Gli autori ringraziano il flusso di Ricerca Citometria Nucleo presso l&#39;Ospedale Pediatrico di Cincinnati Fondazione di Ricerca e Richard Demarco, Sherree amico, e Scott Mordecai dal Amnis Corporation (parte di EMD Milllipore) per il supporto tecnico di esperti. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health concede K08HL088126 e R01HL116352 (TAK) e P30 DK090971 (YZ).

1. Lungo termine in vitro Cultura eritropoiesi (ex vivo differenziamento eritroide Cultura protocollo da Giarratana et al. 8, modificato e adattato per cellule di topo) Si tratta di una prospettiva a lungo termine in 3 step nel protocollo eritropoiesi vitro. Nella prima fase (0-4 giorni) 2 x 10 5 cellule / ml vengono posti in un terreno di crescita eritroblasti supplementato con fattore delle cellule staminali (SCF), interleuchina-3 (IL-3), e l&#39;eritropoietina (EPO). Nella seconda fase (5-6 giorni), le cellule sono risospese in 2 x 10 5 cellule / ml e co-coltivati ​​su cellule stromali aderenti (MS5) in terreno di crescita fresco eritroblasti, completata solo con Epo. Nella terza fase (7-9 giorni), le cellule sono coltivate su uno strato di MS-5 cellule nel mezzo di crescita fresco eritroblasti senza citochine massimo di enucleazione (Figura 1A). Tutti i protocolli di animali sono stati approvati dalla cura degli animali ed uso Comitato Istituzionale (IACUC) diHospital Medical Center Pediatrico di Cincinnati. <ol><li> Raccolta di ossa e isolamento delle cellule del midollo osseo a bassa densità <ol><li> Aggiungere 2 ml IMDM sterile contenente siero bovino fetale 2% (FBS) in una provetta conica da 15 ml e tenere in ghiaccio. </li><li> Euthanize un 2-6 mesi di tipo selvatico topo C57/BL6 (con o senza il mouse geneticamente mirata di interesse) seguendo il protocollo istituto approvato (ad esempio CO 2 inalazione, seguita da dislocazione cervicale). </li><li> Isolare ossa del bacino, femore e tibia di entrambe le gambe con pinze e bisturi, aggiungerli alla provetta contenente IMDM +2% FBS e tenere in ghiaccio. </li><li> Aggiungere 1 ml di IMDM +2% FBS in una provetta sterile citometria a flusso e ossa a filo con pinze e una siringa tubercolina con un 25-G x 5/8 &quot;ago. IMDM Flush +2% FBS attraverso le ossa un paio di volte delicatamente ( aspirando ~ 500 microlitri della sospensione cellulare e lavando nuovamente attraverso l&#39;osso), e raccogliere le cellule del midollo osseo nel flusso-cytometrtubo y. Flushing è completa quando le ossa appaiono bianche. </li><li> Filtro cellula-sospensione attraverso un insieme filtro cella 40 micron sulla cima di una provetta conica da 50 ml. Lavare filtro cella con IMDM +2% FBS e usando lo stesso mezzo regolare il volume finale della sospensione cellulare a 5 ml. </li><li> Preparazione delle cellule del midollo osseo a bassa densità (LDBM) dal gradiente di densità centrifugazione: strato attentamente i 5 ml di sospensione cellulare in 5 ml di separazione cellulare pendenza media densità 1.083 g / ml in un tubo da 15 ml e centrifugare a 750 xg per 25 min a temperatura ambiente (RT) senza accelerazione freno / bassa. </li><li> Trasferire il surnatante (tutto fino a circa il marchio 2 ml di tubo da 15 ml per acquisire buffy coat) in un tubo da 15 ml ed eseguire un altro lavaggio con IMDM +2% FBS a 525 xg per 5 min a RT. </li><li> Aspirare il surnatante e lisare tutte le rimanenti globuli rossi (RBC) sospendendo il pellet in 3 ml di tampone di lisi RBC per 5 minuti a temperatura ambiente. Se una maggiore purezza di erythroblasts èrichiesta alla fase finale (ad esempio per studi biochimici), purificare le cellule LDBM ulteriormente in questa fase alle cellule neg Lin da separazione magnetica. </li></ol></li><li> Ex vivo differenziamento eritroide protocollo cultura partendo da LDBM o cellule neg Lin (Figura 1A) <ol><li> Aggiungere 7 ml IMDM +2% FBS, centrifugare a 525 xg per 5 minuti a temperatura ambiente e sospendere nuovamente le cellule pellet in 2 ml di mezzo di crescita eritroblasto (EGM), composto da: un. StemPro-34 medio, contenente b. 2,6% StemPro-34 medio supplemento, c. 20% BIT-9500, d. Solfato 900 ng / ml ferrosi, e. 90 / ml di nitrato ferrico ng, f. 100 unità / ml di penicillina / streptomicina, 2 mM L-glutammina g. 10 -6 M idrocortisone h. e citochine appena ha aggiunto: i) 100 ng / ml SCF, ii) 5 ng / ml di IL-3, e iii) 3 UI / ml Epo. </li><li> Contare le cellule utilizzando un contatore di cellule automatico o manualmente in un microscopio con un orloocytometer. </li><li> Piastra in una piastra di coltura cellulare da 6 pozzetti ad una concentrazione di 5 x 10 5 cellule / pozzetto a un volume finale di 2,5 ml in EGM (2 x 10 5 cellule / ml LDBM) e incubare a 37 ° C (questo è considerato come il giorno # 0 della cultura). </li><li> Cambiare mezzo aspirando 1.5 ml del surnatante, filatura a 525 xg per 5 min a temperatura ambiente, risospendere in 1,5 ml di mezzo fresco contenente tutti i 3 citochine e aggiungendo indietro ai pozzetti ogni giorno nei giorni # 2, 3, 4, per ottimizzare fase proliferativa. Il giorno 3, rimuovere tutte le cellule, contare e dividere in congruo numero di pozzetti al fine di sostenere le concentrazioni di cellule e di ~ 2 x 10 5 cellule / ml. Mantenere la cultura a 37 C / 5% di CO 2 °. </li><li> Il giorno 4, le cellule piastra MS5 (murino linee di cellule stromali) nei pozzetti di una nuova coltura cellulare 