L'isolamento delle cellule staminali rimane una sfida importante a causa del co-isolamento delle cellule progenitrici utilizzando i metodi attuali. Abbiamo sviluppato un nuovo saggio privo di biomarcatori per isolare le cellule staminali quiescenti dai progenitori misti. Il principale vantaggio di questo saggio di ritenzione delle etichette a base di sferoidi, può espandere e isolare le cellule staminali vive dai loro progenitori figli da FACS utilizzando l'etichettatura CFSE o Far Red.
Mentre le terapie convenzionali debellano la maggior parte delle cellule tumorali della prostata, le cellule staminali tumorali rimangono dovute alla resistenza terapeutica, guidando così la progressione della malattia. L'isolamento cellulare simile a quello delle staminali consentirà l'identificazione di nuovi geni che possono essere corresponso terapeuticamente per un'efficace remissione delle malattie. Il nostro test di ritenzione di etichette è applicabile per il normale isolamento delle cellule staminali da vari tessuti e cellule e per la ricerca sulle cellule staminali tumorali.
È importante sottolineare che questo test è applicabile ad altri tumori delle cellule epiteliali, come i tumori al seno e al colon-retto. Inizia rivestendo piatti di coltura da 100 millimetri con due millilitri di soluzione di fibronecina da 2,5 microgrammi e incubali durante la notte a temperatura ambiente. Quindi aspirare la soluzione e lasciare asciugare all'aria i piatti di coltura nell'armadio della biosicurezza per 45 minuti.
Aggiungere nove millilitri del mezzo di crescita delle cellule epiteliali della prostata a un piatto rivestito di fibronectina e tenerlo caldo nell'incubatrice di anidride carbonica a 37 gradi Celsius. Scongelare una fiala di cellule epiteliali prostatiche umane congelate in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius e rimescolare le cellule in 10 millilitri di mezzo caldo. Centrifugare la sospensione cellulare a 500 volte g per cinque minuti.
Quindi aspirare e scartare il supernatante. Risosopendare le cellule in un millilitro di mezzo di coltura caldo e trasferire un millilitro della sospensione direttamente al piatto rivestito di fibronectina con il mezzo preri warmed. Quindi incubare il piatto nell'incubatrice di anidride carbonica a 37 gradi Celsius.
Se coeticheggiate le celle, preparate le celle etichettate BrdU in 10 giorni di coltura 2D come descritto nel manoscritto testuale. Quindi aggiungere cinque CFSE micromolare o Far Red e incubare le cellule per 30 minuti. Dopo l'incubazione, aspirare attentamente il mezzo con il colorante e lavare le cellule due volte con cinque millilitri di PBS caldo.
Successivamente, eseguire la digestione enzimatica con EDTA allo 05% di tripidi secondo le indicazioni del manoscritto. Centrifugare le cellule a 500 volte g per cinque minuti e scartare il supernatante. Le cellule sono state rimonite in una matrice di membrana basale a uno ghiacciata e one-to-one e in un mix di mezzi di coltura per la formazione di prostasfera 3D.
Per preparare la coltura della prostasfera in un sistema a matrice basale 3D, scongelare la matrice della membrana basale a quattro gradi Celsius durante la notte e tenerla sul ghiaccio prima dell'uso. Quindi aggiungere delicatamente un millilitro di matrice di membrana basale ghiacciata in un volume uguale di mezzo di coltura ghiacciato-freddo. Pipetta su e giù per mescolare, facendo attenzione a non introdurre bolle d'aria.
Resuspend cinque volte da 10 a 1/4 cellule epiteliali della prostata umana nella matrice di membrana basale uno-a-uno ghiacciata e nel mix di mezzi di coltura per un volume totale di 500 microlitri. Pipettare la soluzione sul bordo inferiore di ogni pozzo e ruotare la piastra per distribuire uniformemente la miscela. Posizionare la piastra in un incubatore di anidride carbonica di 37 gradi Celsius per 30 minuti per consentire alla matrice di solidificarsi.
