Questo lavoro è supportato dalla National Natural Science Foundation of China (82060341,81560304) e dall'Academician Innovation Platform Scientific Research Project della provincia di Hainan (YSPTZX202134).

Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Università di Medicina di Hainan. I campioni di tessuto utilizzati in questo studio non sono considerati studi che coinvolgono soggetti umani. Questi campioni sono stati ottenuti ai fini della diagnosi patologica forense e il resto è stato utilizzato per l'estrazione del DNA delle diatomee in questo esperimento. I ricercatori non sono in grado di identificare prontamente gli individui per ottenere il consenso informato dalle parti interessate.
NOTA: Per garantire l'applicabilità generale del metodo di ricerca riportato in questo esperimento, questo esperimento ha sostanzialmente seguito le istruzioni operative del kit utilizzato, e solo alcuni passaggi sono stati modificati. I campioni d'acqua utilizzati in questo esperimento sono stati prelevati in modo casuale da stagni vicino al laboratorio (Figura supplementare 1A). In questo esperimento, il tessuto polmonare del corpo annegato è stato confermato come il tessuto di ricerca per dimostrare il protocollo di estrazione (Figura supplementare 1B). Nella pratica forense, a volte è anche necessario utilizzare altri organi e tessuti di corpi annegati (come fegato, milza, rene, midollo osseo, ecc.) per estrarre il DNA delle diatomee, il che richiede piccoli miglioramenti corrispondenti a questo metodo sperimentale, che saranno spiegati nella sezione corrispondente dell'esperimento. I campioni di tessuto polmonare utilizzati in questo esperimento provenivano da cadaveri che erano stati chiaramente annegati in casi forensi. Sono stati condotti test morfologici per dimostrare che il tessuto polmonare contiene diatomee (Figura 2 supplementare).
1. Pretrattamento dei campioni
<ol><li>Pretrattamento dei campioni d'acqua<ol><li>Prelevare 10 ml di campione d'acqua nella provetta da centrifuga e centrifugare a 13.400 x g per 5 minuti. Scartare con cautela 9,8 mL di surnatante con una pistola a pipetta e trasferire circa 200 μL di campione di acqua di diatomee arricchita rimasto sul fondo in una provetta da centrifuga da 2 mL. NOTA: Il pre-esperimento può essere eseguito prima e la quantità iniziale può essere aumentata se un campione di acqua da 10 ml non è sufficiente per l'arricchimento.</li>
	</ol></li>
	<li>Pretrattamento di campioni di tessuto<ol><li>Prelevare 0,5 g di tessuto del margine polmonare dal corpo annegato, tritare o macinare completamente il tessuto polmonare fino a quando non diventa fangoso. Prevenire la contaminazione delle diatomee esogene è il fulcro di questa fase. Taglia ripetutamente il tessuto a pezzi usando le forbici.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Estrazione del DNA
NOTA: Tutte le fasi di centrifugazione vengono completate a temperatura ambiente. Utilizzando una centrifuga da tavolo con una forza centrifuga di 14.500 x g; prima dell'inizio dell'esperimento è necessario preparare un bagno d'acqua (o un bagno metallico) preriscaldato a 70 °C. Tutte le fasi devono seguire rigorosamente i principi del funzionamento asettico.
<ol><li>Assemblaggio di campioni d'acqua e tessuti NOTA: Il campione d'acqua e il metodo di estrazione del DNA delle diatomee tissutali sono gli stessi.<ol><li>Aggiungere le perle di vetro a una provetta da centrifuga da 2 mL contenente il campione di acqua pretrattata. Invertire 10x-15x per mescolare bene. Le perle di vetro aggiunte sono composte da perle di vetro grandi e piccole mescolate in un rapporto di massa di 1:1. Il diametro delle perle di vetro grandi è di 1,5-2,0 mm e quello delle perle di vetro piccole è di 0,4-0,6 mm.</li>
		<li>Prelevare 0,5 g di tessuto tritato finemente, aggiungere le perle di vetro in una provetta da centrifuga da 2 mL contenente il tessuto come descritto sopra. Invertire 10x-15x per mescolare.</li>
	</ol></li>
	<li>Aggiungere 40 μL di proteinasi K (20 mg/mL) alle provette. Mettere a temperatura ambiente per 15 minuti, durante questo periodo, capovolgere e mescolare 10 volte ogni 3 minuti. NOTA: Se il tessuto non è completamente digerito, la quantità di proteinasi K può essere opportunamente aumentata fino a quando la soluzione non diventa limpida.</li>
	<li>Aggiungere 200 μL di tampone di legame alle provette da centrifuga, vorticare immediatamente e mescolare per 4 minuti (frequenza di miscelazione dell'oscillazione: 3000 giri/min). NOTA: In questa fase, l'intensità e il tempo di agitazione devono essere rigorosamente controllati per garantire un'intensità e un tempo di miscelazione sufficienti.</li>
	<li>Mettere le provette da centrifuga a bagnomaria a 70 °C per 10 minuti e la soluzione diventa limpida.</li>
