Questo protocollo fornisce un metodo funzionale a lungo termine, in vitro, per la valutazione del recettore dell'antigene chimerico, o cellule CAR T, attraverso la sfida ripetitiva delle cellule tumorali. Questa tecnica richiede meno tempo e meno lavoro rispetto alla valutazione in vivo della funzione cellulare CAR T, pur ottenendo una rappresentazione accurata della vera efficacia antitumonale. Questa tecnica in vitro consente lo screening ad alta produttività e la differenziazione della potenza antitumomica delle cellule CAR T.
Che ha la potenziale applicazione per valutare l'efficacia clinica dei prodotti cellulari CAR T. Inizia dissociando le tumorisfere del glioblastoma da una cultura della tumorsfera del glioblastoma. Con un millilitro di accutasi a freddo e da 30 a 60 secondi di pipettazione.
Quando le tumorisfere sono state interrotte, interrompere la reazione con cinque millilitri di mezzo caldo di co-coltura. E pellettò le sospensioni delle cellule tumorali per centrifugazione. Sospendere di nuovo le cellule del glioblastoma a 1,6 volte 10 alla quinta colonna tumorale per millilitro di concentrazione media di cocoltura fresca e diluire le cellule T raccolte da una coltura cellulare CAR T alla percentuale appropriata di cellule T positive CAR per millilitro di concentrazione media di co-coltura.
Successivamente, aggiungere 100 microlitri delle cellule tumorali diluite a ciascun pozzo di una piastra di coltura del tessuto del tessuto ben piatta. E 100 microlitri di cellule CAR T in ogni pozzo di cellule tumorali con miscelazione delicata. Quindi posizionare la piastra in un incubatore di anidride carbonica di 37 gradi Celsius, 5%.
Nei giorni due, quattro e sei di coltura, rimuovere con cura 50 microlitri di mezzo da ogni pozzo della cellula tumorale, la piastra di co-coltura delle cellule T prevista per la ridiscussa secondo la tabella. Quindi, aggiungere 50 microlitri di sospensione cellulare di glioblastoma fresco, preparati come appena dimostrato, ma con il doppio del numero cellulare della cocoltura iniziale ad ogni pozzo con miscelazione delicata. E riportare il piatto nell'incubatrice di coltura cellulare.
I giorni uno, tre, cinque e sette di co-coltura, trasferiscono il supernatante da ogni pozzo per essere raccolto in una nuova piastra inferiore ben rotonda 96 secondo la tabella e aggiungono 50 microlitri di EDTA di triptarina pre-riscaldata allo 0,5% in ogni pozzo impoverito medio. Dopo cinque minuti a 37 gradi Celsius, confermare che le cellule si sono staccate dal fondo di ogni pozzo mediante microscopia leggera e pipettare delicatamente la soluzione enzimatica intorno al fondo di ogni pozzo per rimorsi le cellule. Prima di trasferire la sospensione cellulare staccata nei pozzi corrispondenti appropriati della nuova piastra da 96 pozzi.
Pellet le cellule per centrifugazione e lavare le cellule con 200 microlitri di soluzione stagnante di smistamento cellulare attivata fluorescenti, o FFS per pozzo con una seconda centrifugazione. Sospendere di nuovo i pellet in 100 microlitri del cocktail anticorpale di interesse in 100 microlitri di SSS per pozzo per un'incubazione di 30 minuti a quattro gradi Celsius. Alla fine dell'incubazione rimuovere qualsiasi anticorpo non legato da lavaggi FSS sequenziali da 100 e 200 microlitri e sospendere le cellule in 100-200 microlitri di macchia nucleare DAPI e FSS.
Quindi, analizzare le cellule in base ai protocolli di analisi citometrica a flusso standard. Per l'analisi funzionale e fenotipico delle cellule CAR T dopo la co-coltura delle cellule tumorali, recuperare i file di dati dal citometro di flusso e gate tutte le cellule negative DAPI vive. Per quantificare le cellule tumorali, gate la popolazione negativa cd45.
Per quantificare le cellule CAR T gate la popolazione positiva di CAR CD45. Quindi tracciare i numeri delle cellule tumorali e CAR T nel corso del tempo dell'esperimento, identificando l'attivazione delle cellule T mediante la co-espressione di 41BB e CD69. Esaurimento delle celle T per l'espressione di PD1, LAG3 e TIM3, stato della memoria della cella T LAG3 e TIM3, stato della memoria della cella T da CD45RO ed espressione ligando CD62.
da CD45RO, ed espressione ligando CD62. Sia le cellule CAR T positive CD4 che CD8 positive si attivano ugualmente contro le cellule del glioblastoma che esprimono l'antigene bersaglio come indicato dalla loro espressione di citochina CD107a e intracellulare. Tuttavia, come valutato da una sfida tumorale ripetitiva SA, CD4 positivo, ma non cd8 positivo, le cellule CAR T sono in grado di uccidere più round.
Anche le celle CAR T positive cd4 ottengono un'espansione più robusta. Quando le cellule CAR T positive CD4 e CD8 sono mescolate con un rapporto uno a uno, questa combinazione di cellule esegue cellule CAR T positive CD8, ma non POSITIVE CD4 in termini di citotossicità a lungo termine. Inoltre, l'espansione delle cellule CAR T positive cd8 è indotta dall'aggiunta di cellule T positive CD4.
Mentre l'espansione positiva delle cellule CAR T CD4 è inibita in presenza di cellule positive CDa. 24 ore dopo la cocoltura iniziale, sia le cellule CAR T positive CD4 che CD8 positive sono attivate in modo simile. Durante la sfida del tumore ripetitivo, sia le cellule CAR T positive CD4 che CD8 positive dimostrano una transizione da un fenotipo di memoria centrale positivo CD45RO, cd62 ligan positivo, a un fenotipo di memoria ligan cd45RO positivo CD45RO.
Le cellule CAR T positive CD8 sono anche più soggette all'esaurimento rispetto alle cellule CAR T positive CD4 valutate dalla loro espressione PD1, GAL3 e TIM3 dopo tre giorni di co-coltura. Inoltre, nessuna differenza osservata nell'esaurimento positivo delle cellule CAR T CDa in presenza o assenza di cellule T positive CD4, indicando che l'espansione positiva delle cellule CAR T CD4 indotta da CD4 non è associata a una migliore funzione di effettore. Questo saggio può anche essere accoppiato con lo smistamento delle cellule T formando la co-coltura per eseguire ulteriori analisi su trascrittimi, proteomica e specifici geni di interesse.
Questa sfida tumorale ripetitiva potrebbe anche essere utilizzata come piattaforma per indagare gli eventi biologici post car t riconoscimento del tumore delle cellule T.
