Lavoro in laboratorio degli autori è supportata da una sovvenzione da parte del National Institute of scienze mediche generali (GM41628) e da una sovvenzione all&#39;Istituto Stowers per la ricerca medica da Helen Nelson Medical Research Fund presso la Greater Kansas City Community Foundation.

1 Generazione e Cultura HEK293 linee cellulari stabili che esprimono versioni mutate di FLAG Figura intera o epitopi-tagged INO80 o altre subunità INO80 Complex <ol><li> Clone cDNA codificante intera lunghezza o mutante umano INO80 ATPasi o un&#39;altra subunità INO80 nel vettore di espressione di mammifero pcDNA5 / FRT con un morsetto N tag epitopo FLAG in-frame. </li><li> Confermare la sequenza dei cDNA inserito dal sequenziamento del DNA prima di procedere. </li><li> Per eseguire la trasfezione, crescere Flp-In cellule HEK293 in 10 centimetri piastre di coltura dei tessuti in un mezzo contenente DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium), 5% glutammina, e il 10% FBS (siero fetale bovino). </li><li> Quando le cellule raggiungono ~ 70% di confluenza, aggiungere a ciascun piatto di coltura tissutale da una miscela di 40 ml di reagente di trasfezione FuGENE6, 0,5 mcg della appropriata pcDNA5 / FRT plasmide di espressione, e 9,5 ug di pOG44, che codifica ricombinasi Flp, in un volume totale di 800 microlitri. </li><li> 48 ore più tardi, trypsinize e scellule Plit in un rapporto di 1:30 in 10 piatti cm, e farle crescere in DMEM con il 5% glutammina, 10% FBS, e 100 mcg / ml igromicina B per 3 - 4 settimane. Modificare il terreno di coltura ogni volta che comincia a ingiallire (in genere ogni 3 - 5 giorni). </li><li> Per identificare i cloni positivi che esprimono il più alto livello di proteine ​​FLAG-tag, selezionare colonie igromicina individuale B-resistente e trasferirli su un unico pozzetto di una piastra da 24 pozzetti. <ol><li> Una volta che le cellule raggiungono l&#39;80% di confluenza, le cellule raccolto da ciascun pozzetto in ~ 1 ml di PBS e pellet per centrifugazione a 1000 xg per 5 min. </li><li> Dopo aver rimosso il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 60 ml di tampone campione SDS-PAGE. </li><li> Oggetto metà del pellet cellulare risospeso alla pagina SDS e western blotting per monitorare espressione della proteina FLAG tag esca; salvare l&#39;altra metà per le analisi future. </li></ol></li><li> Se nessuna proteina INO80 umana FLAG-tag viene rilevato in lisati cellulari, espandere la popo iniziale cellulare clonalemento ulteriormente placcatura cellule provenienti da singoli pozzetti di una piastra da 24 pozzetti in 15 centimetri piastre di coltura tissutale. <ol><li> Per raccogliere le cellule da 15 piatti cm, risospendere nei pressi di cellule confluenti nel freddo ghiaccio PBS e trasferire in una provetta da 50 ml. </li><li> Portare a volume finale di 50 ml con l&#39;aggiunta di ulteriori PBS. </li><li> Cellule pellet a 1.000 xg per 5 minuti, e rimuovere quanto più possibile del surnatante. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in 1 ml di tampone Lys450 (20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 450 mM NaCl, 0.5% TritonX-100, 10 mM KCl, 4 mM MgCl 2, 0.2 mM EDTA, 10% glicerolo, 1 mM DTT, 200 mM PMSF, e 1: 1.000 inibitore della proteasi Cocktail). NOTA: qui e altrove, aggiungere sempre DTT, PMSF, e inibitore della proteasi cocktail di buffer immediatamente prima di iniziare un esperimento. </li><li> Immuno-precipitato proteine ​​dalla risultante lisato cellulare intero FLAG-tagged utilizzando 20 l di anti-FLAG gel di agarosio, e analizzare gli eluati FLAG di western blotting. [Per i dettagli di immunoprecipitation procedura, vedere il passo 5] </li></ol></li><li> Preparare scorte congelate desiderato linee cellulari clonali 12 e conservarli in azoto liquido fino al momento dell&#39;uso. </li></ol> 2. Growing HEK293 linee cellulari in bottiglie Roller Per la preparazione di grandi dimensioni di complessi INO80, le cellule di coltura in 10-20 bottiglie rulli; una resa tipica da ogni bottiglia rullo è ~ 1 ml di emazie concentrate. <ol><li> Per ogni bottiglia rullo, aggiungere 200 ml di DMEM, 5% glutammina, e siero di vitello al 10%, senza che igromicina B. </li><li> Trasferire tutte le celle da un&#39;unica quasi confluenti piatto 15 centimetri in ciascun flacone rullo </li><li> Bottiglie Posizionare rulli in un 37 ° rullo C bottiglia incubatore e ruotano a 0,2 rpm. </li><li> Una volta che le cellule raggiungono ~ 70% di confluenza, versare fuori e scartare il medium. </li><li> Aggiungere ~ 50 ml di ghiaccio freddo PBS per ogni bottiglia. Tenendo bottiglie in orizzontale, miscelare delicatamente per allentare il monostrato cellulare. </li><li> Trasferire le cellule risospese a 250 ml plastbottiglie coniche ic e posto sul ghiaccio. </li><li> Sciacquare bottiglie a rulli con l&#39;aggiunta di PBS, trasferendolo in sequenza da bottiglia a bottiglia. Quando soluzione di risciacquo non è più chiaro (in genere dopo essere stato utilizzato per sciacquare circa 5 bottiglie), aggiungere alla sospensione cellulare. </li><li> Cellule pellet per centrifugazione a 400 xg per 10 min. </li><li> Risospendere delicatamente le cellule in PBS, combinarle in un unico flacone da 250 ml conica, e tenere in ghiaccio fino al procedimento. </li></ol> 3. siRNA-mediata Knockdown di INO80 Subunità nelle cellule che esprimono altro FLAG-tagged INO80 subunità Per ottenere Sottocomplessi INO80 privi di una singola subunità, utilizzare il flag-immunopurification per purificare complessi INO80 dalle cellule trattate con siRNA o cellule che esprimono shRNA in modo stabile. Il siRNA &quot;reverse&quot; (breve RNA interferente) protocollo di trasfezione qui descritto è ottimizzato per HEK293 cellule in crescita in 15 piatti cm. Il protocollo è un piatto unico a 15 cm da cellule e shoULD rettificati di conseguenza a seconda del numero di cellule necessarie. Per preparare quantità biochimicamente utili di complesso INO80 dalle cellule trattate con siRNA, si dovrebbe