	<li>Aggiungere 100 μL di isopropanolo alle provette da centrifuga, vorticare e mescolare per 15 s, in questo momento potrebbe apparire una precipitazione flocculante. NOTA: È molto importante mescolare bene con la forza appropriata nelle fasi operative di cui sopra, ma l'agitazione vigorosa dovrebbe essere evitata per prevenire il taglio del DNA.</li>
	<li>Mettere la soluzione ottenuta nella fase precedente insieme al precipitato flocculante nella colonna di adsorbimento (la colonna di adsorbimento è posta nella provetta di raccolta). La lunghezza della colonna di adsorbimento è di 3,0 cm, il diametro è di 1,0 cm e la matrice di adsorbimento è una membrana a matrice di silicio.</li>
	<li>Centrifugare a 8.000 x g per 30 s, scartare il liquido di scarto nella provetta di raccolta e reinserire la colonna di adsorbimento nella provetta di raccolta.</li>
	<li>Aggiungere 500 μL di tampone per la rimozione dell'inibitore alla colonna di adsorbimento. Centrifugare a 13.400 x g per 30 s ed eliminare il liquido di scarto nella provetta di raccolta.</li>
	<li>Aggiungere 700 μL di tampone di lavaggio alla colonna di adsorbimento. Centrifugare a 13.400 x g per 30 s ed eliminare il liquido di scarto nella provetta di raccolta. NOTA: Aggiungere la quantità specificata di etanolo assoluto al flacone tampone di lavaggio prima del primo utilizzo.</li>
	<li>Aggiungere 500 μL di tampone di lavaggio alla colonna di adsorbimento. Centrifugare a 13.400 x g per 30 s ed eliminare il liquido di scarto nella provetta di raccolta.</li>
	<li>Rimettere la colonna di adsorbimento nella provetta di raccolta vuota. Centrifugare a 14.500 x g per 2 minuti e rimuovere il più possibile il tampone di lavaggio, per evitare che l'etanolo residuo nel tampone di lavaggio inibisca le reazioni a valle.</li>
	<li>Estrarre la colonna di adsorbimento e inserirla in una provetta da centrifuga pulita. Aggiungere 100 μL di tampone di eluizione alla parte centrale della membrana di adsorbimento.</li>
	<li>Posizionare la colonna di adsorbimento a temperatura ambiente per 3-5 minuti e centrifugare a 13.400 x g per 1 minuto.</li>
	<li>Aggiungere nuovamente la soluzione ottenuta nel passaggio precedente alla colonna di adsorbimento centrifugo. Posizionare la colonna di adsorbimento centrifugo a temperatura ambiente per 2 minuti e centrifugare a 13.400 x g per 1 minuto. NOTA: Il tampone di eluizione deve essere preriscaldato a bagnomaria a 70 °C per circa 10 minuti. Il volume di eluizione non deve essere inferiore a 50 μL; in caso contrario, la resa del DNA sarà ridotta.</li>
	<li>Conservare il DNA di diatomee estratto a 2-8 °C per un uso futuro. Se la soluzione di DNA deve essere conservata per lungo tempo, conservarla a -20 °C.</li>
</ol>3. Test PCR
NOTA: Poiché il contenuto di diatomee nei campioni forensi è spesso basso, gli estratti di campioni di tessuto dei corpi annegati possono anche contenere vari gradi di tessuto e organi (come i polmoni in questo esperimento) con il proprio DNA. Pertanto, il rilevamento diretto del DNA totale negli estratti di DNA non riflette la situazione dell'estrazione del DNA delle diatomee. In questo esperimento, sono stati selezionati primer specifici per le diatomee e sono stati utilizzati prodotti PCR per valutare l'estrazione del DNA delle diatomee nell'estratto. I prodotti possono essere osservati e analizzati mediante elettroforesi su gel di agarosio e possono anche essere analizzati mediante curva di fusione PCR quantitativa fluorescente in tempo reale, che ha una maggiore sensibilità.
<ol><li>Aggiungere 2 μL di DNA estratto da campioni d'acqua e tessuti come stampo. Scegliere uno dei due metodi seguenti per l'ispezione.</li>
	<li>Test PCR convenzionale<ol><li>Utilizzare primer22 in grado di amplificare in modo specifico i frammenti di rDNA della diatomea 18S. Per i dettagli, vedere la Tabella 1.</li>
		<li>Stabilire il sistema di reazione PCR e le condizioni di amplificazione in base alle caratteristiche dei primer. Per i dettagli, vedere la tabella 2.</li>
		<li>Eseguire i prodotti di amplificazione PCR su gel di agarosio al 2%. Osservare e analizzare l'imaging con un gel imager.</li>
	</ol></li>
	<li>Test PCR quantitativo fluorescente<ol><li>Utilizzare i primer di cui sopra in grado di amplificare in modo specifico i frammenti di rDNA della diatomea 18S per preparare un sistema di reazione di PCR quantitativa fluorescente in tempo reale. Per i dettagli, vedere la tabella 3.</li>
		<li>Eseguire l'amplificazione PCR e analizzare la curva di amplificazione ottenuta e i valori di Ct. Allo stesso tempo, impostare un programma, fondere gradualmente i doppi filamenti dei prodotti amplificati in singoli filamenti attraverso la tecnologia della curva di fusione PCR quantitativa fluorescente, quindi analizzare le curve di fusione ottenute.</li>
	</ol></li>
</ol>

