been developed that monitor the induced interaction between the target protein and E3 ligase components, such as VHL or CRBN, upon treatment of the cells with a PROTAC molecule. One such cellular assay, the nanoluc-Halotag system7, involves an E3 ligase fused to the Halotag acceptor and a target protein tagged with a nanoluc donor. Ternary complex formation brings the nanoluc donor and Halotag acceptor into proximity allowing the transfer of energy from the donor to the acceptor resulting in the emission of light. Variations of this system can be used to assess the cellular permeability of PROTACS molecules8 or changes in the relative level of target protein ubiquitination9. While these cellular systems are essential for driving the optimization of PROTACS, the formation of complexes between E3 ligases and proteins targeted for degradation is a multi-step process10,11. The kinetics and thermodynamics of the binary and ternary interactions involved contribute to efficiency ubiquitination and resulting degradation of the protein12,13,14.
Herein are described protocols that can be adapted for the biophysical characterization of ternary complex formation induced by PROTACS using surface plasmon resonance (SPR), biolayer interferometry (BLI), and isothermal titration calorimetry (ITC). SPR and ITC protocols for the MZ1 PROTAC molecule that induces ternary complex formation between Brd4BD2 and VHL derived from literature reports13,15 and described here were able to recapitulate the reported results with some modification of the reported procedures, which will be discussed. A description of a BLI assay used to evaluate ternary complex formation between MZI, Brd4BD2, and VHL is included in this report. Affinity measurements from BLI were consistent with those observed in SPR and ITC. A previously published protocol in which an SPR assay was developed for assessing the PROTAC-induced ternary complex formation between PPM1D, a Ser/Thr protein phosphatase whose expression is induced in a p53-dependent manner16, and CRBN is also described. In this instance, the PROTAC molecule has a nanomolar affinity for PPM1D but only a micromolar affinity for CRBN. In this case, the binding of the PROTAC molecule to CRBN is not saturable, resulting in the commonly observed &#34;hook effect&#34;. The hook effect is a property of three body systems in which there are two species that can form a heterotrimeric complex when both are bound to a bridging molecule (Figure 1)17. The hook effect is observed when the bridging species is in excess concentration relative to the two other species. The resulting state is one in which the binary interactions outcompete the ternary interactions. The systems where the hook effect is observed require specific experimental design considerations discussed in this report. General concepts and reagent requirements for evaluating the utilization of biophysical assays for the evaluation of PROTAC-induced ternary complex formation are provided.

Autore in primo piano: Valutazione di saggi biofisici per la caratterizzazione dei complessi ternari PROTACS 

Lo sviluppo e l'applicazione di saggi biofisici per la valutazione della formazione di complessi ternari indotti da chimere mirate alla proteolisi (PROTACS)

Our research focuses on replicating established model systems, validating them through additional assays and adapting these methodologies to suit our specific research context. We aim to demonstrate a versatile approach that can be applied to various projects. The current experimental challenge, licensing strategically selecting the appropriate assay format and conditions based on project specific requirements and existing knowledge gaps.This is essential for achieving efficient and accurate answers in our experiments. Our protocol provides a streamlined approach for seamless adaption to various ProTech systems. Furthermore, we conduct a thorough evaluation of each method, highlighting their respective pros and cons.We offer informed instructions on choosing the most suitable format based on specific conditions.

La caratterizzazione del complesso binario VHL: MZ1 e del complesso ternario VHL: MZ1: Brd4BD2 può essere trovata nella Figura 2 (ITC), nella Figura 3 (BLI) e nella Figura 4 (SPR) utilizzando un buffer molto simile. Il KD estratto dai saggi ortogonali è coerente. La cooperatività può essere calcolata con K D (binario) / KD (ternario), che è molto positivo (15 da ITC o 26 da SPR).
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Qui descriviamo i protocolli per la caratterizzazione biofisica della formazione di complessi ternari indotti da chimere mirate alla proteolisi (PROTACS) che coinvolgono le ubiquitina ligasi Von Hippel-Lindau E3 ligasi (VHL) e Cereblon (CRBN). I metodi biofisici qui illustrati includono la risonanza plasmonica di superficie (SPR), l'interferometria del biostrato (BLI) e la calorimetria di titolazione isotermica (ITC).