scalare fino a colture coltivate in 40 15 piatti cm; questi produrranno circa 2 - 4 ml di pellet di ematocrito. <ol><li> Crescere cellule HEK293 che esprimono stabilmente la subunità desiderata del complesso INO80 vicino a confluenza in 15 piatti cm. </li><li> Aggiungere un volume di tampone di risospensione siRNA (20 mM KCl, 6 mM HEPES-pH 7.5, e 0.2 mM MgCl 2) sufficiente per preparare una soluzione stock 50 mM di siRNA in una provetta contenente liofilizzato siRNA. Pipettare la soluzione su e giù un paio di volte e incubare su un nutator per 30 minuti a temperatura ambiente per garantire il siRNA è completamente sciolto. </li><li> Preparare un cocktail trasfezione contenente siRNA e reagente di trasfezione. Miscelare 10 ml di soluzione madre 50 mM siRNA con 32 microlitri Lipofectamine RNAiMAX e aggiungerlo a 4 ml di Opti-MEM ridotto Siero medio con molto delicata miscelazione; albassi tutti i reagenti raggiungano la RT prima dell&#39;uso. </li><li> Incubare la miscela a temperatura ambiente per 30 min. </li><li> Preparare le cellule Flp-In HEK293 che esprimono stabilmente la subunità INO80 desiderato per trasfezione. <ol><li> Durante l&#39;incubazione di Fase 3.4, lavare le cellule nei piatti cm 15 una volta con PBS RT. </li><li> Dopo aver rimosso PBS, trattare le cellule con 1 ml di tripsina solo fino a quando non iniziano a sollevare la piastra. </li><li> Aggiungere immediatamente 10 ml di mezzo completo (DMEM + 5% glutammina + 10% FBS) per tripsinizzati cellule e mescolare delicatamente. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 1000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in ~ 4 ml di terreno completo, e contare il risospensione delle cellule utilizzando un emocitometro. </li><li> Diluire le cellule con mezzo completo ad una concentrazione di ~ 5,4 x 10 6 / ml. </li></ol></li><li> Per ogni piatto 15 centimetri, aggiungere 15 ml di terreno di coltura completo seguito da 4 ml trasfezione cocktail. Agitare delicatamente per garantire il cocktail medio e trasfezione sono Thoroughly misto. Infine, aggiungere un ml di sospensione cellulare e di nuovo agitare delicatamente per disperdere le cellule in modo uniforme. </li><li> Dopo 60 ore di coltura a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore, rimuovere delicatamente medio, risospendere le cellule in PBS freddo ghiaccio, e procedere immediatamente a preparare estratti nucleari. </li></ol> 4 Preparazione di estratti nucleari Questa procedura è stata modificata dal protocollo di Dignam 13 e può essere scalata verso l&#39;alto o verso il basso a seconda delle dimensioni di iniziare pellet cellulari. Tipicamente, 1 ml di imballaggio rendimenti pellet cellulare 1 ml di estratto nucleare finale. Tutti i tamponi devono essere ghiacciata, e tutte le misure devono essere eseguite in una stanza fredda o ghiaccio, se una stanza fredda appropriato non sia disponibile. <ol><li> Isolamento dei nuclei: <ol><li> Trasferire delicatamente le cellule ad una di dimensioni adeguate (15 o 50 ml) si è laureato tubo conico e far girare a 1000 xg per 10 min a 4 ° C. </li><li> Rimuovere il surnatante, e misurare il volume della pel ematocritolasciare. 1 ml di emazie concentrate corrisponde a ~ 3 x 10 8 HEK293 cellule. </li><li> Aggiungere 5 volumi imballati cellulari di tampone A (HEPES 10 mM, pH 7,9, 1,5 mM MgCl 2, KCl 10 mM e appena aggiunto 1 mM DTT, 200 mM PMSF, e 1: 1.000 inibitore della proteasi Cocktail). Risospendere il pellet di cellule delicatamente pipettaggio. </li><li> Incubare in ghiaccio per esattamente 10 minuti. </li><li> Agglomerare le cellule a 1.000 xg per 10 min a 4 ° C, e rimuovere il surnatante. </li><li> Le dimensioni del pellet cellulare dovrebbe aumentare fino a 2 volte durante l&#39;incubazione in tampone A. </li><li> Risospendere le cellule in due volumi di ematocrito di tampone A, e trasferire la sospensione cellulare a una di dimensioni adeguate omogeneizzatore tessuto Dounce. Se inizia con meno di 2 ml di emazie concentrate, utilizzare un omogeneizzatore 7 ml; per 2 - 4 ml cellule imballato, utilizzare un omogeneizzatore 15 ml; e per 10 o più ml di emazie concentrate, utilizzare un omogeneizzatore 40 ml. </li><li> Omogeneizzare la sospensione cellulare con il pestello di vetro libera del omogeneizzatore ONU Douncetil 90% delle cellule macchiare positivamente con 1% trypan blu. </li><li> Trasferire la sospensione di un 45 ml ad alta velocità provetta da centrifuga e centrifugare a 25.000 xg per 20 min a 4 ° C in un rotore JA-17 o simili (vedi Tabella dei materiali / attrezzature). </li><li> Dal pellet nucleare, rimuovere il surnatante, che contiene proteine ​​citosoliche o proteine ​​che fuoriescono dal nucleo durante il frazionamento. </li></ol></li><li> Estrazione nuclei con sale: <ol><li> Aggiungi Buffer C (20 mM HEPES, pH 7,9, 25% glicerolo, 1,5 mM MgCl 2, 0.2 mM EDTA, e appena aggiunto 1 mM DTT, 200 mM PMSF, e 1: 1.000 inibitore della proteasi Cocktail) al pellet nucleare; utilizzare 2,5 ml di tampone C per ogni 3 ml di iniziare ematocrito (~ 1 x 10 9 cellule). </li><li> Utilizzando una bacchetta di vetro o una pipetta, rimuovere il pellet nucleare dalla parete del tubo e trasferire l&#39;intera miscela di un omogeneizzatore Dounce di dimensioni adeguate. </li><li> Risospendere i nuclei omogeneizzando the miscela con due colpi di un pestello LOOSE. </li><li> Trasferire la frazione nucleare risospeso in un bicchiere ghiacciato. Scegli un bicchiere in modo che la sospensione si riempirà il bicchiere di almeno 0,5 cm di profondità. </li><li> Per estrarre proteine ​​nucleari da cromatina o altre strutture insolubili, aumentare gradualmente la concentrazione salina della sospensione di 0,42 M di NaCl da gocciolamento aggiunta di 5 M NaCl agitando moderatamente la sospensione con una bacchetta di vetro pipetta o su ghiaccio; una volta tutte le 5 M NaCl è stato aggiunto, la soluzione dovrebbe diventare molto viscoso o gel-like. Calcolare il volume di 5 M NaCl necessaria per portare la soluzione ad una