Estrazione economica del DNA di diatomee utilizzando un kit modificato

<ol>
	<li>Liu, C., Cong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+and+prospect+of+diagnosis+of+drowning+deaths+in+water.">Review and prospect of diagnosis of drowning deaths in water.</a> Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 3-13 (2022).</li><li>Frisoni, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forensic+diagnosis+of+freshwater+or+saltwater+drowning+using+the+marker+aquaporin+5:+An+immunohistochemical+study.">Forensic diagnosis of freshwater or saltwater drowning using the marker aquaporin 5: An immunohistochemical study.</a> Medicina (Kaunas). 58 (10), 1458 (2022).</li><li>Mann, D. G., Vanormelingen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inordinate+fondness?+The+number,+distributions,+and+origins+of+diatom+species.">An inordinate fondness? The number, distributions, and origins of diatom species.</a> J Eukaryot Microbiol. 60 (4), 414-420 (2013).</li><li>Pfister, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terrestrial+diatoms+as+tracers+in+catchment+hydrology:+a+review.">Terrestrial diatoms as tracers in catchment hydrology: a review.</a> WIREs Water. 4, 1241 (2017).</li><li>Yu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+automated+diatom+detection+method+based+on+YOLOv5+framework+and+its+preliminary+study+for+taxonomy+recognition+in+the+forensic+diatom+test.">An improved automated diatom detection method based on YOLOv5 framework and its preliminary study for taxonomy recognition in the forensic diatom test.</a> Front Microbiol. 13, 963059 (2022).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+length+and+width+of+diatoms+in+drowning+cases+as+the+evidence+of+diatoms+penetrating+the+alveoli-capillary+barrier.">The length and width of diatoms in drowning cases as the evidence of diatoms penetrating the alveoli-capillary barrier.</a> Int J Legal Med. 134 (3), 1037-1042 (2020).</li><li>Kihara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+water+injection+into+lungs+using+an+animal+model:+Verification+of+the+diatom+concentration+test+to+diagnose+drowning.">Experimental water injection into lungs using an animal model: Verification of the diatom concentration test to diagnose drowning.</a> Forensic Sci Int. 327, 110983 (2021).</li><li>Shen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+false-positive+results+of+diatom+test+in+the+diagnosis+of+drowning-would+not+be+an+impediment.">Analysis of false-positive results of diatom test in the diagnosis of drowning-would not be an impediment.</a> Int J Legal Med. 133 (6), 1819-1824 (2019).</li><li>Manoylov, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxonomic+identification+of+algae+(morphological+and+molecular):+species+concepts,+methodologies,+and+their+implications+for+ecological+bioassessment.">Taxonomic identification of algae (morphological and molecular): species concepts, methodologies, and their implications for ecological bioassessment.</a> J Phycol. 50 (3), 409-424 (2014).</li><li>Uchiyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+molecular+approach+to+help+conclude+drowning+as+a+cause+of+death:+simultaneous+detection+of+eight+bacterioplankton+species+using+real-time+PCR+assays+with+TaqMan+probes.">A new molecular approach to help conclude drowning as a cause of death: simultaneous detection of eight bacterioplankton species using real-time PCR assays with TaqMan probes.</a> Forensic Sci Int. 222 (1-3), 11-26 (2012).</li><li>Kakizaki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+diverse+aquatic+microbes+in+blood+and+organs+of+drowning+victims:+first+metagenomic+approach+using+high-throughput+454-pyrosequencing.">Detection of diverse aquatic microbes in blood and organs of drowning victims: first metagenomic approach using high-throughput 454-pyrosequencing.</a> Forensic Sci Int. 220 (1-3), 135-146 (2012).</li><li>Cai, J., Wang, B., Chen, J. H., Deng, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+Progress+of+High-Throughput+Sequencing+Technology+in+Forensic+Diatom+Detection.">Application Progress of High-Throughput Sequencing Technology in Forensic Diatom Detection.</a> Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 20-30 (2022).</li><li>Xiao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+a+multiplex+PCR+system+for+drowning+diagnosis.">Development and application of a multiplex PCR system for drowning diagnosis.</a> Electrophoresis. 42 (11), 1270-1278 (2021).</li><li>Yarimizu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+absolute+quantification+method+for+ribosomal+RNA+gene+copy+numbers+per+eukaryotic+single+cell+by+digital+PCR.">Development of an absolute quantification method for ribosomal RNA gene copy numbers per eukaryotic single cell by digital PCR.</a> Harmful Algae. 103, 102008 (2021).</li><li>Dalgic, A. D., Atila, D., Karatas, A., Tezcaner, A., Keskin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diatom+shell+incorporated+PHBV/PCL-pullulan+co-electrospun+scaffold+for+bone+tissue+engineering.">Diatom shell incorporated PHBV/PCL-pullulan co-electrospun scaffold for bone tissue engineering.</a> Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 100, 735-746 (2019).</li><li>Malviya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+global+diatom+distribution+and+diversity+in+the+world's+ocean.">Insights into global diatom distribution and diversity in the world's ocean.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), 1516-1525 (2016).</li><li>Brunner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+studies+of+silica+biomineralization:+towards+an+understanding+of+silica+processing+by+diatoms.">Analytical studies of silica biomineralization: towards an understanding of silica processing by diatoms.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 84 (4), 607-616 (2009).