La nostra ricerca principale si concentra sulla diversità microbica, sulla filogenomica e sulle applicazioni della fermentazione, con particolare attenzione alla diversità dei lieviti, agli adattamenti e in particolare all'applicazione industriale della biologia dei lieviti. In particolare, studiamo l'efficienza della fermentazione, la produzione di aromi e la tolleranza allo stress nel lievito. Quindi, i nostri progressi più recenti sono legati alla filogenomica del lievito, in particolare dalla Patagonia.
Quindi lo usiamo per generare nuovo lievito lager per la fermentazione della birra, ma stiamo anche usando un nuovo lievito per la birra a bassa gradazione alcolica. Complessivamente utilizziamo diverse tecniche omiche e l'evoluzione sperimentale per sviluppare questo nuovo lievito per applicazioni biogenologiche. Attualmente stiamo utilizzando diverse tecniche come il sequenziamento del genoma, il sequenziamento del genoma a lettura lunga e anche la trascrittomica.
Poi, complessivamente, usiamo queste informazioni per fare un'evoluzione sperimentale dei diversi ceppi che abbiamo, e poi cerchiamo di convalidare alcuni dei cambiamenti genomici utilizzando tecniche CRISPR o diverse tecniche di trasformazione del lievito, e in questo modo entriamo nei dettagli molecolari dell'adattamento del lievito agli ambienti fermentativi. Quindi, abbiamo due grandi sfide. Uno è quello di generare un nuovo lievito lager con un'efficiente fermentazione della birra, e un altro è tutto l'opposto.
Vogliamo ottenere nuovi ceppi, in particolare dalla Patagonia, che siano in grado di generare birra a bassa gradazione alcolica. Vorrei evidenziare due risultati principali del nostro laboratorio. Uno di questi è che identifichiamo un'origine fuori dalla Patagonia della madre del lievito lager, Saccharomyces eubayanus.
E ora abbiamo anche generato dozzine di nuovi ibridi lager per la fermentazione della birra. Penso che questi siano i due risultati principali della nostra ricerca. Per iniziare, prelevare un campione da un cerotto di ceppo di lievito trasformato e inocularelo in un terreno peptonico di lievito contenente il 5% di glucosio e 200 micromolari di igromicina.
Incubare la coltura a 25 gradi Celsius senza agitare per 24 ore. Rinfrescare le colture in terreno fresco a una diluizione da 1 a 10 prima di incubare per altre 24 ore. Lavare le cellule con un terreno peptonico di lievito senza zucchero, quindi inocularele nel terreno di prova a una diluizione da 1 a 10.
Integrare il terreno di prova con luciferina a una concentrazione finale di 3 millimolari e con 200 micromolari di igromicina per mantenere la stabilità del plasmide. Per i test di crescita di zucchero misto, utilizzare una matrice glucosio-maltosio con concentrazioni crescenti di glucosio e maltosio nel terreno peptonico del lievito. Erogare 200 microlitri di coltura in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.
Ora usa un lettore di piastre luminometriche per misurare la luminescenza e la densità ottica a 620 nanometri ogni 30 minuti per 72 ore. Imposta il tempo di integrazione su un secondo e disabilita l'attenuazione per garantire l'attività continua del reporter e il monitoraggio della densità cellulare. Per il campionamento della fermentazione e il monitoraggio della luminescenza, sciogliere prima l'estratto di malto in acqua per preparare il terreno di estrazione del malto.
Ceppi di lievito trasformati in pre-coltura in 5 millilitri di terreno YPD a 20 gradi Celsius con agitazione a 200 giri/min per 24 ore. Trasferire la pre-coltura in 50 millilitri di terreno di estrazione di malto, quindi incubare a 20 gradi Celsius con agitazione a 200 rotazioni al minuto per altre 24 ore. Centrifugare la coltura a 21, 380 G per un minuto a temperatura ambiente per raccogliere le cellule.
Quindi risospendere le cellule in una piastra a 12 gradi di terreno estratto di malto in triplicati per microfermentazioni da 50 millilitri. Integrare il terreno con 0,3 milligrammi per litro di cloruro di zinco per migliorare le prestazioni di fermentazione. Calcolare il volume dell'inoculo per garantire densità cellulari coerenti tra le repliche.
Inoculare il terreno preparato con la quantità calcolata di inoculo. Quindi posizionare le colture a 20 gradi Celsius senza agitare per 14 giorni. Monitorare l'andamento della fermentazione registrando l'anidride carbonica persa quotidianamente.
Pesare i recipienti ogni giorno per misurare la perdita di peso cumulativa come indicatore della produzione di anidride carbonica. Per il monitoraggio della luminescenza, prelevare periodicamente 200 microlitri da ogni microfermentazione. Aggiungere luciferina per raggiungere una concentrazione finale di 3 millimolari.
Misura la luminescenza e la densità ottica a 620 nanometri utilizzando un lettore di piastre luminometrico senza attenuazione e un secondo di tempo di integrazione. Il plasmide reporter episomiale pRS426-PMAL32-LUC-HphMX è stato costruito con successo con il promotore PMAL32, la luciferasi ORF, e la cassetta hphMX. L'attività differenziale della luciferasi è stata osservata tra i tre ceppi trasformati al variare delle concentrazioni di glucosio e maltosio.
CBS12357T e CL467.1 hanno mostrato attivazione senza glucosio, mentre QC18 richiedeva una concentrazione di glucosio superiore all'1% per l'attivazione. In condizioni di microfermentazione, tutti e tre i ceppi trasformati hanno dimostrato un forte picco di luminescenza in momenti diversi. La luminescenza era assente nei ceppi wild type.