concentrazione finale di 0,42 M NaCl secondo la seguente formula: <img alt="Equazione 1" fo:content-width="4.5in" src="/files/ftp_upload/51720/51720equation1.jpg" width="500" /></li><li> Trasferire accuratamente la sospensione viscoso in 10 ml tubi in policarbonato per un tipo 70.1 Ti rotore (o equivalente) bottiglie in policarbonato o 70 ml per una Ti o Tipo 45r rotore simile (vedi Tabella dei materiali / attrezzature). Sigillare ermeticamente con parafilm se utilizzando 10 ml provette o con l&#39;assemblea del tappo se si utilizzano 70 ml bottiglie. </li><li> Lentamente ruotare i tubi sigillati a 4 ° C per 30 minuti usando un nutator. </li><li> Spin i campioni in un tipo 45 Ti o 70,1 Ti rotore per 30 min a 120.000 xg a 4 ° C. </li><li> Trasferire il surnatante in un unico tubo di plastica o una bottiglia. Questo surnatante è l&#39;estratto nucleare, e il pellet contiene cromatina e altri detriti nucleare. </li><li> Dividere l&#39;estratto nucleare in aliquote di dimensioni convenientemente, congelare in azoto liquido, e conservarlo a -80 ° C. </li></ol></li></ol> 5. Immunoaffinity Purificazione della INO80 Umano o INO80 Sottocomplessi <ol><li> Per scongelare estratto nucleare congelato, tubi luogo contenenti l&#39;estratto sui tubi da banco o rotolo tra le mani fino a quando il materiale ghiacciato diventa un impasto. Poi posto le provette in ghiaccio o in camera fredda fino a quando l&#39;estratto è completamente thawed. </li><li> Trasferire l&#39;estratto nucleare scongelati per tubi in policarbonato ultracentrifuga 10 ml, e far girare a 100.000 xg per 20 min a 4 ° C in un rotore di Ti o equivalente Tipo 70,1 per rimuovere l&#39;eventuale precipitato che possono essersi formate durante il ciclo di congelamento-scongelamento. </li><li> Trasferire il surnatante in una provetta da 15 ml. Aggiungere fresco DTT, PMSF, e inibitore della proteasi Cocktail a concentrazioni finali di 1 mM DTT, 200 mM PMSF, e 1: 1.000 inibitore della proteasi Cocktail. </li><li> Per preparare anti-FLAG agarosio per la immunopurification, trasferire 200 ml di 50% impasto di anti-FLAG agarosio perline in una provetta da 1,5 ml con una pipetta P200 o simile con una punta da cui il termine è stato tagliato con un bisturi pulito o lama di rasoio. </li><li> Pellet le perle di centrifugazione in una microcentrifuga da banco a 8.000 xg per 30 sec. Rimuovere il surnatante e lavare i beads di risospendere le sfere in 1 ml di tampone Lys450, pellet e le perline a 8.000 xg per 30 sec. Lavare il bEADS altre due volte. </li><li> Risospendere le anti-FLAG perline agarosio lavati in circa 100 ml di estratto nucleare utilizzando un P200 o simili pipetta volume regolabile con una punta da cui il termine è stato tagliato con un bisturi pulito o lama di rasoio e, utilizzando la stessa punta, il trasferimento le microsfere in sospensione al tubo da 15 ml contenente l&#39;estratto. Ripetere un paio di volte fino a quando tutte le perline sono stati trasferiti al tubo 15 ml. </li><li> Incubare la miscela di estratto / tallone per 4 ore a 4 ° C con rotazione lenta su un rotatore laboratorio. OPTIONAL: Includi benzonasi ad una concentrazione di 25 unità / ml per rimuovere contaminazione del DNA. </li><li> Raccogliere il FLAG agarosio mediante centrifugazione a 1000 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Risospendere in 10 ml Lys450 per lavare, incubare 5 minuti a 4 ° C con dolce dondolo su un nutator. Pellet le perline a 1.000 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Risospendere in 100 - 150 ml di Lys450 e perle trasferimento in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Continue per sciacquare il tubo da 15 ml con 100 - 150 ml di Lys450 fino a quando tutte le perle sono stati trasferiti alla provetta. </li><li> Centrifugare le perline a 8.000 xg per 30 sec a 4 ° C in una microcentrifuga. Lavare tre volte con 1 ml di Lys450 e una volta con tampone 1ml EB100 (10 mM HEPES pH 7,9, 10% glicerolo, NaCl 100 mM, 1,5 mM MgCl 2, 0.05% TritonX-100, e appena aggiunto 1 mM DTT, 200 mM PMSF , e 1: 1.000 inibitore della proteasi Cocktail). </li><li> Per eluire le proteine ​​legate, aggiungere tampone EB100 200 ml contenente 0,25 mg / ml 1x peptide FLAG. Incubare 30 min a 4 ° C ciascuno su una nutator. </li><li> Agglomerare le perline a 8.000 xg per 30 sec a 4 ° C in una microcentrifuga. Trasferire il surnatante, che contiene il complesso INO80 eluito, in una provetta da microcentrifuga fresca. </li><li> Ripetere l&#39;eluizione altre quattro volte, e riunire tutti i surnatanti in un unico tubo. </li><li> Per rimuovere eventuali residui di perline FLAG-agarosio dalla frazione proteica eluita,passare l&#39;eluato attraverso una colonna di spin vuoto. </li><li> Concentrare la frazione proteica eluita ~ 10 volte utilizzando un dispositivo di filtro centrifugo ultra (50.000 molecolare cutoff peso). </li><li> Per rimuovere il peptide FLAG, passare il concentrato frazione proteica in sequenza attraverso due colonne dissalazione. </li><li> Dividere la frazione proteica purificata, dissalato in 20 microlitri aliquote, congelati in azoto liquido e conservati a -80 ° C. </li><li> Analizzare la composizione subunità di INO80 o Sottocomplessi INO80 su gel-argento macchiato o mediante western blotting, e stimare la loro concentrazione mediante western blotting semi-quantitativa utilizzando preparazioni di subunità INO80 ricombinanti di concentrazione nota come standard. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Studi strutturali e funzionali di multi-subunità complessi di rimodellamento della cromatina mammiferi da eucarioti superiori sono stati ostacolati dalla difficoltà di preparare biochimicamente quantità utili di tali complessi contenenti subunità mutante o privi di alcune subunità del tutto. Ci sono una serie di ostacoli tecnici: In primo luogo, la manipolazione genetica in cellule di mammifero è stato tecnicamente impegnativo e richiede tempo. A differenza delle cellule di lievito, il cui genoma può essere facil...