6-pozzetti. Il mezzo di coltura cellulare è MS5 α-MEM contenente 20% FBS, 100 unità / ml di penicillina / streptomicina, e 2 mM L-glutammina. </li><li> Il giorno 5, contare il numero dicellule (ora notevolmente arricchito in eritroblasti) in ciascun pozzetto della piastra di coltura originale usando un contatore automatico di cellule o manualmente in un microscopio con un emocitometro. </li><li> Sollevare tutte le cellule di ogni pozzetto e trasferimento provette coniche da 15 ml, centrifugare a 525 xg per 5 min a temperatura ambiente, aspirare il surnatante e sciogliere pellet con EGM fresco contenente solo Epo (3 UI / ml) ad una concentrazione di 2 x 10 5 cellule / ml. </li><li> Aspirare il surnatante dai pozzi dove MS-5 cellule sono state piastrate il giorno precedente (mirato al 70-80% di confluenza al momento della co-cultura) e aggiungere le cellule eritroidi in questi pozzi in EGM contiene solo Epo (anche se non è il loro mezzo di scelta, MS-5 cellule sopravvivono bene in EGM per diversi giorni). </li><li> Cambiare medio aggiungendo fresco EPO giorno # 6. </li><li> Cambiare mezzo il giorno # 7, con EGM senza citochine aggiunti. Nei giorni 7 e 9, i campioni di prova per enucleazione con citometria a flusso dopo colorazione con anti-Ter119 e Syto-16 tutti i giorni e proceed di colorazione campioni per Multi-Spectral Imaging Citometria a Flusso (come indicato nella sezione 3). Nota:. Prima di placcatura e il giorno 2, 4, 6 e 7 della cultura, monitorare le cellule in coltura di arricchimento eritroblasto e la differenziazione con la citometria a flusso, valutando marcatori di superficie CD44 e Ter119 vs dimensione (FSC) 9 alternativa CD71, Ter119, e FSC può anche essere usato 10, 11. </li></ol></li></ol> 2. Rapido enucleazione Assay, secondo il protocollo descritto da Yoshida et al. 12 con modifiche (Figura 1B) <ol><li> Induzione eritropoiesi Stress e stroma preparazione delle cellule per la cultura eritropoiesi in vitro <ol><li> Anestetizzare un 2-6 mesi wild type C57/BL6 del mouse secondo le linee guida IACUC (ad esempio con la soluzione isoflurano). Assicurarsi che il mouse è stato adeguatamente anestetizzato verificando l&#39;assenza di risposte riflessivi ad un delicato posteriore-zampa pinch e perrespirazioni regolari durante la procedura. Utilizzare veterinario pomata oftalmica sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. </li><li> Indurre stress eritropoiesi via coda sanguinante per un volume finale di 500 microlitri. Utilizzando una siringa da insulina, iniettare un volume uguale di soluzione fisiologica per via intraperitoneale per assicurare rianimazione fluido dell&#39;animale (tenere animale in posizione di Trendelenburg prima dell&#39;iniezione e iniettare nell&#39;addome inferiore in modo da non danneggiare gli organi interni). </li><li> Non lasciare incustodito il mouse fino a quando non ha ripreso il controllo del motore come indicato dal animale iniziando a muoversi intorno alla gabbia ed essere in grado di alzarsi e camminare senza cadere. Il mouse Phlebotomized è posto in una gabbia senza altri topi. </li><li> Dopo 2 giorni, piastra MS-5 cellule in pozzetti di una piastra di coltura cellulare 24 pozzetti. Incubare MS-5 cellule a 37 ° C / 5% di CO 2 in terreno cellule MS5 (a-MEM contenente 20% FBS, 100 unità / ml di penicillina / streptomicina, e 2 mM L-glutammina), con l&#39;obiettivo di essere 70-80 % confluenti ipozzetti della piastra n dopo 48 ore. </li></ol></li><li> Raccolta di milza e lavorazione di splenociti <ol><li> Quattro giorni (96 ore) dopo l&#39;induzione dello stress eritropoiesi, eutanasia già dissanguati mouse attraverso il protocollo IACUC approvato (ad esempio CO 2 inalazione seguita da dislocazione cervicale). </li><li> Harvest milza e metterlo in un tubo da 15 ml contenente IMDM 2% FBS e tenere in ghiaccio. </li><li> Di nuovo in laboratorio, nella cappa coltura tissutale in condizioni sterili, invertire tubo-milza contenente un filtro cella 40 micron sulla cima di un tubo da 50 ml. Schiacciare milza usando lo stantuffo di una siringa di plastica 5 ml. </li><li> Lavare filtro cella con IMDM +2% FBS e usando lo stesso mezzo, regolare il volume finale della sospensione cellulare a 5 ml. </li><li> Strato con cautela la sospensione splenocyte 5 ml sulla separazione delle cellule 5 ml gradiente di densità medio 1.083 g / ml in una provetta da 15 ml e centrifugare a 750 xg per 25 minuti a temperatura ambiente, senza accelerazione freno / bassa. </li><li> Trasferimentosurnatante (soluzione fino a circa il marchio 2 ml del tubo 15 ml al fine di acquisire buffy coat) in un tubo da 15 ml ed eseguire un altro lavaggio con IMDM +2% FBS a 525 xg per 5 min a RT . </li><li> Aspirare il surnatante e globuli rossi lisare sospendendo il pellet in 3 ml di tampone di lisi RBC per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 7 ml IMDM +2% FBS per lavare le cellule e per diluire e neutralizzare il tampone di lisi RBC e centrifugare a 525 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Aspirare il surnatante e sospendere le cellule in pellet in 2 ml di mezzo di crescita eritroblasti (EGM). </li></ol></li><li> Cultura isolate splenociti a bassa densità, arricchito in eritroblasti, in plastica (primo stadio di fast cultura eritropoiesi in vitro) <ol><li> Contare le cellule su un contatore di cellule automatico o manualmente