</li><li>Annunziata, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimised+method+for+intact+nuclei+isolation+from+diatoms.">An optimised method for intact nuclei isolation from diatoms.</a> Sci Rep. 11 (1), 1681 (2021).</li><li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diagnostic+value+of+quantitative+assessment+of+diatom+test+for+drowning:+An+analysis+of+128+water-related+death+cases+using+microwave+digestion-vacuum+filtration-automated+scanning+electron+microscopy.">The diagnostic value of quantitative assessment of diatom test for drowning: An analysis of 128 water-related death cases using microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy.</a> J Forensic Sci. 62 (6), 1638-1642 (2017).</li><li>Zhao, J., Liu, C., Hu, S., He, S., Lu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwave+digestion-vacuum+filtration-automated+scanning+electron+microscopy+as+a+sensitive+method+for+forensic+diatom+test.">Microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy as a sensitive method for forensic diatom test.</a> Int J Legal Med. 127 (2), 459-463 (2013).</li><li>Cai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+glass+bead-vortex+oscillation+method+for+DNA+extraction+from+diatom.">Improved glass bead-vortex oscillation method for DNA extraction from diatom.</a> Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 119-126 (2022).</li><li>Zimmermann, J., Jahn, R., Gemeinholzer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barcoding+diatoms:+evaluation+of+the+V4+subregion+on+the+18S+rRNA+gene,+including+new+primers+and+protocols.">Barcoding diatoms: evaluation of the V4 subregion on the 18S rRNA gene, including new primers and protocols.</a> Org Divers Evol. 11 (3), 173-192 (2011).</li><li>Vinayak, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+gene+markers+detect+diatom+DNA+in+a+drowned+mice+establishing+drowning+as+a+cause+of+death.">Chloroplast gene markers detect diatom DNA in a drowned mice establishing drowning as a cause of death.</a> Electrophoresis. , (2020).</li><li>Plante, C. J., Hill-Spanik, K., Cook, M., Graham, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+and+Spatial+Influences+on+Biogeography+and+Community+Structure+of+Saltmarsh+Benthic+Diatoms.">Environmental and Spatial Influences on Biogeography and Community Structure of Saltmarsh Benthic Diatoms.</a> Estuaries and Coasts. 44, 147-161 (2021).</li><li>Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+quantitative+PCR.">Real time quantitative PCR.</a> Genome Res. 6 (10), 986-994 (1996).</li><li>Ben Amor, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+TaqMan+qPCR+assay+for+rapid+detection+and+quantification+of+Gymnodinium+catenatum+for+application+to+harmful+algal+bloom+monitoring+in+coastal+areas+of+Tunisia.">Development of a novel TaqMan qPCR assay for rapid detection and quantification of Gymnodinium catenatum for application to harmful algal bloom monitoring in coastal areas of Tunisia.</a> Environ Sci Pollut Res Int. 29 (42), 63953-63963 (2022).</li><li>Doddaraju, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+and+early+diagnosis+of+bacterial+blight+in+pomegranate+caused+by+Xanthomonas+axonopodis+pv.+punicae+using+sensitive+PCR+techniques.">Reliable and early diagnosis of bacterial blight in pomegranate caused by Xanthomonas axonopodis pv. punicae using sensitive PCR techniques.</a> Sci Rep. 9 (1), 10097 (2019).</li><li>Lunetta, P., Miettinen, A., Spilling, K., Sajantila, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=False-positive+diatom+test:+a+real+challenge?+A+post-mortem+study+using+standardized+protocols.">False-positive diatom test: a real challenge? A post-mortem study using standardized protocols.</a> Leg Med (Tokyo). 15 (5), 229-234 (2013).</li><li>Marquesda Silva, J., Cruz, S., Cartaxana, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inorganic+carbon+availability+in+benthic+diatom+communities:+photosynthesis+and+migration.">Inorganic carbon availability in benthic diatom communities: photosynthesis and migration.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 372 (1728), 20160398 (2017).</li><li>Yu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+enzyme+digestion+time+on+the+detection+of+diatom+species.">The effect of enzyme digestion time on the detection of diatom species.</a> Pak J Pharm Sci. 27 (3 Suppl), 691-694 (2014).</li><li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diatom+DNA+barcodes+for+forensic+discrimination+of+drowning+incidents.">Diatom DNA barcodes for forensic discrimination of drowning incidents.</a> FEMS Microbiol Lett. 367 (17), 145 (2020).</li><li>Mizushima, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+novel+heart-specific+RING+finger+protein+207+is+involved+in+energy+metabolism+in+cardiomyocytes.">The novel heart-specific RING finger protein 207 is involved in energy metabolism in cardiomyocytes.</a> J Mol Cell Cardiol. 100, 43-53 (2016).</li><li>Zimmermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxonomic+reference+libraries+for+environmental+barcoding:+a+best+practice+example+from+diatom+research.">Taxonomic reference libraries for environmental barcoding: a best practice example from diatom research.</a> PLoS One. 9 (9), 108793 (2014).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Le cellule di diatomee sono protette da pareti cellulari silicee dure17 e questa struttura deve essere distrutta per estrarre il DNA delle diatomee. I kit ordinari non distruggono facilmente il guscio siliceo delle diatomee; quindi è difficile estrarre con successo il DNA21 delle diatomee. Il nostro laboratorio ha migliorato il kit di estrazione del DNA sanguigno più comunemente usato, aggiungendo perle di vetro di diversi diametri e diversi rapporti di massa nel processo...