Evolutivamente conservata di famiglia SNF2 complessi di rimodellamento della cromatina sono regolatori chiave di organizzazione della cromatina e l&#39;accessibilità del DNA 1. Questi complessi di rimodellamento comprendono sempre una centrale SNF2-come ATPasi subunità, che, in alcuni casi, assembla con diverse proteine ​​accessorie e forma macro-molecolare assiemi multi-subunità. Per studiare i dettagli molecolari del processo di rimodellamento della cromatina ATP-dipendente, è importante comprendere i contributi di determinati sottoinsiemi di subunità e / o strutture di dominio per le attività dei complessi. Tali analisi richiedono la capacità di generare complessi mutanti altamente purificate che non hanno particolari subunità proteiche o strutture di dominio. Precedenti studi struttura-funzione di ATP-dipendenti complessi di rimodellamento della cromatina sono ampiamente concentrata sul sistema modello di lievito a causa della manipolabilità superiore del genoma del lievito (vedi, per esempio, arbitri 1-4). Data la conservazione deglicomposizione subunità e funzionalità tra complessi di rimodellamento ortologhi, studi sulla struttura e la funzione dei lieviti complessi di rimodellamento hanno fornito importanti informazioni nelle loro controparti in eucarioti superiori. Tuttavia, esistono specie-specifici apprezzabili differenze tra i complessi di rimodellamento, derivante dalla plusvalenza o la perdita di specie-specifica subunità, il guadagno o la perdita di domini specie-specifici della subunità conservati, e la variabilità di sequenza all&#39;interno di domini conservati di subunità conservati. Tali differenze possono in linea di principio essere guidati dalla necessità di cellule eucariotiche superiori di adattarsi a nuovi ambienti molecolari e cellulari. Quindi, capire come subunità di maggiori complessi di rimodellamento eucarioti contribuiscono al processo di rimodellamento nucleosoma è prezioso, perché getta luce non solo sui meccanismi di base del processo di rimodellamento della cromatina ATP-dipendente, ma anche in grado di fornire preziose informazioni sui meccanismi attraverso cui la struttura della cromatina e l&#39;espressione genica in higsuoi eucarioti sono regolati. Finora, ci sono stati solo limitati studi strutturali e funzionali di multi-subunità mammiferi complessi di rimodellamento della cromatina, in parte a causa delle difficoltà nell&#39;ottenere biochimicamente definiti complessi di rimodellamento della cromatina e Sottocomplessi. Abbiamo parzialmente aggirato queste difficoltà con le procedure descritte qui di seguito, in cui la purificazione per immunoaffinità viene utilizzato per preparare intatti INO80 o INO80 Sottocomplessi da cellule umane che esprimono stabilmente N-terminale epitopo FLAG tag wild type o mutanti versioni di INO80 5-7 (Figura 1) . Per ottenere complessi INO80 intatte da cellule umane, ricombinazione Flp-mediata viene utilizzato per generare linee cellulari transgeniche HEK293 stabilmente esprimenti epitopi FLAG cDNA taggati codificano per le subunità del complesso INO80 8-10. Poiché sovra-espressione di subunità INO80 può essere alquanto tossico, è necessario isolare e mantenere linee cellulari clonali sotto co selettivalli operativi per garantire l&#39;espressione stabile del transgene durante i numerosi passaggi necessari per l&#39;espansione delle colture cellulari su larga scala. Per ottenere Sottocomplessi INO80 più piccoli che contengono solo un sottoinsieme di subunità, abbiamo utilizzato con successo due approcci (Figura 2A, B). Nel primo, generiamo linee cellulari HEK293 Flp-In esprimono stabilmente versioni mutanti di INO80 che mancano i domini necessari per l&#39;interazione con le subunità specifiche 5. In alternativa, knockdown siRNA-mediata è utilizzato per esaurire la subunità desiderato da cellule che esprimono un adeguato INO80 subunità FLAG-tag (dati non pubblicati). Infine, per purificare i complessi INO80 umani, FLAG cromatografia a base di agarosio 11 viene utilizzato per arricchire una frazione-INO80 contenente da estratti nucleari, riducendo efficacemente la presenza di contaminanti proteine ​​citosoliche nella frazione finale contenente depurati INO80 o INO80 Sottocomplessi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="890">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Name of Reagent/Material</td>
			<td style="width:212px;">Company</td>
			<td style="width:147px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:173px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:212px;">Cellgro</td>
			<td style="width:147px;">10-013-CV</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamax-I (stablized glutamine)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">35050-079</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>SAFC</td>
			<td style="width:147px;">12176C</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FuGENE6 transfection reagent&#160;&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:147px;">E2312</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hygromycin B, sterile in PBS</td>
			<td>AG Scientific</td>
			<td style="width:147px;">H-1012-PBS</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pcDNA5/FRT vector</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">V6010-20</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Flp-In HEK293 cells&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">R780-07</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">pOG44 Flp-Recombinase Expression Vector</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">V600520</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZview&#160; Red ANTI-FLAG&#160; M2 Affinity Gel&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">F2426</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">calf serum</td>
			<td>SAFC</td>
			<td style="width:147px;">12138C</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TARGETplus SMARTsiRNA pool</td>
			<td>Dharmacon / Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">various</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5x siRNA resuspension buffer&#160;</td>
			<td>Dharmacon / Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">#B-002000-UB-100</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine RNAiMAX&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">13778</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Opti-MEM Reduced Serum Medium&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">51985-091</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Cellgro</td>
			<td style="width:147px;">45000</td>
			<td style="width:173px;">VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">TrypLE (trypsin)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">12604</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1x FLAG Peptide</td>
			<td style="width:212px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">F3290</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro Bio-Spin Chromatography Column</td>
			<td style="width:212px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:147px;">737-5021</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra Centrifugal Filter Device (50k MWCO)</td>
			<td style="width:212px;">Amicon</td>
			<td style="width:147px;">UFC805024&#160;</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeba Desalting Columns&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">89882</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Anti-FLAG M2 antibody, mouse</td>
			<td style="width:212px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">F3165</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Anti-FLAG M2 antibody, rabbit</td>
			<td style="width:212px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">F7425</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:212px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">P8340</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">benzonase&#160;</td>
			<td>Novagen</td>
			<td style="width:147px;">70664</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;"></td>
			<td style="width:212px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Equipment</td>
			<td style="width:212px;">Company</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wheaton Dounce Tissue Grinders</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td style="width:147px;">06-435C&#160;</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">JS-4.2 rotor in a J6 centrifuge&#160;</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">339080</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">JA-17 rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">369691</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 ml polycarbonate tubes&#160;</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">355630</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70 ml polycarbonate bottles&#160;</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">355655</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Type 45 Ti rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">339160</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Type 70.1 Ti rotor&#160;</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">342184</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Clay Adams Nutator Mixer</td>
			<td style="width:212px;">BD Diagnostics</td>
			<td style="width:147px;">15172-203&#160;</td>
			<td style="width:173px;">VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glas-Col Tube/Vial Rotator</td>
			<td style="width:212px;">Glas-Col</td>
			<td style="width:147px;">099A RD4512</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR thermal cycler PTC 200</td>
			<td>MJ Research</td>
			<td style="width:147px;">PTC 200</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">roller bottle incubator</td>
			<td style="width:212px;">Bellco biotechnology</td>
			<td style="width:147px;">353348</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4</td>
			<td style="width:212px;">Millipore</td>
			<td style="width:147px;">IPFL07810</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">lubricated 1.5ml microcentrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Costar</td>
			<td style="width:147px;">3207</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and purification of human ino80 chromatin remodeling complexes and subcomplexes