Quindi coprirlo con un millilitro di mezzo di coltura caldo per pozzo, assicurandosi di non disturbare l'anello. Per raccogliere le prostasfere etichettate CFSE sostituire il mezzo con due millilitri dispasi e pipetta su e giù per mescolare più volte. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 30 minuti per digerire la matrice, quindi raccogliere la miscela di sfera in un tubo di centrifuga da 15 millilitri.
Centrifugare le sfere a 500 volte g per cinque minuti e scartare il supernatante. Resuspend il pellet in 500 microlitri di EDTA caldo allo 05% di tripside e trasferirli in un tubo di centrifuga da 1,5 millilitri. Incubare le sfere a 37 gradi Celsius per cinque minuti, quindi aggiungere 500 microlitri di PBS caldo con 10%FBS.
Passali attraverso una siringa da un millilitro con un ago calibro 26 per dissociare completamente le sfere. Centrifugare le cellule a 500 volte g per cinque minuti. Quindi aspirare e scartare il supernatante.
Resopendare le cellule in un millilitro di mezzo di coltura calda con un microgrammo per millilitro propidioduro per macchiare le cellule morte e incubarle per un minuto a temperatura ambiente. Ripetere la centrifugazione e scartare il supernatante. Quindi lavare le cellule con un millilitro di mezzo caldo.
Ripetere la centrifugazione e scartare il supernatante. Rimescolare le cellule in un millilitro di mezzo di coltura caldo e raccogliere le cellule in tubi inferiori rotondi in polistirolo da cinque millilitri filtrandole attraverso tappi a scatto a pressione cellulare di dimensioni dei pori da 35 micron. Eseguire l'analisi FACS delle cellule prostasfera con etichetta CFSE disperse in tripina.
Utilizzando celle non etichettate come controllo negativo e celle etichettate CFSE come controllo positivo per impostare i gate, eseguire il campione per ordinare e raccogliere le sottopopolazioni di cellule frazionate ad alto CFSE e CFSE-low. Le cellule epiteliali primarie normali della prostata umana sono state collocate in piatti di coltura rivestiti di fibronectina e la crescita cellulare è stata mantenuta nella coltura 2D. Dopo il trasferimento in una coltura 3D con una matrice di membrana basale, le cellule epiteliali differenziate si escono lentamente e solo le cellule staminali della prostata sono rimaste.
La doppia etichettatura delle cellule epiteliali prostatiche in coltura 2D seguita dalla formazione di sferoidi nella coltura 3D ha mostrato la colocalizzazione di BrdU, CFSE e Far Red nelle stesse cellule che mantengono l'etichetta. La doppia immunostaining ha dimostrato che le cellule che mantengono l'etichetta mostrano livelli più bassi di cheratina proteica di citocheratina 14, diminuzione della proteina di giunzione cellulare E-cadherin, aumento delle proteine marcatori precoci delle cellule staminali Wnt10b e ALDH1A1, aumento della proteina autofagia LC3 e aumento della miosina IIB. Inoltre, il test di ritenzione delle etichette a base di sferoide rileva con successo cellule simili a staminali tumorali negli esemplari di cancro alla prostata.
Le cellule tumorali e gli sferoidi con etichetta CFSE che mantengono cellule tumorali simili a staminali e sferoidi derivati da campioni di cancro alla prostata umano presentavano una proteina E-cadherina ridotta rispetto alle cellule progenitrici non etichettate. Quando si tenta questo protocollo, è importante mantenere la matrice in forma liquida per la preparazione del mezzo di coltura. Conservarlo durante la notte a quattro gradi e raffreddare le punte delle pipette in PBS ghiacciato prima della matrice di erogazione.
Dopo l'isolamento delle cellule staminali utilizzando il saggio di ritenzione di etichette a base di sferoide, è possibile eseguire il sequenziamento dell'RNA a singola cellula e l'analisi proteomica per identificare geni specifici e nuovi biomarcatori nelle cellule staminali. L'isolamento delle cellule staminali tumorali vive da parte del saggio di ritenzione di etichette a base di sferoide consente ai ricercatori di coltivare tumori derivati da cellule staminali tumorali in vitro e di migliorare nuovi farmaci antitumorali.