da un emocitometro. Solito numero di cellule isolate per la milza in questa fase è ~ 15 x 10 6. </li><li> Sospendere le cellule ulteriormente in EGM contenenti le citochine (afconcentrazioni inali): SCF 50 ng / ml, IL-3 5 ng / ml, e Epo 2 U / ml. </li><li> Piastre 1-5 x 10 6 cellule in un volume finale di 1 ml / pozzetto (stesso numero di cellule per pozzetto a seconda del numero totale di cellule) di una piastra di coltura cellulare da 24 pozzetti ed incubare O / N a 37 ° C / 5% di CO 2. </li></ol></li><li> Cultura della eritroblasti sulle cellule MS5 (seconda fase del digiuno cultura eritropoiesi in vitro <ol><li> Aspirare il surnatante dalla plastica bene e sollevare le cellule (altamente arricchito in eritroblasti) con l&#39;aggiunta di 2 ml di freddo EDTA 10 mM in PBS per 5 min, su ghiaccio in ciascun pozzetto. </li><li> Mettere le cellule in tubi fresche, si lava una volta in EGM (senza citochine) e risospendere nella stessa. </li><li> Tavola 5 x 10 5 -1 x 10 6 cellule in un volume di 1-2 ml per ogni cella MS5 rivestite pozzetto di una piastra da 24 pozzetti. Se inibitori farmacologici vengono utilizzati nell&#39;esperimento, aggiungerli a concentrazioni appropriate momento. </li><li> Incubare per 6-8 ore (tempo guidata daosservazione microscopica di circa il 30% -40% enucleazione nel campione non trattato WT). Il legame di eritroblasti per MS-5 celle accelera la loro enucleazione. </li><li> Sollevare cellule di ogni pozzetto aggiungendo 2 ml di PBS freddo EDTA + 10 mM, per 5 minuti, su ghiaccio. Insieme con i eritroblasti, MS-5 celle saranno raccolti, ma questi possono poi essere facilmente esclusi durante il flusso citometria come FSC hi Ter119 - cellule. </li><li> In questa fase, le cellule possono essere fissate e colorate per l&#39;analisi mediante Multi-Spectral Imaging citometria a flusso. </li></ol></li></ol> 3. Colorazione di eritroblasti per la localizzazione delle proteine ​​intracellulari o lipidi Zattere Durante enucleazione da Multi-spettrale Imaging Citometria a Flusso <ol><li> Lavare le cellule in PBS, centrifugare 525 xg per 5 min a temperatura ambiente e aspirare il surnatante. </li><li> Fix cellule da risospendere pellet cellulari in 500 ml di 3,7% di formaldeide in PBS per 15 minuti (tempo di fissazione variare a seconda antigen essere sondato) e pipettaggio delicatamente. </li><li> Trasferimento a tubi da centrifuga da 1,5 ml di plastica e incubare per 15 minuti a RT. </li><li> Spin su una panchina microcentrifuga 2.000 xg per 20 secondi, aspirare il surnatante ed effettuare un lavaggio con l&#39;aggiunta di 500 microlitri di PBS in ogni provetta e pipettaggio delicatamente. </li><li> Gira su una panchina microcentrifuga 2.000 xg per 20 secondi, aspirare il surnatante e mantenere i tubi in ghiaccio per almeno 15 minuti. Permeablization passaggi 3,6-3,9 dovrebbe essere fatto in modo rapido ed efficiente, e in seguito spinning / aspirazione a RT, pellet cellulari deve essere immediatamente rimesso sul ghiaccio, in modo che le cellule di conservare meglio la loro integrità. </li><li> Prendere soluzioni acetone fuori da -20 ° C freezer e messo in ghiaccio. Permeabilize cellule risospendendo prima pellet cellulari in 500 microlitri ghiacciata del 50% acetone (1:1 con dH 2 O) e pipettare delicatamente. </li><li> Spin sulla panchina microcentrifuga 2.000 xg per 20 sec, aspirare il surnatante e risospendere pellet di cellule in 500 microlitri60; ghiacciata al 100% acetone pipettando delicatamente. </li><li> Spin sulla panchina microcentrifuga 2.000 xg per 20 sec, aspirare il surnatante e risospendere pellet di cellule ancora una volta in 500 microlitri ghiacciata del 50% acetone pipettando delicatamente. </li><li> Spin sulla panchina microcentrifuga 2.000 xg per 20 secondi, aspirare il surnatante e lavare le cellule una volta freddo tampone di FACS (PBS + 0,5% BSA) pipettando delicatamente. </li><li> Preparare etichettatura cocktail con anticorpi o marcatori per le molecole di interesse: 0.1 U/100 microlitri AF488-phalloidin per la colorazione F-actina e 1 μl/100 microlitri Ter119-PECy7 per la colorazione delle cellule eritroide. Colorazione alternativo o aggiuntivo può essere fatto anche con AF-488-anti-β-tubulina anticorpo (1:50), AF-594-coniugato tossina colerica subunità B etichettare raft lipidici (1:200), anti-pMRLC (Ser19) anticorpo primario per la miosina fosforilata catena leggera normativo (1:50), seguito da anti-coniglio AF-488-coniugato anticorpo secondario (1:400), e anti-γ-tubulin anticorpo primario di coniglio (1:100), seguito da anti-coniglio AF-555-coniugato anticorpo secondario (1:300). </li><li> A seguito di aspirazione surnatante, risospendere pellet cellulari in 100 ml di marcatore cocktail, pipetta delicatamente e incubare per 30 minuti a RT. </li><li> Preparare tampone FACS contenente 2,5 mM di macchia DRAQ5 nucleare. </li><li> Lavare le cellule in tampone FACS, spin down sul banco microcentrifuga 2.000 xg per 20 secondi, aspirare il surnatante e risospendere in 60 microlitri di buffer FACS contenente DRAQ5. </li><li> Campioni corrono sulla rappresentazione citofluorimetro raccogliere almeno 10.000 eventi per esperimento, compensare i file di dati grezzi come precedentemente pubblicata 13, e analizzare i risultati come mostrato in Figura 2, utilizzando il software di analisi specifico per imaging citofluorimetro. </li></ol>