INO80 complessi di rimodellamento della cromatina regolano le dinamiche nucleosoma e l&#39;accessibilità del DNA catalizzando ATP-dipendente rimodellamento nucleosoma. Complessi INO80 umani sono composti da 14 subunità proteiche tra cui INO80, un SNF2-come ATPasi, che serve sia come la subunità catalitica e il patibolo per l&#39;assemblaggio dei complessi. Funzioni delle altre subunità ei meccanismi attraverso i quali essi contribuiscono alla cromatina attività rimodellamento del complesso del INO80 rimangono poco conosciuti, in parte a causa della sfida di generare sottoinsiemi INO80 nelle cellule umane o sistemi di espressione eterologhi. Questo protocollo JOVE descrive una procedura che permette la purificazione di INO80 cromatina Sottocomplessi rimodellamento umani che mancano di una subunità o un sottoinsieme di subunità. N-terminale epitopo FLAG tagged INO80 cDNA vengono stabilmente introdotte nel rene embrionale umano (HEK) 293 linee cellulari con ricombinazione Flp-mediata. Nel caso in cui un sottoinsieme di subunità del complesso INO80 è abe cancellato, si esprime invece le proteine ​​mutanti INO80 che non hanno la piattaforma necessaria per il montaggio di queste subunità. Nel caso in cui un individuo subunità deve essere impoverito, uno transfects di targeting siRNA questa subunità in una linea cellulare HEK 293 che esprimono stabilmente FLAG taggati INO80 ATPasi. Estratti nucleari sono preparate, e FLAG immunoprecipitazione viene effettuata per arricchire frazioni proteiche contenenti derivati ​​INO80. Le composizioni di Sottocomplessi INO80 purificati possono poi essere analizzati utilizzando metodi quali immunoblotting, colorazione argento, e spettrometria di massa. I Sottocomplessi INO80 e INO80 generati in base a questo protocollo possono essere ulteriormente analizzati utilizzando vari saggi biochimici, che sono descritte nel protocollo JOVE accompagnamento. I metodi qui descritti possono essere adattati per lo studio delle proprietà strutturali e funzionali di ogni mammifero multi-subunità rimodellamento della cromatina e complessi modificano.