E3 ligases and proteins targeted for degradation can be induced to form complexes by heterobifunctional molecules in a multi-step process. The kinetics ...

La nostra ricerca si concentra sulla replica di sistemi modello consolidati, sulla loro validazione attraverso saggi aggiuntivi e sull'adattamento di queste metodologie per adattarsi al nostro specifico contesto di ricerca. Il nostro obiettivo è quello di dimostrare un approccio versatile che può essere applicato a vari progetti. L'attuale sfida sperimentale, la selezione strategica delle licenze del formato e delle condizioni di analisi appropriate in base ai requisiti specifici del progetto e alle lacune di conoscenza esistenti.Questo è essenziale per ottenere risposte efficienti e accurate nei nostri esperimenti. Il nostro protocollo fornisce un approccio semplificato per un adattamento senza soluzione di continuità ai vari sistemi ProTech. Inoltre, conduciamo una valutazione approfondita di ogni metodo, evidenziandone i rispettivi pro e contro.Offriamo istruzioni informate sulla scelta del formato più adatto in base alle condizioni specifiche.

the-development-application-biophysical-assays-for-evaluating-ternary

Research

JoVE Journal

Biochemistry

The Development and Application of Biophysical Assays for Evaluating Ternary Complex Formation Induced by Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACS)

2.3K Views.  The Broad Institute of MIT and Harvard. La nostra ricerca si concentra sulla replica di sistemi modello consolidati, sulla loro validazione attraverso saggi aggiuntivi e sull'adattamento di queste metodologie per adattarsi al nostro specifico contesto di ricerca. Il nostro obiettivo è quello di dimostrare un approccio versatile che può essere applicato a vari progetti. L'attuale sfida sperimentale, la selezione strategica delle licenze del formato e delle condizioni di analisi appropriate in base ai requisiti specifici del proget...

Video: Autore in primo piano: Valutazione di saggi biofisici per la caratterizzazione dei complessi ternari PROTACS 

E3 ligases and proteins targeted for degradation can be induced to form complexes by heterobifunctional molecules in a multi-step process. The kinetics and thermodynamics of the interactions involved contribute to efficiency of ubiquitination and resulting degradation of the protein. Biophysical techniques such as surface plasmon resonance (SPR), biolayer interferometry (BLI), and isothermal titration calorimetry (ITC) provide valuable information that can be used in the optimization of those interactions. Using two model systems, a biophysical assay tool kit for understanding the cooperativity of ternary complex formation and the impact of the &#39;hook effect&#39; on binding kinetics was established. In one case, a proteolysis targeting chimera (PROTAC) molecule that induced ternary complex formation between Brd4BD2 and VHL was evaluated. The heterobifunctional molecule, MZ1, has nM affinities for both the Brd4BD2 protein (SPR KD = 1 nM, ITC KD = 4 nM) and the VHL complex (SPR KD = 29 nM, ITC KD = 66 nM). For this system, robust SPR, BLI, and ITC assays were developed that reproduced published results demonstrating the cooperativity of ternary complex formation. In the other case, a molecule that induced ternary complexes between a 46.0 kDa protein, PPM1D, and cereblon [CRBN (319-442)] was studied. The heterobifunctional molecule, BRD-5110, has an SPR KD = 1 nM for PPM1D but much weaker binding against the truncated CRBN (319-442) complex (SPR KD= ~ 3 &#181;M). In that case, the binding for CRBN in SPR was not saturable, resulting in a &#34;hook-effect&#34;. Throughput and reagent requirements for SPR, BLI, and ITC were evaluated, and general recommendations for their application to PROTAC projects were provided.

Here we describe protocols for the biophysical characterization of ternary complex formation induced by proteolysis targeting chimeras (PROTACS) that involve the ubiquitin ligases Von Hippel-Lindau E3 ligase (VHL) and Cereblon (CRBN). Biophysical methods illustrated herein include surface plasmon resonance (SPR), biolayer interferometry (BLI), and isothermal titration calorimetry (ITC).