La nostra ricerca si concentra sull'utilizzo delle proprietà uniche degli idrogel granulari per studiare il movimento cellulare e le funzioni per la rigenerazione dei tessuti. La risposta cellulare al microambiente è importante per la comprensione delle implicazioni per l'impatto traduzionale. Con l'aumento dell'uso di scaffold 3D port, aumenta anche la necessità di saggi di migrazione 3D completi che replicano meglio il comportamento cellulare in un ambiente di guarigione delle ferite.
Abbiamo sviluppato due pipeline tridimensionali, dallo sviluppo dello scaffold all'imaging e all'analisi, per studiare il movimento e la migrazione cellulare in vitro. Con questi due nuovi saggi, abbiamo acquisito la capacità di tracciare le cellule reattive in due fasi distinte della guarigione delle ferite: l'infiltrazione iniziale dell'impalcatura dal tessuto sfuso e il movimento cellulare una volta circondato da un'impalcatura complessa. Per iniziare, piastra 120.000 cellule di fibroblasti dermici umani per centimetro quadrato in almeno sei pozzetti di una piastra da 96 pozzetti.
Dopo l'incubazione notturna, rimuovere il terreno dai pozzetti cellulari utilizzando un aspiratore o una pipetta. Aggiungere il colorante in 20 microlitri di ciascuna condizione di gel ai pozzetti utilizzando una pipetta a spostamento positivo. Utilizzando un accessorio per centrifuga a rotore rotante a piastra impostato a 25 gradi Celsius, far girare la piastra a 100 g per 15 secondi con accelerazione e decelerazione impostate su 8 per appiattire il gel.
Capovolgere la piastra di 180 gradi e ruotarla di nuovo per garantire una distribuzione uniforme del gel sul fondo del pozzetto. Per fotoreticolare in modo asettico il gel, applicare una luce focalizzata a 365 nanometri per 30 secondi per ricuocere l'impalcatura. Dopo aver formato tutti gli scaffold, aggiungere 200 microlitri di terreno in ciascun pozzetto e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti.
Usa un microscopio confocale per visualizzare le cellule e catturare il loro comportamento di migrazione. Per l'analisi delle immagini, aprire il software di conversione delle immagini Imaris per le conversioni batch. Trascina e rilascia le immagini al microscopio nel software di conversione e seleziona una cartella all'interno dell'arena del software per importare i file.
Seleziona ogni file individualmente per impostare la dimensione del voxel. Premere Avvia tutto per avviare la conversione. Successivamente, nel software Imaris Arena, selezionare un'immagine dall'arena per iniziare l'elaborazione.
Fare clic sulla scheda Image Pros nella barra degli strumenti principale. Ora, fai clic sul menu a discesa per il canale 1 e seleziona Sottrazione sfondo. Premere OK per tornare alla vista 3D.
Nella barra degli strumenti piccola, fare clic sull'icona con le forme blu arrotondate con l'etichetta Aggiungi nuove superfici per creare una scheda di oggetti modificabile denominata Superfici 1. Generare manualmente i parametri per tutte le repliche utilizzando il pulsante freccia blu. Impostate il dettaglio della superficie su 0,7 micrometri e selezionate Sottrazione sfondo, Contrasto locale.
Inserire la lunghezza media della cella nel diametro della sfera più grande, che si adatta alla casella dell'oggetto. Per la soglia di soglia, determinare l'istogramma dell'intensità per segmentare solo le celle più luminose. Abilita Dividi oggetti che toccano, Crescita regione e imposta il diametro dei punti di partenza in modo che corrisponda al diametro utilizzato in precedenza.
Per salvare i parametri di creazione per l'analisi batch, fare clic sull'icona della bacchetta con l'etichetta Creazione. Fare clic su Memorizza parametri per batch, assegnare un nome al file e fare clic su OK. Per raccogliere tutte le altezze delle celle, fare clic sulla scheda Dettagli. Seleziona valori specifici, quindi Posizione Z dai menu a discesa.
Fare clic sull'icona Salva per esportare tutte le posizioni e le classificazioni Z in un file XLS. Per iniziare, versare il PBS in una piastra di Petri sotto la cappa laminare e pipettare goccioline da 20 microlitri della soluzione di terreno cellulare sul coperchio capovolto della piastra di Petri. Riposizionare il coperchio sulla piastra e incubare la piastra per ottenere sferoidi 3D coltivati con goccioline sospese.