La figura 1 mostra un diagramma di flusso che riassume le procedure utilizzate per generare, purificarsi, e caratterizzare INO80 ATP-dipendenti complessi di rimodellamento della cromatina umani. Secondo quanto illustrato nelle figure 2 e 3, tali procedure consentono la generazione di entrambe le tipo INO80 e INO80 Sottocomplessi selvatici che mancano varie subunità, consentendo così successive analisi biochimiche del contributo di tali sub...

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Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

Questo protocollo descrive una procedura per la generazione e purificare wild type e mutanti versioni del complesso rimodellamento della cromatina INO80 umana. Epitopi tagged versioni di subunità INO80 sono stabilmente espressi in cellule HEK293 e complessi completi e complessi privi di specifici gruppi di subunità sono purificati mediante cromatografia di immunoaffinità.

Generazione e Purificazione di umani INO80 rimodellamento della cromatina Complessi e Sottocomplessi

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 ...

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Biology

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DNA and Chromosome Structure

SCIENTISTS IN ACTION

9.7K Views.  Stowers Institute for Medical Research.  Questo protocollo descrive una procedura per la generazione e purificare wild type e mutanti versioni del complesso rimodellamento della cromatina INO80 umana. Epitopi tagged versioni di subunità INO80 sono stabilmente espressi in cellule HEK293 e complessi completi e complessi privi di specifici gruppi di subunità sono purificati mediante cromatografia di immunoaffinità. 

Video: Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A nucleoprotein (NP) into viral ribonulceoprotein particles (vRNPs). The influenza vRNPs are enclosed within the viral envelope. During cell entry, however, these vRNP complexes are released into the cytoplasm, where they gain access to the host nuclear transport machinery. In order to study the nuclear import of influenza vRNPs and the replication of the influenza genome, it is useful to work with isolated vRNPs so that other components of the virus do not interfere with these processes. Here, we describe a procedure to purify these vRNPs from the influenza A virus. The procedure starts with the disruption of the influenza A virion with detergents in order to release the vRNP complexes from the enveloped virion. The vRNPs are then separated from the other components of the influenza A virion on a 33-70% discontinuous glycerol gradient by velocity sedimentation. The fractions obtained from the glycerol gradient are then analyzed on via SDS-PAGE after staining with Coomassie blue. The peak fractions containing NP are then pooled together and concentrated by centrifugation. After concentration, the integrity of the vRNPs is verified by visualization of the vRNPs by transmission electron microscopy after negative staining. The glycerol gradient purification is a modification of that from Kemler et al. (1994)1, and the negative staining has been performed by Wu et al. (2007).2

The genome of the influenza A virus consists of eight separate complexes of RNA and proteins, termed viral ribonucleoprotein complexes (vRNPs). This paper describes the glycerol gradient purification and transmission electron microscopy visualization of influenza A vRNPs.