Nella pratica forense, determinare se un cadavere trovato in acqua annegava o è stato gettato in acqua dopo la morte è essenziale per la corretta risoluzione del caso1. È anche una delle questioni difficili che devono essere risolte con urgenza nella pratica forense2. Le diatomee sono abbondanti nell'ambiente naturale (soprattutto nell'acqua)3,4. Nel processo di annegamento, a causa dell'ipossia e della risposta allo stress, le persone avranno intensi movimenti respiratori e inaleranno una grande quantità di liquido di annegamento. Pertanto, le diatomee nell'acqua entrano nel polmone con il liquido di annegamento e alcune diatomee possono entrare nella circolazione sanguigna attraverso la barriera alveolare-capillare e diffondersi agli organi interni con il flusso sanguigno 5,6. Il rilevamento di diatomee nei tessuti interni e negli organi come il polmone, il fegato e il midollo osseo è una forte evidenza di annegamento prima della morte 7,8. Attualmente, l'analisi forense delle diatomee si basa principalmente su metodi di analisi morfologici. Dopo una serie di pre-digestioni del tessuto, vengono effettuate al microscopio le stime morfologiche qualitative e quantitative delle diatomee non digerite. Durante questo periodo, è necessario utilizzare reagenti pericolosi e dannosi per l'ambiente come l'acido nitrico. Questo processo richiede molto tempo e richiede ai ricercatori una solida competenza tassonomica e una vasta esperienza. Tutto ciò comporta alcune sfide per il personale forense9. La tecnologia di test del DNA delle diatomee è una nuova tecnologia per il test delle diatomee sviluppata negli ultimi anni 10,11,12. Questa tecnologia realizza l'identificazione delle specie delle diatomee analizzando la composizione specifica della sequenza di DNA delle diatomee13,14. La tecnologia PCR e la tecnologia di sequenziamento sono metodi tecnici comunemente usati, ma la loro base è l'estrazione di successo del DNA dalle diatomee. Tuttavia, le diatomee hanno una struttura speciale diversa da quella di altri organismi, rendendo diverse anche le loro tecniche di estrazione del DNA.
La parete cellulare della diatomea ha un alto grado di silicizzazione e il suo componente principale è il biossido di silicio 15,16,17. La parete cellulare silicea è molto dura e deve essere distrutta prima di estrarre il DNA. I normali kit di estrazione del DNA sono spesso difficili da utilizzare direttamente per l'estrazione del DNA delle diatomee perché non possono distruggere il guscio siliceo delle diatomee18. Pertanto, la distruzione del guscio siliceo delle diatomee è uno dei principali problemi tecnici da risolvere nell'estrazione del DNA delle diatomee.
Allo stesso tempo, poiché il numero di diatomee contenute nei campioni di ricerca forense, che si tratti di campioni d'acqua o di organi e tessuti di corpi annegati, è spesso limitato, è necessario arricchire le diatomee. L'essenza dell'arricchimento è la separazione delle sostanze. Mentre si cerca di raccogliere le diatomee, ridurre al minimo il contenuto di altri componenti materiali (componenti interferenti). Nel lavoro forense, i laboratori utilizzano spesso metodi di arricchimento della centrifugazione o della filtrazione a membrana per separare le cellule delle diatomee19. Tuttavia, poiché le apparecchiature di pompaggio del vuoto non sono ampiamente utilizzate, il metodo di arricchimento della membrana non viene spesso utilizzato nei normali laboratori forensi primari. Quindi, il metodo di centrifugazione è ancora comunemente l'arricchimento di diatomee nei laboratori forensi20.
