Il nostro protocollo di laboratorio consente la combinazione dell'editing del genoma umano con la terapia con cellule T CAR. La procedura di laboratorio è l'approccio con CRISPR-Cas9 al targeting di un massimo di tre geni ad alta efficienza. E infine, il nostro approccio può essere tradotto in studi clinici sull'uomo.
I metodi descritti possono essere applicati ad altri costrutti CAR e geni bersaglio. Le basi delle tecniche sono abbastanza robuste da essere tradotte su larga scala e in collaboratori accademici e industriali per un ulteriore sviluppo. Quando si tenta questo protocollo per la prima volta, limitare il numero di gruppi nello schermo dell'RNA guida per consentire tempi di incubazione accurati.
L'adesione alle condizioni di coltura e la densità di semina come descritto si sono dimostrate fondamentali nella nostra esperienza. Per iniziare, ottenere cellule mononucleate autologhe del sangue periferico, o PBMC, da donatori volontari sani e isolare le cellule T CD4 e CD8 positive utilizzando kit di selezione CD4 e CD8 disponibili in commercio. Combina le cellule T CD4 positive e CD8 positive in un rapporto uno a uno e incuba 3 milioni di cellule per millilitro in R10, integrate con 5 nanogrammi per millilitro di ogni IL7 umano e IL15 umano durante la notte a 37 gradi Celsius.
Il giorno successivo, contare le cellule T e centrifugare da 5 a 10 milioni di cellule a 300 volte G per cinque minuti. Scartare tutto il surnatante e lavare il pellet cellulare in un siero ridotto con mezzi essenziali minimi. Sospendere di riconsedere il pellet in 100 microlitri di soluzione di affezione nucleare secondo le istruzioni del produttore.
Durante il lavaggio delle cellule, preparare una ribonucleoproteina, o complesso RNP, incubando 10 microgrammi di nucleasi Cas9 con 5 microgrammi di RNA guida singola per 10 minuti a temperatura ambiente. Includi un controllo fittizio senza RNA guida singola. Combinare le celle ri-sospese con il complesso RNP e aggiungere 4,2 microlitri di quattro potenziatori di elettroporazione micromolare.
Mescolare bene e trasferire in cuvette elettroporatorie. Elettroporate le celle utilizzando il codice a impulsi EH111, quindi incubare 5 milioni di cellule per millilitro in R10, integrate con 5 nanogrammi per millilitro umano IL7 e UMANO IL15 a 30 gradi Celsius per 48 ore in 12 piastre di pozzo. Dopo l'incubazione, procedere con l'attivazione e l'espansione delle cellule T.
Progettare i primer di sequenziamento inserendo la sequenza dell'amplicon PCR in un software di progettazione di primer standard. Il software di progettazione suggerirà più sequenze di primer adatte per il sequenziamento Sanger. Scegli primer avanti e indietro che leghino con l'amplicon almeno 150 coppie di basi a monte o a valle del sito di taglio del gRNA per garantire una buona qualità di sequenziamento intorno agli indel.
Utilizza l'analisi TIDE per rilevare l'efficienza del knockout a livello genomico. L'algoritmo ricostruisce accuratamente lo spettro degli indel dalle tracce di sequenza e calcola i valori quadrati R. Dopo l'attivazione, le cellule T vengono espanse in coltura e crioconservate per studi futuri.
Durante l'espansione, il raddoppio della popolazione e le variazioni di volume vengono monitorati in tutto il protocollo sia per le cellule T CAR simulate che modificate. Non sono stati rilevati cambiamenti significativi nella proliferazione e nell'attivazione durante l'espansione. Una volta che le cellule sono state crioconservate, i livelli di espressione di CAR sono stati determinati per ulteriori studi funzionali sia per le cellule T CAR finte modificate che per quelle knockout.
Non sono stati osservati cambiamenti significativi. L'efficienza di knockout può essere determinata utilizzando più tecniche. In questi grafici rappresentativi di citometria a flusso, i loci PDCD1 e TRAC sono stati presi di mira utilizzando RNA guida singolo, mostrando un'efficienza del 90% per l'RNA guida singolo PDCD1 e del 98% per l'RNA guida singolo TRAC su più donatori sani.
È importante assicurarsi che i rapporti molari di Cas9 e RNA guida siano accurati. Durante la procedura, le cellule devono essere sempre mantenute a quattro gradi Celsius e non essere lasciate nella soluzione di elettroporazione per lunghi periodi di tempo. Dopo la conservazione della CAR, le cellule T CAR ingegnerizzate CRISPR possono essere utilizzate per saggi funzionali in vitro e in vivo, come saggi di citotossicità, produzione di citochine e modelli murini di tumori singenetici o xenografici.
Il nostro approccio utilizzando la tecnologia CRISPR Cas9 viene ora applicato agli studi clinici. L'approccio può essere utilizzato sia per il cancro, sia per un disordine genetico non maligno, come le emoglobinofatà, che colpiscono milioni di bambini e adulti in tutto il mondo.