Purificazione e visualizzazione di influenza A Complessi Ribonucleoproteina virale

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A ...

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Biologia

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of glucose monitoring and new insulin formulations, many individuals still develop devastating secondary complications. Pancreatic islet transplantation can restore near normal glucose control in diabetic patients 1, without the risk of serious hypoglycemic episodes that are associated with intensive insulin therapy. Providing sufficient islet mass is important for successful islet transplantation. However, donor characteristics, organ procurement and preservation affect the isolation outcome 2. At University of Illinois at Chicago (UIC) we developed a successful isolation protocol with an improved purification gradient 3. The program started in January 2004 and more than 300 isolations were performed up to November 2008. The pancreata were sent in cold preservation solutions (UW, University of Wisconsin or HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate) 4-7 to the Cell Isolation Laboratory at UIC for islet isolation. Pancreatic islets were isolated using the UIC method, which is a modified version of the method originally described by Ricordi et al 8. As described in Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue, human pancreas was trimmed, cannulated, perfused, and digested. After collection and at least 30 minutes of incubation in UW solution, the tissue was loaded in the cell separator (COBE 2991, Cobe, Lakewood, CO) for purification 3. Following purification, islet yield (expressed as islet equivalents, IEQ), tissue volume, and purity was determined according to standard methods 9. Isolated islets were cultured in CMRL-1066 media (Mediatech, Herndon, VA), supplemented with 1.5% human albumin, 0.1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 1 ml of Ciprofloxacin, 5 ml o f 1M HEPES, and 14.5 ml of 7.5% Sodium Bicarbonate in T175 flasks at 37&deg;C overnight culture before islets were transplanted or used for research.

Achieving high quality and appropriate quantity of human islets is one of the prominent prerequisites for successful islet transplantation. In this video, we describe step by step the procedures for human pancreatic islet isolation (part II: purification and culture of human islets) using a modified automated method.

Isolamento del pancreas umano Islet: Parte II: La purificazione e la cultura di isole umane

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

La colorazione delle proteine ​​in gel con Coomassie G-250, senza solventi organici acido acetico e

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves required for peristalsis and mediate neuronal input from the enteric nervous system1. Different subtypes of ICC form distinct networks in the muscularis of the GI tract 2,3. Loss or injury to these networks is associated with a number of motility disorders4. ICC cells express the KIT receptor tyrosine kinase on the plasma membrane and KIT immunostaining has been used for the past 15 years to label the ICC network5,6. Importantly, normal KIT activity is required for ICC development5,6. Neoplastic transformation of ICC cells results in gastrointestinal stromal tumor (GIST), that frequently harbor gain-of-function KIT mutations7,8. We recently showed that ETV1 is a lineage-specific survival factor expressed in the ICC/GIST lineage and is a master transcriptional regulator required for both normal ICC network formation and for of GIST tumorigenesis9. We further demonstrate that it cooperates with activating KIT mutations in tumorigenesis. Here, we describe methods for visualization of ICC networks in mice, largely based on previously published protocols10,11. More recently, the chloride channel anoctamin 1 (ANO1) has also been characterized as a specific membrane marker of ICC11,12. Because of their plasma membrane localization, immunofluorescence of both proteins can be used to visualize the ICC networks. Here, we describe visualization of the ICC networks by fixed-frozen cyrosections and whole mount preparations.

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

The interstitial cells of Cajal (ICC) are the pacemaker cells of the gastrointestinal (GI) tract. They form complex networks between smooth muscle cells and post-ganglionic neuronal fibers to regulate GI contractility. Here, we present immunofluorescence methods cross-sectional and whole-mount visualization of murine ICC networks.

Visualizzazione delle cellule interstiziali di Cajal (ICC) di rete in topi

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves ...

Preparation, Purification, and Characterization of Lanthanide Complexes for Use as Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

Polyaminopolycarboxylate-based ligands are commonly used to chelate lanthanide ions, and the resulting complexes are 
useful as contrast agents for magnetic resonance imaging (MRI). Many commercially available ligands are especially useful because they contain 
functional groups that allow for fast, high-purity, and high-yielding conjugation to macromolecules and biomolecules via amine-reactive 
activated esters and isothiocyanate groups or thiol-reactive maleimides. While metalation of these ligands is considered common 
knowledge in the field of bioconjugation chemistry, subtle differences in metalation procedures must be taken into account when 
selecting metal starting materials. Furthermore, multiple options for purification and characterization exist, and selection of the most 
effective procedure partially depends on the selection of starting materials. These subtle differences are often neglected in published 
protocols. Here, our goal is to demonstrate common methods for metalation, purification, and characterization of lanthanide complexes 
that can be used as contrast agents for MRI (Figure 1). We expect that this publication will enable biomedical scientists to incorporate 
lanthanide complexation reactions into their repertoire of commonly used reactions by easing the selection of starting materials and 
purification methods.

We demonstrate the metalation, purification, and characterization of lanthanide complexes. The complexes described here can be conjugated to macromolecules to enable tracking of these molecules using magnetic resonance imaging.

