L'ambito della nostra ricerca si concentra principalmente sullo sviluppo di cellule ICS CAR NK umane con una migliore attività antitumorale e persistenza in vivo per trattare meglio diversi tumori maligni. Con questo nuovo protocollo di generazione CAR iPSC NK, miriamo a rispondere a come queste cellule possono superare la resistenza micro ambientale del tumore e migliorare l'efficacia e garantire una produzione sicura e scalabile. Le principali sfide sperimentali nello sviluppo di cellule CAR NK derivate da iPSC includono il raggiungimento di una differenziazione coerente ed efficiente di iPSC in casi funzionali, garantendo un'espressione CAR stabile senza effetti avversi e migliorando la persistenza in vivo.
Inoltre, i ricercatori devono affrontare sfide in termini di scalabilità, rigetto immunitario e detentori di normative per applicazioni cliniche. Abbiamo fatto progredire in modo significativo la ricerca sulle cellule CAR NK derivate da iPSC stabilendo un'efficiente integrazione genica CAR non virale utilizzando modifiche geniche basate su trasposoni. Inoltre, abbiamo ottimizzato CRISPR-Cas9 a livello di iPSC per eliminare i checkpoint immunitari, i fattori TMA per migliorare e l'efficacia delle cellule e dei tumori e la persistenza in vivo nei modelli di tumore solido.
Con il nostro protocollo che utilizza l'espressione genica CAR mediata da vettori piggyback non virali, miriamo a colmare il divario per lo sviluppo di modificazioni geniche sicure, efficienti e scalabili per le cellule iPSC CAR NK, questo metodo riduce il rischio di mutagenesi inserzionale e migliora la riproducibilità e l'efficacia in termini di costi della generazione di cellule CAR NK per l'immunoterapia del cancro. In futuro il nostro laboratorio si concentrerà sullo sviluppo di nuove cellule NK ingegnerizzate derivate da iPSC che mirano ai checkpoint immunitari. Studieremo anche il targeting di vari fattori microambientali tumorali utilizzando anticorpi bispecifici o trispecifici per migliorare la specificità in vivo, la persistenza e l'attività antitumorale.
Per iniziare il passaggio di formazione del corpo embrionale di spin o EB, circa 200.000 iPSC CAR ingegnerizzate per pozzetto in una piastra precodificata a matrice di membrana basale a sei pozzetti contenente surplus di MT, incubare le cellule a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5%, dopo due giorni, rimuovere il terreno di coltura e staccare le cellule incubando con un millilitro di TrypLE Select preriscaldato a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Quindi dissociare attentamente gli aggregati cellulari in una sospensione a cellula singola e trasferire la sospensione in un tubo conico da 15 millilitri. Aggiungere tre millilitri di PBS per fermare la reazione di dissociazione.
Successivamente, risospendere le cellule nel terreno MK SR-plus e filtrarle attraverso un colino cellulare da 70 micrometri per rimuovere gli aggregati. Centrifugare le cellule. Lavare il pellet con cinque millilitri di PBS e poi rimetterli in sospensione in un millilitro di terreno di formazione EB.
Dopo il conteggio, diluire le cellule alla densità appropriata utilizzando un terreno di formazione EB contenente citochine e 10 inibitori micromolari di ROCK. Utilizzando una pipetta multicanale, seminare da 3000 a 10.000 cellule per pozzetto in 100 microlitri di terreno EB in una piastra da 96 pozzetti. Centrifugare le cellule a 300 G per cinque minuti e incubare a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per sei giorni.
Per verificare la qualità del corpo dell'embrione, preparare prima quattro millilitri di tripsina preriscaldata allo 0,25% con siero di pollo allo 0,4% per dissociare gli EB. dopo sei giorni trasferire da 10 a 30 EB in una provetta conica da 15 millilitri. Aggiungere la soluzione di siero di pollo alla tripsina agli EB e incubarli a bagnomaria.
Vortice degli EB durante la dissociazione ogni tre-cinque minuti per 10 minuti. Pipettare più volte gli EB tripsinizzati mescolandoli su e giù per garantire una dissociazione completa. Quindi aggiungere cinque millilitri di PBS per fermare il processo di tripsinizzazione.
Filtrare la soluzione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 micrometri in un nuovo tubo conico. Centrifugare quindi le celle a 300 G per cinque minuti e risospendere il pellet in tre-cinque millilitri di terreno EB fresco. Dopo il conteggio, colorare le cellule con i tipici marcatori EB.