L'estrazione del DNA dalle diatomee è attualmente utilizzata principalmente nella pratica forense e ci sono limitazioni significative alla sua applicazione. Attualmente, ci sono pochi kit di estrazione del DNA di diatomee utilizzati nella scienza forense sul mercato e sono generalmente costosi21. Questo articolo fornisce un metodo di estrazione del DNA delle diatomee migliorato, rendendo l'estrazione del DNA delle diatomee semplice, conveniente ed economica. Ciò aumenta l'applicazione dei successivi test di biologia molecolare delle diatomee e può risolvere meglio i problemi legati all'annegamento in medicina legale attraverso il test delle diatomee. Questo metodo rompe le pareti cellulari silicee delle diatomee aggiungendo perle di vetro e impostando un tempo appropriato per il vortice. In questo modo, la proteinasi K e la soluzione di legame lisano rapidamente le cellule e inattivano vari enzimi nelle cellule. Il DNA genomico viene assorbito nella membrana della matrice nella colonna di adsorbimento e infine eluito dal tampone di eluizione. Un kit di estrazione genica del sangue intero così migliorato migliora l'effetto di estrazione del DNA delle diatomee del kit di sangue nei materiali di esame forense, riduce il costo dell'estrazione del DNA delle diatomee nella pratica forense e può essere applicato meglio alla ricerca forense di base.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Binding Buffer</td>
			<td>BioTeke</td>
			<td>B010006022</td>
			<td>rapidly lysing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemoHS qPCR Mix</td>
			<td>Monad</td>
			<td>00007547-120506</td>
			<td>qPCR Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2000 DNA ladder</td>
			<td>Real-Times(Beijing) Biotechnology</td>
			<td>RTM415</td>
			<td>Measure the position of electrophoretic bands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D512</td>
			<td>Taihe Biotechnology</td>
			<td>TW21109196</td>
			<td>forword primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D978</td>
			<td>Taihe Biotechnology</td>
			<td>TW21109197</td>
			<td>reverse primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution buffer</td>
			<td>BioTeke</td>
			<td>B010006022</td>
			<td>A low-salt elution buffer washes off the DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bead</td>
			<td>Yingxu Chemical Machinery(Shanghai)&#160;</td>
			<td>70181000</td>
			<td>Special glass beads for dispersing and grinding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Import adsorption column</td>
			<td>BioTeke</td>
			<td>B2008006022</td>
			<td>Adsorption column with silica matrix membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibitor Removal Buffer</td>
			<td>BioTeke</td>
			<td>B010006022</td>
			<td>Removal of Inhibitors in DNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>BioTeke</td>
			<td>B010006022</td>
			<td>Precipitate or isolate DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIX-30S Mini Mixer</td>
			<td>Miulab</td>
			<td>MUC881206</td>
			<td>oscillatory action</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>BioTeke</td>
			<td>B010006022</td>
			<td>Inactivation of intracellular nucleases and other proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor-Gene Q 5plex HRM</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>R1116175</td>
			<td>real-time fluorescence quantification PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed Micro-Centrifuge</td>
			<td>Scilogex</td>
			<td>9013001121</td>
			<td>centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tanon 3500R Gel Imager</td>
			<td>Tanon</td>
			<td>16T5553R-455</td>
			<td>gel imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq Mix Pro</td>
			<td>Monad</td>
			<td>00007808-140534</td>
			<td>PCR Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Cycler</td>
			<td>Zhuhai Hema</td>
			<td>VRB020A</td>
			<td>ordinary PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer</td>
			<td>BioTeke</td>
			<td>B010006022</td>
			<td>Remove impurities such as cell metabolites</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction of diatom dna from water samples and tissues