<ol>
	<li>McGrath, K. E., Kingsley, P. D., Koniski, A. D., Porter, R. L., Bushnell, T. P., Palis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enucleation+of+primitive+erythroid+cells+generates+a+transient+population+of+&amp;#34;pyrenocytes&amp;#34;+in+the+mammalian+fetus.">Enucleation of primitive erythroid cells generates a transient population of &amp;#34;pyrenocytes&amp;#34; in the mammalian fetus.</a> Blood. 111, 2409-2417 (2008).</li><li>Chasis, J. A., Mohandas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythroblastic+islands:+niches+for+erythropoiesis.">Erythroblastic islands: niches for erythropoiesis.</a> Blood. 112, 470-478 (2008).</li><li>Koury, S. T., Koury, M. J., Bondurant, M. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+measurement+and+compensation+in+spectral+imaging.">Sensitivity measurement and compensation in spectral imaging.</a> Cytometry A. 69, 852-862 (2006).</li></ol>

Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Negli ultimi anni lo studio di enucleazione eritroblasti ha guadagnato crescente slancio poiché è il passo in vitro culture eritropoiesi in che è più difficile da riprodurre in modo efficiente per ottenere successo, la produzione su larga scala di globuli rossi ex vivo. Fino a poco tempo, lo studio di enucleazione eritroblasti utilizzato principalmente microscopia a fluorescenza e citofluorimetria metodi. Metodi di microscopia a fluorescenza, sebbene utili per identificare molecole parteci...