Preparazione, purificazione e caratterizzazione di complessi lantanidi per l&#39;uso di agenti di contrasto per Risonanza Magnetica

Polyaminopolycarboxylate-based ligands are commonly used to chelate lanthanide ions, and the resulting complexes are 
useful as contrast agents for ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

Isolamento di cromatina Purificazione RNA (disturbo)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases Alzheimer's disease (A&beta;, tau), Parkinson's Disease (&alpha;-synuclein), Huntington's disease (polyglutamine, huntingtin), and others. Protein aggregation is thought to occur due to disturbed proteostasis, i.e. the imbalance between the arising and degradation of misfolded proteins. Of note, the same proteins are found aggregated in sporadic forms of these diseases that are mutant in rare variants of familial forms.
Schizophrenia is a chronic progressive brain condition that in many cases goes along with a permanent and irreversible cognitive deficit. In a candidate gene approach, we investigated whether Disrupted-in-schizophrenia 1 (DISC1), a gene cloned in a Scottish family with linkage to chronic mental disease1, 2, could be found as insoluble aggregates in the brain of sporadic cases of schizophrenia3. Using the SMRI CC, we identified in approximately 20 % of cases with CMD but not normal controls or patients with neurodegenerative diseases sarkosyl-insoluble DISC1 immunoreactivity after biochemical fractionation. Subsequent studies in vitro revealed that the aggregation propensity of DISC1 was influenced by disease-associated polymorphism S704C4, and that DISC1 aggresomes generated in vitro were cell-invasive5, similar to what had been shown for A&beta;6, tau7-9, &alpha;-synuclein10, polyglutamine11, or SOD1 aggregates12. These findings prompted us to propose that at least a subset of cases with CMD, those with aggregated DISC1 might be protein conformational disorders.
 Here we describe how we generate DISC1 aggresomes in mammalian cells, purify them on a sucrose gradient and use them for cell-invasiveness studies. Similarly, we describe how we generate an exclusively multimeric C-terminal DISC1 fragment, label and purify it for cell invasiveness studies. Using the recombinant multimers of DISC1 we achieve similar cell invasiveness as for a similarly labeled synthetic &alpha;-synuclein fragment. We also show that this fragment is taken up in vivo when stereotactically injected into the brain of recipient animals.

The generation, purification and cell invasion of intracellular, cytoplasmic full length DISC1 protein aggresomes from cell cultures and of a labeled, multimeric recombinant DISC1 protein fragment in E. coli are described. Cell invasiveness is shown for recipient cells in cell culture and for neurons in vivo after stereotactical brain inoculation.

Generazione, purificazione e caratterizzazione di specie DISC1 Cell-invasive Protein

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

Generazione di immunoprecipitazione della cromatina Template DNA di alta qualità per high-throughput sequencing (ChIP-Seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and the control of gene transcription in the cell nucleus. The kindlins are ~75 kDa multidomain proteins and bind to an NPxY motif and upstream T/S cluster of the integrin &#946;-subunit cytoplasmic tail. The hematopoietically-important kindlin isoform, kindlin-3, is critical for platelet aggregation during thrombus formation, leukocyte rolling in response to infection and inflammation and osteoclast podocyte formation in bone resorption. Kindlin-3&#39;s role in these processes has resulted in extensive cellular and physiological studies. However, there is a need for an efficient method of acquiring high quality milligram quantities of the protein for further studies. We have developed a protocol, here described, for the efficient expression and purification of recombinant murine kindlin-3 by use of a baculovirus-driven expression system in Sf9 cells yielding sufficient amounts of high purity full-length protein to allow its biophysical characterization. The same approach could be taken in the study of the other mammalian kindlin isoforms.

Kindlins are fundamental to cell adhesion through integrins but studies of them have been hampered by the difficulty encountered in expressing them recombinantly in bacterial hosts. We describe here methods for their efficient production in baculovirus-infected insect cells.

Produzione efficiente e purificazione di ricombinante murino kindlina-3 da cellule di insetto per Biofisica Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Biochemical Assays for Analyzing Activities of ATP-dependent Chromatin Remodeling Enzymes

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Biochemically dissecting the contributions of individual subunits of such complexes to the multi-step ATP-dependent chromatin remodeling reaction requires the use of assays that monitor the production of reaction products and measure the formation of reaction intermediates. This JOVE protocol describes assays that allow one to measure the biochemical activities of chromatin remodeling complexes or subcomplexes containing various combinations of subunits. Chromatin remodeling is measured using an ATP-dependent nucleosome sliding assay, which monitors the movement of a nucleosome on a DNA molecule using an electrophoretic mobility shift assay (EMSA)-based method. Nucleosome binding activity is measured by monitoring the formation of remodeling complex-bound mononucleosomes using a similar EMSA-based method, and DNA- or nucleosome-dependent ATPase activity is assayed using thin layer chromatography (TLC) to measure the rate of conversion of ATP to ADP and phosphate in the presence of either DNA or nucleosomes. Using these assays, one can examine the functions of subunits of a chromatin remodeling complex by comparing the activities of the complete complex to those lacking one or more subunits. The human INO80 chromatin remodeling complex is used as an example; however, the methods described here can be adapted to the study of other chromatin remodeling complexes.

Here we describe biochemical assays that can be used to characterize ATP-dependent chromatin remodeling enzymes for their abilities to 1) catalyze ATP-dependent nucleosome sliding, 2) engage with nucleosome substrates, and 3) hydrolyze ATP in a nucleosome- or DNA-dependent manner.

Saggi biochimici per le attività di analisi ATP-dipendente rimodellamento della cromatina Enzimi

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and ...