Il test delle diatomee è un mezzo ausiliario essenziale nella pratica forense per determinare se il cadavere è annegato in acqua e per dedurre il luogo dell'annegamento. Il test delle diatomee è anche un importante contenuto di ricerca nel campo dell'ambiente e del plancton. La tecnologia di analisi della biologia molecolare delle diatomee, che si concentra sul DNA delle diatomee come oggetto di ricerca primario, è un nuovo metodo di test delle diatomee. L'estrazione del DNA delle diatomee è alla base dei test molecolari delle diatomee. Attualmente, i kit comunemente usati per l'estrazione del DNA delle diatomee sono costosi, il che aumenta il costo della ricerca correlata. Il nostro laboratorio ha migliorato il kit generale di estrazione rapida del DNA genomico del sangue intero e ha ottenuto un effetto soddisfacente di estrazione del DNA delle diatomee, fornendo così una soluzione alternativa economica e conveniente per l'estrazione del DNA basata su perle di vetro per la ricerca correlata. Il DNA di diatomee estratto utilizzando questo protocollo potrebbe soddisfare molte applicazioni a valle, come la PCR e il sequenziamento.

In forensic practice, determining whether a corpse found in the water drowning or was thrown into the water after death is essential for the proper resolution of the case1. It is also one of the difficult issues that need to be solved urgently in forensic practice2. Diatoms are abundant in the natural environment (especially in water)3,4. In the process of drowning, due to hypoxia and stress response, people will have intense breathing movements and inhale a large amount of drowning liquid. Therefore, the diatoms in the water enter the lung with the drowning liquid, and some diatoms can enter the blood circulation through the alveolar-capillary barrier and spread to internal organs with the blood flow5,6. The detection of diatoms in internal tissues and organs such as lung, liver, and bone marrow is a strong evidence of drowning before death7,8. Currently, forensic diatom testing is mainly based on morphological testing methods. After a series of pre-digestion of the tissue, the morphological qualitative and quantitative estimations of undigested diatoms are carried out under the microscope. During this period, dangerous and environmentally unfriendly reagents such as nitric acid need to be used. This process is time-consuming and requires researchers to have solid taxonomic expertise and extensive experience. These all bring certain challenges to the forensic staff9. Diatom DNA testing technology is a new technology for diatom testing developed in recent years10,11,12. This technology realizes the species identification of diatoms by analyzing the specific DNA sequence composition of diatoms13,14. PCR technology and sequencing technology are commonly used technical methods, but their basis is the successful extraction of DNA from diatoms. However, diatoms have a special structure different from other organisms, making their DNA extraction techniques also different.
The cell wall of diatom has a high degree of silicification, and its main component is silicon dioxide15,16,17. The siliceous cell wall is very hard, and it must be destroyed before extract the DNA. Ordinary DNA extraction kits are often difficult to use directly for the extraction of diatom DNA because they cannot destroy the siliceous shell of diatoms18. Therefore, destroying the siliceous shell of diatoms is one of the key technical problems to be solved in extracting diatom DNA.
At the same time, since the number of diatoms contained in forensic research samples, whether water samples or organs and tissues of drowned bodies, is often limited, it is necessary to enrich diatoms. The essence of enrichment is the separation of substances. While trying to gather diatoms together, minimize the content of other material components (interfering components). In forensic work, laboratories often use centrifugation or membrane filtration enrichment methods to separate diatom cells19. However, since vacuum pumping equipment is not widely used, the membrane enrichment method is not often used in ordinary primary forensic laboratories. So, the centrifugation method is still commonly diatom enrichment in forensic laboratories20.
DNA extraction from diatoms is currently used primarily in forensic practice, and there are significant limitations to its application. At present, there are few diatom DNA extraction kits used in forensic science on the market and they are generally expensive21. This article provides an improved diatom DNA extraction method, making diatom DNA extraction simple, convenient and cost effective. This increases the application of subsequent molecular biology testing of diatoms and can better solve problems related to drowning in forensic medicine through diatom testing. This method breaks the siliceous cell walls of diatoms by adding glass beads and setting an appropriate time for vortex. In this way, the proteinase K and the binding solution rapidly lyse the cells and inactivate various enzymes in the cells. The genomic DNA is absorbed in the matrix membrane in the adsorption column and finally eluted by the elution buffer. Such an improved whole blood gene extraction kit improves the diatom DNA extraction effect of the blood kit in forensic examination materials, reduces the cost of diatom DNA extraction in forensic practice, and can be better applied to grassroot forensic research.

Autore in primo piano: Test delle diatomee per l'esame forense dell'annegamento 

Estrazione del DNA di diatomee da campioni d'acqua e tessuti

Our research mainly focus on the topic of drowning. We wanted to answer the question of whether the body found in the water died from drowning, as well to answer another question of where the person fell into the water. That means to know the location of the drowning.Compared with other technologies, we provide a simple, convenient, and economical diatom DNA extraction protocol that we can use better in forensic research, especially in basic forensic practice. Our laboratory will further focus on the drowning related problems based on the pattern in the water, such as reason of death, post mortem interval and so on. What's more, we also carry on the research through the forensic entomology and a some special phenomenons in the tropical forensic medicines.

Poiché la soluzione di DNA estratta con il metodo di estrazione del DNA attualmente utilizzato contiene tutti i componenti del DNA provenienti da diverse fonti nel campione, il DNA ottenuto con questo protocollo non ha fatto eccezione. Quindi, la soluzione del DNA non era solo una soluzione del DNA genomico delle diatomee. I primer in grado di amplificare in modo specifico i frammenti di rDNA della diatomea 18S sono stati selezionati consultando la letteratura 22,23,24.<sup class="xref...