Differenziazione terminale all&#39;interno della linea eritroide nei mammiferi si conclude con il drammatico processo di enucleazione, attraverso il quale il eritroblasti ortocromatica espelle suo nucleo membrana-incassato (pyrenocyte) 1, generando un reticolociti 2. L&#39;esatto meccanismo di questo processo, che è anche il fattore limitante di successo, su larga scala, la produzione di globuli rossi in vitro, non è ancora completamente chiarito. La localizzazione di proteine ​​chiave e strutture all&#39;interno eritroblasti enucleare si basa sull&#39;utilizzo di microscopia a fluorescenza ed elettronica 3-5. Questo processo noioso provoca tipicamente l&#39;identificazione di un numero limitato di eventi enucleazione e non sempre consente l&#39;analisi statistica significativa. Espansione su un metodo di identificazione eritroblasto descritto in precedenza da McGrath et al. 6, abbiamo sviluppato un nuovo approccio per identificare e studiare gli eventi enucleazione da Ima Multi-Spectralging Citometria a Flusso (imaging multiparametrico ad alta velocità cella in flusso, un metodo che combina microscopia a fluorescenza con citometria a flusso) 7, che può fornire un numero sufficiente di osservazioni per ottenere misure ed effettuare analisi statistiche. Qui, descriviamo primi due vitro eritropoiesi metodi di coltura in utilizzati per sincronizzare eritroblasti e aumentare la probabilità di catturare enucleazione al momento della valutazione. Poi descriviamo in dettaglio la colorazione degli eritroblasti dopo fissazione e permeabilizzazione per studiare la localizzazione delle proteine ​​intracellulari o raft lipidici durante l&#39;enucleazione dal flusso di imaging multispettrale citometria. I campioni vengono eseguiti su un flusso di immagini citometro e le cellule raccolte sono gated appropriato per identificare eritroblasti ortocromatiche 6. Eritroblasti ortocromatiche vengono poi analizzati in base al loro rapporto di aspetto, come misurato in campo chiaro imaging, contro il loro valore per il parametro delta centroide XY Ter119-DNA, che è definita come la distanza tra i centri delle aree colorate per Ter119 e DNA, rispettivamente. La popolazione di cellule con basso rapporto di aspetto e di alta baricentro delta XY Ter119/DNA è altamente arricchito in enucleare cellule. Utilizzando wild-type (WT) eritroblasti contro eritroblasti con delezione Mx-Cre mediata condizionale di Rac1 on Rac2 - / - o combinati Rac2 - / -; Rac3 - / - background genetico e questo protocollo di analisi romanzo di flusso di imaging multispettrale citometria, abbiamo recentemente dimostrato che enucleazione assomiglia citochinesi asimmetrico e che la formazione di un anello actomyosin regolata in parte da Rac GTPasi è importante per la progressione enucleazione 7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="934">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">&#945;MEM medium</td>
			<td style="width:199px;">CellGro&#160;</td>
			<td style="width:207px;">15-012-CV</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:363px;">IMDM medium</td>
			<td style="width:199px;">Hyclone (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:207px;">SH30228.01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Stempro-34 SFM</td>
			<td style="width:199px;">GIBCO (Life Tech)</td>
			<td style="width:207px;">10640</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:363px;">Stempro-34 nutrient supplement</td>
			<td style="width:199px;">GIBCO (Life Tech)</td>
			<td style="width:207px;">10641-025</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:199px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:207px;">512450</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">BIT9500</td>
			<td style="width:199px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:207px;">09500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:207px;">BP-1600-100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:199px;">Hyclone (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:207px;">SH30028.02</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:363px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:199px;">Hyclone (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:207px;">SV30010</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:363px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:199px;">Hyclone (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:207px;">SH30590.01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:363px;">Isothesia (Isoflurane)</td>
			<td style="width:199px;">Butler-Schein</td>
			<td style="width:207px;">029405</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Histopaque 1.083mg/ml</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">10831</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:363px;">BD Pharmlyse (RBC lysis buffer)</td>
			<td style="width:199px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:207px;">555899</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Acetone</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:207px;">534064</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:363px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:207px;">BP 531-500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">H4001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Stem Cell Factor (SCF)</td>
			<td style="width:199px;">Peprotech</td>
			<td style="width:207px;">250-03</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Interleukin-3 (IL-3)</td>
			<td style="width:199px;">Peprotech</td>
			<td style="width:207px;">213-13</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:363px;">EPOGEN Epoetin Alfa (Erythropoietin, EPO)</td>
			<td style="width:199px;">AMGEN</td>
			<td style="width:207px;">available by pharmacy</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:363px;">CD44-FITC antibody</td>
			<td style="width:199px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:207px;">553133</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:363px;">CD71-FITC antibody</td>
			<td style="width:199px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:207px;">553266</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:363px;">Ter119-PECy7 antibody</td>
			<td style="width:199px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:207px;">557853</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Phalloidin-AF488</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td style="width:207px;">A12379</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">&#946;-tubulin-AF488 antibody</td>
			<td style="width:199px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:207px;">#3623</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">anti-rabbit AF488-secondary antibody</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td style="width:207px;">A11008</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">anti-rabbit AF555-secondary antibody</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td style="width:207px;">A21428</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">AF594-cholera toxin B subunit</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td style="width:207px;">C34777</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">pMRLC (Ser19) antibody</td>
			<td style="width:199px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:207px;">#3671</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">&#947;-tubulin antibody</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">T-3559</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Syto16</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td style="width:207px;">S7578</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Draq5</td>
			<td style="width:199px;">Biostatus</td>
			<td style="width:207px;">DR50200</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Ferrous sulfate</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">F7002</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Ferric nitrate</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">F3002</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">EDTA</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:207px;">BP120500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:363px;">15ml tubes</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">352099</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:363px;">50ml tubes</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">352098</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:363px;">6-well plates</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">353046</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:363px;">24-well plates</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">351147</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:363px;">Flow tubes</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">352008</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Tuberculin syringe</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:207px;">309602</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Insulin syringe</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:207px;">329461</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Syringe needle 25G5/8</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:207px;">305122</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Capped flow tubes</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:207px;">352058</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:363px;">40&#956;m cell strainer</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">352340</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Scalpel (disposable)</td>
			<td style="width:199px;">Feather</td>
			<td style="width:207px;">2975#21</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">FACS Canto Flow Cytometer</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">ImagestreamX Mark II Imaging Flow Cytometer</td>
			<td style="width:199px;">AMNIS (EMD Millipore)</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:363px;">Image Data Exploration and Analysis Software (IDEAS) version 4.0 and up.</td>
			<td style="width:199px;">AMNIS (EMD Millipore)</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:363px;">Hemavet 950 Cell Counter</td>
			<td style="width:199px;">Drew Scientific</td>
			<td>CDC-9950-002</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">NAPCO series 8000WJ Incubator</td>
			<td style="width:199px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Allegra X-15R Centrifuge</td>
			<td style="width:199px;">Beckman Coulter</td>
			<td>392932</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Mini Mouse Bench centrifuge</td>
			<td style="width:199px;">Denville</td>
			<td style="width:207px;">C0801</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of a murine erythroblast subpopulation  enriched in enucleating events by multi-spectral imaging flow cytometry