Aggiungere il volume raccomandato di anticorpi a ciascuna provetta contenente singole cellule dissociate di EB in 100 microlitri di tampone di flusso e incubare su ghiaccio per 30 minuti. Dopo l'incubazione, lavare le cellule due volte con un tampone di flusso. Aggiungere il colorante vivo morto blu SYTOX e analizzare utilizzando l'analisi di citometria a flusso.
Inizia codificando ogni pozzetto di una piastra a sei pozzetti con da cinque a 10 microlitri di una soluzione di gelatina sterilizzata al 2%. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per due o quattro ore. Dopo l'incubazione, aspirare la soluzione di gelatina rimanente e aggiungere tre millilitri del natural killer o del terreno di differenziazione NK contenente citochine a ciascun pozzetto della piastra a sei pozzetti rivestita di gelatina.
Quindi, utilizzando una pipetta da un millilitro, trasferire con cura gli spin EB derivati da iPSC CAR ingegnerizzati in un piatto di 10 centimetri. Aggiungere tre millilitri di terreno di differenziazione NK contenente citochine a ciascun pozzetto della piastra a sei pozzetti. L'uso di una micropipetta da un millilitro distribuisce da 16 a 20 EB in ciascun pozzetto della piastra a sei pozzetti e incuba a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per tre o quattro settimane.
Dopo l'incubazione, valutare l'espressione dei marcatori delle cellule NK CD45 positivi e CD56 positivi mediante citometria a flusso su cellule in sospensione. Quando più dell'80% delle cellule di sospensione esprime CD45 positivo e CD56 positivo. Raccogli le cellule passandole attraverso un filtro da 70 micrometri per rimuovere i grumi.
Prima di co-coltivare le cellule presentanti l'antigene artificiale o le APC artificiali all'interno delle cellule NK, irradiare le APC artificiali con 100 gray e conservarle come steli congelati. Dopo aver raccolto le cellule NK, coltivarle a una densità di cinque volte 10 alla potenza di cinque cellule per millilitro in terreno di espansione NK integrato con 50 unità per millilitro di interleuchina-2 e interleuchina-15. Aggiungere lo scongelamento di APC artificiali irradiate alle cellule NK in un rapporto di uno a uno e incubare a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.
Per iniziare, accendere il citometro a flusso. Valutare l'espressione del recettore di attivazione NK sulle cellule NK derivate da iPSC anti GPC3 CAR per determinare l'attività delle cellule CAR e lo stato di maturazione. Per i saggi Caspasi-3/7.
Contare le cellule bersaglio nelle cellule NK derivate da GPC3 CAR iPSC e pre-colorarle con il colorante CellTrace Violet a una concentrazione finale di cinque micromolari in PBS sotto protezione dalla luce per 15 minuti a 37 gradi Celsius. Lavare le cellule bersaglio della colorazione in un terreno di coltura completo Prima della co-coltura con cellule NK derivate da CAR iPSC a vari rapporti effettore/bersaglio a 37 gradi Celsius. Dopo tre ore e 30 minuti di co-cultura.
Aggiungere il reagente di rilevazione verde Caspase-3/7 e incubare per altri 30 minuti. Aggiungere la soluzione di colorazione a cellule morte SYTOX durante gli ultimi cinque minuti di colorazione e mescolare delicatamente. Analizzare le cellule colorate utilizzando la citometria a flusso.
La formazione di EB di spin da IPC ingegnerizzati con GPC3 CAR è stata osservata il sesto giorno. Conferma della differenziazione precoce. Le cellule natural killer o NK differenziate da IPC GPC3 CAR hanno mostrato una morfologia distinta in varie fasi dal terzo al giorno 28.
L'analisi citofluorimetrica dimostra l'espressione degli antigeni ematopoietici CD34 e CD31, nonché di una piccola quantità di CD43 ma non ancora esprimente CD45 sia negli EB di spin derivati da iPSC CAR wild type che GPC3 il sesto giorno. Nel caso specifico, i marcatori sono stati rilevati in wild type maturo in cellule NK GPC3 CAR derivate da iPSC al giorno 35. Conferma del successo della differenziazione in cellule NK.
Le cellule NK espanse wild type e anti GPC3 CAR iPSC hanno mostrato vari marcatori di attivazione, dimostrando la maturazione delle cellule NK. L'espressione dell'antigene GPC3 è stata confermata su linee cellulari tumorali mediante citometria a flusso, convalidando la specificità del bersaglio per le cellule NK derivate da iPSC anti GPC3 CAR. Le cellule NK derivate da iPSC antiGPC3 CAR hanno dimostrato una maggiore attività citotossica contro le linee cellulari GPC3 che esprimono HepG2, SNU-449, CAL 27 e SKOV3 rispetto alle cellule NK iPSC wild type.