Watch this Scientific Journal Video about Diatom Testing for Forensic Drowning Examination at JoVE.com

Questo articolo descrive un protocollo per l'estrazione del DNA delle diatomee utilizzando un kit di estrazione del DNA comune modificato.

Diatom testing is an essential auxiliary means in forensic practice to determine whether the corpse drowned in water and to infer the drowning location. ...

La nostra ricerca si concentra principalmente sul tema dell'annegamento. Volevamo rispondere alla domanda se il corpo trovato in acqua fosse morto per annegamento, così come rispondere a un'altra domanda su dove la persona fosse caduta in acqua. Ciò significa conoscere il luogo dell'annegamento.Rispetto ad altre tecnologie, forniamo un protocollo di estrazione del DNA di diatomee semplice, conveniente ed economico che possiamo utilizzare meglio nella ricerca forense, in particolare nella pratica forense di base. Il nostro laboratorio si concentrerà ulteriormente sui problemi legati all'annegamento in base al modello nell'acqua, come il motivo della morte, l'intervallo post mortem e così via. Inoltre, portiamo avanti la ricerca attraverso l'entomologia forense e alcuni fenomeni speciali nella medicina legale tropicale.

extraction-of-diatom-dna-from-water-samples-and-tissues

Research

JoVE Journal

Medicine

Extraction of Diatom DNA from Water Samples and Tissues

1.3K Views.  Hainan Medical University, Hainan Provincial Academician Workstation (tropical forensic medicine). La nostra ricerca si concentra principalmente sul tema dell'annegamento. Volevamo rispondere alla domanda se il corpo trovato in acqua fosse morto per annegamento, così come rispondere a un'altra domanda su dove la persona fosse caduta in acqua. Ciò significa conoscere il luogo dell'annegamento.Rispetto ad altre tecnologie, forniamo un protocollo di estrazione del DNA di diatomee semplice, conveniente ed economico che possiamo utilizzare meglio nella ricerca forense, in particolare n...

Video: Autore in primo piano: Test delle diatomee per l'esame forense dell'annegamento 

Diatom testing is an essential auxiliary means in forensic practice to determine whether the corpse drowned in water and to infer the drowning location. Diatom testing is also an important research content in the field of the environment and plankton. The diatom molecular biology testing technology, which focuses on diatom DNA as the primary research object, is a new method of diatom testing. Diatom DNA extraction is the basis of diatom molecular testing. At present, the kits commonly used for diatom DNA extraction are expensive, which increases the cost of carrying out related research. Our laboratory improved the general whole blood genomic DNA rapid extraction kit and obtained a satisfactory diatom DNA extraction effect, thus providing an alternative economical and affordable DNA extraction solution based on glass beads for related research. The diatom DNA extracted using this protocol could satisfy many downstream applications, such as PCR and sequencing.

This article describes a protocol for diatom DNA extraction using a modified common DNA extraction kit.

Ricerca

Medicina

Diatom DNA Extraction from Water Sample and Human Lung Tissue Using a Modified DNA Extraction Kit

To begin, take 10 milliliters of the diatom water sample in a centrifuge tube. Centrifuge the tube at 13, 400 G for five minutes. With a pipette gun, carefully discard 9.8 milliliters of the supernatant.Then transfer 200 microliters of the enriched diatom water sample into a two-milliliter centrifuge tube. Next, take 0.5 grams of lung margin tissue from a drowned human body. With scissors, cut the lung tissue until it becomes muddy.For DNA extraction off both diatom and lung samples, first add glass beads to both samples. After mixing the samples well, add 40 microliters of proteinase K to the tubes. After a 15-minute incubation at room temperature, add 200 microliters of binding buffer to both tubes.Immediately mix the samples with a vortex mixer for four minutes. Then place the tubes in a water bath at 70 degrees Celsius for 10 minutes. until the solution becomes clear.Next, transfer the clear solution with flocculent precipitate. into a three-centimeter long adsorption column packed with silicon matrix. Centrifuge the column at 8, 000 G for 30 seconds.Then discard the waste liquid in the collection tube and put the column back into the collection tube. Now add 500 microliters of the inhibitor removal buffer into the column and centrifuge at 13, 400 G for 30 seconds. After discarding the waste liquid, add 700 microliters of the washing buffer to the column and centrifuge again.After discarding the waste liquid, place the adsorption column back into the empty collection tube. Centrifuge the column at 14, 500 G for two minutes to remove as much wash buffer as possible. Now take the column out and place it in a clean centrifuge tube.Add 100 microliters of elution buffer to the middle part of the adsorption membrane. Centrifuge the column at 13, 400 G for one minute after a five-minute incubation at room temperature. Transfer the solution obtained in the collection tube back into the adsorption column before centrifuging again.Store the eluted diatom DNA at two to eight degrees Celsius for future use. Agarose gel electrophoresis showed diatom DNA bands between 250 to 500 BP in both water samples and tissues after PCR amplification.