Eritropoiesi nei mammiferi si conclude con il drammatico processo di enucleazione che si traduce nella formazione dei reticolociti. Il meccanismo di enucleazione non è stato ancora completamente chiarito. Un problema comune riscontrato quando si studia la localizzazione delle proteine ​​chiave e strutture all&#39;interno erythroblasts enucleare mediante microscopia è la difficoltà di osservare un numero sufficiente di cellule in fase di enucleazione. Abbiamo sviluppato un protocollo di analisi romanzo utilizzando multiparameter imaging cellulare ad alta velocità del flusso (Multi-Spectral Imaging citometria a flusso), un metodo che combina microscopia a immunofluorescenza con citometria a flusso, al fine di individuare in modo efficiente un numero significativo di eventi enucleare, che permette di ottenere misure ed eseguire analisi statistiche. Per prima cosa descriviamo qui due vitro l&#39;eritropoiesi metodi di coltura in utilizzati per sincronizzare erythroblasts murini e aumentare la probabilità di catturare l&#39;enucleazione al secoloe momento della valutazione. Poi, si descrive in dettaglio la colorazione degli eritroblasti dopo la fissazione e permeabilizzazione per studiare la localizzazione delle proteine ​​intracellulari o raft lipidici durante l&#39;enucleazione dal flusso di imaging multispettrale citometria. Insieme con dimensioni e DNA/Ter119 colorazione che vengono utilizzati per identificare gli eritroblasti ortocromatiche, utilizziamo i parametri &quot;rapporto&quot; di una cella nel canale in campo chiaro che aiuta nel riconoscimento delle cellule allungate e &quot;delta baricentro XY Ter119/Draq5 &quot;che permette l&#39;identificazione di eventi cellulari in cui è molto distanti dal centro di DRAQ5 colorazione (nucleo fase di estrusione) al centro di Ter119 colorazione (reticolociti nascente), indicando così una cella per enucleate. Il sottoinsieme della popolazione ortocromatica eritroblasto con l&#39;alta baricentro delta e basso rapporto d&#39;aspetto è altamente arricchito in enucleare cellule.