Per impostare PLOSMA, utilizzare una pipetta a spostamento positivo per aggiungere asetticamente 15 microlitri di gel ai pozzetti di una piastra trasparente a 96 pozzetti. Utilizzando un accessorio per centrifuga a rotore rotante a piastra, far girare la piastra a 1.000 g per 10 secondi per appiattire il gel. Capovolgere la piastra di 180 gradi e girare di nuovo per garantire una distribuzione uniforme del gel.
Quindi, applicare la luce focalizzata a 365 nanometri per 30 secondi per ricuocere l'impalcatura e fotoreticolare il gel dall'alto. Spostare asetticamente la capsula di Petri di goccioline sospese nella cappa di coltura tissutale e capovolgere il coperchio. Utilizzando una pipetta da 20 microlitri, aspirare lentamente una gocciolina fino a quando lo sferoide non entra nella punta della pipetta ed espellere la gocciolina sull'impalcatura al centro del pozzetto.
Incubare la piastra a pozzetti a 37 gradi Celsius per due ore per consentire agli sferoidi di attaccarsi all'impalcatura. Dopo l'incubazione, pipettare altri 15 microlitri di gel sopra ogni sferoide. Centrifugare la piastra a 300 g per 15 secondi in ciascuna direzione per garantire una distribuzione uniforme del gel.
Ricuocere lo strato superiore di gel per utilizzare la luce ultravioletta come dimostrato in precedenza. Posizionare la piastra sotto un microscopio confocale e visualizzare gli sferoidi dopo aver selezionato i piani Z più bassi e più alti. Dopo aver importato le immagini nel software Imaris Arena, fai clic sul menu a discesa per il canale 1 e seleziona Sottrazione sfondo.
Premere OK nella parte inferiore del pannello. Nella vista 3D, premere Regolazione automatica di tutti i canali nella finestra popup Regolazione schermo e apportare le correzioni necessarie. Nella barra degli strumenti più piccola, fare clic sull'icona Aggiungi nuovo piano di riferimento per creare una scheda denominata Piano di riferimento 1.
Sposta l'origine al centro dello sferoide in tutti e tre i piani. Nella stessa barra degli strumenti, fai clic sull'icona con le sfere arancioni per aggiungere nuovi punti, creando una scheda denominata Macchie 1, e premi il pulsante freccia blu per procedere. Per la soglia di soglia, regolare l'istogramma dell'intensità per segmentare solo le parti più luminose.
Usa il filtro dei dati per spostarti nella pila di immagini per una maggiore precisione. Premere tre volte la freccia blu Avanti. Deseleziona Rendering su filtro dei dati o fai clic sull'icona del quadrato giallo nel pannello di configurazione.
Fare clic sulla scheda Statistiche. Nei menu a discesa, selezionare valori specifici e distanza dal piano di riferimento di origine. Fare clic sull'icona Salva.
Per salvare tutte le modifiche e le analisi, fare clic sull'icona Salva nella barra degli strumenti principale. Questo metodo è stato utilizzato per valutare l'infiltrazione cellulare in un'interfaccia tissutale. La posizione mediana nell'asse Z delle cellule in migrazione è aumentata significativamente da zero a 24 ore, indicando un notevole movimento verticale delle cellule.
La variazione di piega nella migrazione cellulare lungo l'asse Z è raddoppiata dopo 24 ore. La cellula seminata con il metodo PLOSMA ha dimostrato una significativa diffusione e migrazione dal nucleo sferoidale dopo 24 ore. I rendering tridimensionali hanno mostrato un'estesa diffusione delle celle nell'impalcatura PLOSMA dopo 24 ore, con proiezioni visibili che si estendevano verso l'esterno.
Le immagini 3D elaborate utilizzando la funzione Spots hanno rivelato posizioni di cellule disperse nell'impalcatura, indicando una migrazione diffusa. Le cellule hanno percorso una distanza media di oltre 200 micrometri con risultati coerenti tra i campioni. La variazione di piega dell'altezza Z delle celle nell'impalcatura PLOSMA è stata di circa 4, indicando un sostanziale movimento verso l'alto.