In primo luogo, le cellule vengono analizzate in base alla loro Brightfield Aspect Ratio (il rapporto tra la lunghezza della loro minore rispetto al loro asse maggiore) e la loro area Brightfield (indicativo della loro dimensione). Eventi di valore Brightfield Area inferiore a 20 e superiore a 200 sono per lo più detriti cellulari e aggregati, rispettivamente, e sono esclusi dall&#39;analisi (Figura 2A). Singole cellule (gate &quot;R1&quot;) sono poi analizzati in base al loro valore per il parametro G...

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Identification of a Murine Erythroblast Subpopulation  Enriched in Enucleating Events by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Il presente protocollo descrive un nuovo metodo di identificazione di una popolazione di enucleare eritroblasti ortocromatiche dal flusso di imaging multispettrale citometria, fornendo una visualizzazione del processo di enucleazione eritroblasti.

Identificazione di un Murine eritroblasto sottopopolazione Enriched in enucleare Eventi da Multi-spettrale Imaging Citometria a Flusso

Erythropoiesis in mammals concludes with the dramatic process of enucleation that results in reticulocyte formation. The mechanism of enucleation has not ...

identification-murine-erythroblast-subpopulation-enriched-enucleating

Research

JoVE Journal

Biology

12.5K Views.  University of Cincinnati College of Medicine.  Il presente protocollo descrive un nuovo metodo di identificazione di una popolazione di enucleare eritroblasti ortocromatiche dal flusso di imaging multispettrale citometria, fornendo una visualizzazione del processo di enucleazione eritroblasti. 

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IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic principle extends that of sandwich ELISA, wherein the captured primary analyte can be detected together with other molecules physically associated within multiprotein complexes. The procedure involves covalent coupling of polystyrene latex microbeads with immunoprecipitating monoclonal antibodies (mAb) specific for a protein of interest, incubating these beads with cell lysates, probing captured protein complexes with fluorochrome-conjugated probes, and analyzing bead-associated fluorescence by flow cytometry. IP-FCM is extremely sensitive, allows analysis of proteins in their native (non-denatured) state, and is amenable to either semi-quantitative or quantitative analysis. As additional advantages, IP-FCM requires no genetic engineering or specialized equipment, other than a flow cytometer, and it can be readily adapted for high-throughput applications.

The IP-FCM method is presented, which allows a sensitive, robust, biochemical assessment of native protein-protein interactions, without requiring genetic engineering or large sample sizes.

IP-FCM: Immunoprecipitazione rilevato mediante citometria di flusso

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

Ricerca

Biologia

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Purificazione Citometria a flusso di cellule di topo Meiotic

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

Ottimizzato Metodi di modellazione e colorazione proliferazione per il monitoraggio divisione cellulare utilizzando coloranti Tracking Cellulari

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

Imaging cellulare dal vivo dei primi autofagia Eventi: Omegasomes e oltre

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo inseguimento 4-dimensionale di emopoietiche staminali e progenitrici celle di topo adulto cranica di Midollo Osseo

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

Misure calcio citosolico nelle cellule epiteliali renali mediante citometria di flusso

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Identification of Intracellular Signaling Events Induced in Viable Cells by Interaction with Neighboring Cells Undergoing Apoptotic Cell Death

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent live cells. Vital activities, such as survival, proliferation, growth, and differentiation, are among the many cellular functions modulated by apoptotic cells. The ability to recognize and respond to apoptotic cells appears to be a universal feature of all cells, regardless of lineage or organ of origination. However, the diversity and complexity of the response to apoptotic cells mandates that great care be taken in dissecting the signaling events and pathways responsible for any particular outcome. In particular, one must distinguish among the multiple mechanisms by which apoptotic cells can influence intracellular signaling pathways within viable responder cells, including: receptor-mediated recognition of the apoptotic cell, release of soluble mediators by the apoptotic cell, and/or engagement of the phagocytic machinery. Here, we provide a protocol for identifying intracellular signaling events that are induced in viable responder cells following their exposure to apoptotic cells. A major advantage of the protocol lies in the attention it pays to dissection of the mechanism by which apoptotic cells modulate signaling events within responding cells. While the protocol is specific for a conditionally immortalized mouse kidney proximal tubular cell line (BU.MPT cells), it is easily adapted to cell lines that are non-epithelial in origin and/or derived from organs other than the kidney. The use of dead cells as a stimulus introduces several unique factors that can hinder the detection of intracellular signaling events. These problems, as well as strategies to minimize or circumvent them, are discussed within the protocol. Application of this protocol should aid our expanding knowledge of the broad influence that dead or dying cells exert on their live neighbors, both in health and in disease.

Here, we present a protocol for the determination of intracellular signaling events induced in viable cells by physical interaction with adjacent dead or dying cells. The protocol focuses on signaling events induced by receptor-mediated recognition of the dead cells, as opposed to their phagocytic uptake or release of soluble mediators.

Identificazione di segnale intracellulare eventi indotta in cellule vitali per interazione con le cellule vicine sottoposti apoptotica delle cellule morte

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

Analisi delle sospensioni cellulari isolate da tessuti solidi da Spectral citometria a flusso

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated with specialization, development and increase in cellular size. In plants, endoreduplication seems to facilitate the growth and expansion of certain tissues and organs. Among them is the tuber of potato (Solanum tuberosum), which undergoes considerable cellular expansion in fulfilling its function of carbohydrate storage. Thus, endoreduplication may play an important role in how tubers are able to accommodate this abundance of carbon. However, the cellular debris resulting from crude nuclear isolation methods of tubers, methods that can be used effectively with leaves, precludes the estimation of the tuber endoreduplication index (EI). This article presents a technique for assessing tuber endoreduplication through the isolation of protoplasts while demonstrating representative results obtained from different genotypes and compartmentalized tuber tissues. The major limitations of the protocol are the time and reagent costs required for sample preparation as well as relatively short lifespan of samples after lysis of protoplasts. While the protocol is sensitive to technical variation, it represents an improvement over traditional methods of nuclear isolation from these large specialized cells. Possibilities for improvements to the protocol such as recycling enzyme, the use of fixatives, and other alterations are proposed.

The protocol described herein is a method for measuring endoreduplication within tubers of potato (Solanum tuberosum). It includes plasmolysis and protoplast extraction steps to decrease the noise and debris in downstream flow cytometric analysis.

Endoreduplicazione tramite flusso Cytometry di tubero isolato protoplasti di misura

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated ...

Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between defective mitophagy and various human diseases, including neurodegenerative diseases, cancer, and metabolic diseases. In addition, recent studies have shown that mitophagy is involved in normal cellular processes, such as differentiation and development. However, the precise role of and molecular mechanisms underlying mitophagy require further study. Therefore, it is critical to develop a robust and convenient method for measuring changes in mitophagy activity. Here, we describe a detailed protocol for quantitatively assessing mitophagy activity through flow cytometry using the mitochondria-targeted fluorescent protein Keima (mt-Keima). This flow cytometry assay can analyze mitophagy activity more rapidly and sensitively than conventional microscopy- or immunoblotting-based methods. This protocol can be applied to analyze mitophagy activity in various cell types.

Mitophagy, the selective degradation of mitochondria, has been implicated in mitochondrial homeostasis and is deregulated in various human diseases. However, convenient experimental methods for measuring mitophagy activity are very limited. Here, we provide a sensitive assay for measuring mitophagy activity using flow cytometry.