新生児低酸素症の生化学的測定

要約

メソッドは、新生児低酸素虚血の生化学的マーカーを測定するために記述されています。アプローチは、高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）およびガスクロマトグラフ質量分析法（GC / MS）を利用しています。

要約

新生児低酸素虚血は、組織の不十分な血液の灌流または酸素の全身欠如によって特徴づけられる。この条件は^1-3神経学的障害を含む十分に文書化新生児疾患を引き起こす/悪化させると考えられている。減少アデノシン三リン酸の生産は、酸化的リン酸化の欠如が原因で発生します。高エネルギーリン酸結合を含むこのエネルギーを奪わ状態の分子を補償するためには²劣化している。これは、最終的に尿酸に、、ヒポキサン​​チン、キサンチンをイノシンに続いて分解されるアデノシンレベルの上昇につながる。この分解過程での最後の2つの手順は、キサンチン酸化還元酵素によって実行されます。この酵素は正常酸素条件下でのキサンチン脱水素酵素の形で存在するが、低酸素-再灌流障害の状況^4、5の下にキサンチンオキシダーゼ（XO）に変換されます。キサンチン脱水素酵素とは ​​異なり、XOはプリン劣化^4、6の副生成物として過酸化水素を生成します。低酸素時に生成される他の活性酸素種（ROS）と組み合わせて、この過酸化水素は、アラントインを形成するために尿酸を酸化し、マロンジアルデヒド^{（MDA）7-9を}生成する脂質膜と反応する。 ほとんどの哺乳類は、人間が免除、どの酵素ウリカーゼを、持っているアラントインに尿酸に変換されます。ヒトでは、しかし、アラントインは尿酸のROSを介した酸化により形成することができます。このため、アラントインは、ヒトの、ではなく、ウリカーゼを持っている哺乳動物における酸化ストレスのマーカーであると考えられている。

我々は、新生児低酸素虚血の生化学的マーカーを測定するために、高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）及びガスクロマトグラフィー質量分析（GCMS）を用いる方法を説明します。 ヒトの血液はほとんどのテストのために使用されます。ウリカーゼ生成されたアラントインの可能性を認識しつつ、動物の血液を使用することもできます 。プリン代謝は1963年、早ければ低酸素症およびヒポキサンチン、キサンチンの信頼性にリンクされていた、と新生児低酸素症の生化学的指標としての尿酸はいくつかの研究者^10月13日によって検証した。プリン化合物の定量に用いるHPLC法は、高速で信頼性、および再現性です。アラントイン、酸化ストレスの比較的新しいマーカーの定量化に使用するGC / MS法は、グルーバーら ⁷から適応されました。このメソッドは、特定のアーティファクトを回避し、試料の少量を必要とします。 MMDAの合成に使用される方法は^、他の場所に^{14 15を}説明された。 MDAのGC / MSによる定量がParoni らから翻案されました。とCighetti ら ^16、17。キサンチンオキシダーゼ活性はisoxanthopterin ¹⁸にプテリンの変換を定量化することによってHPLCにより測定した。このアプローチでは十分な感度と再現性であることが判明した。

プロトコル

1。サンプルの収集と処理

1. 氷の上に保持されている6ミリリットルK3E EDTA K3チューブに血液サンプルを収集する。
2. 採取後2分以内に、4でサンプルを遠心℃で10分間1500 × gで。
3. 1.5ml微量遠心チューブに上清（血漿）を転送する。
4. 30分間18000グラムで4℃で遠心する。
5. 上清のアリコートを取り出して、プリン（200μlの）、アラントイン（50μlずつ）、MDA（100μL）、及びXO（120μl）の分析のために別々のマイクロ遠心チューブに移す。赤血球に試料を汚染しないように注意してください。使用可能な血漿の総容積に基づいてMDA、XO、そしてプリンのためにプラズマのボリュームを調整する必要があります。

2。プリンとXO分析のために、内部標準、2 - アミノプリンを（2 - AP）の準備

1. 0.01351グラム2 - APを秤量し、塩酸の2-5滴で酸性化された水の8ミリリットルに追加します。 2 - APが溶解されていない場合には、より多くの酸を追加する必要があります。 10ミリリットルの最終的な音量を調整します。
2. あなたの株式2 - APソリューションの真の濃度を決定するために紫外可視分光光度計を使用してください。 （λmax315、ε4000）。
3. かつて株式の濃度は2 - APソリューションが決定され、1 × 10 ^-7モル2 - APプリン測定用内部標準と1 × 10 ^-8モル2 - AP XO測定用内部標準を含むために必要なボリュームを計算する。

式1：


式2：


4. 別のマイクロチューブに分注して計算されたボリュームをし、Speed​​Vacで蒸発乾固する。

3。プリンのHPLC測定

1. 1.5時間14000グラムでマイクロコンYM - 10 4での遠心フィルターデバイスと遠心機は° Cに転送血漿（200μlの）。
2. ろ液を取り出して、1 × 10 ^-7モル2 - APを含むマイクロ遠心チューブに移す。 2 - APを含むマイクロ遠心チューブに添加濾液の体積を記録してください。 10〜20秒間ボルテックスのサンプルを。
3. HPLCのサンプルを分析する。三50μlの注射は、それぞれのサンプルに使用されます。サンプルはSupelcosil LC - 18 - S、15センチメートル× 4.6ミリメートル、Supelguard LC - 18 - Sカラムのガードを備えた5μmのカラムに注入されています。溶媒A -水、溶媒B -メタノール、溶媒C - 50mmのギ酸アンモニウム緩衝液（pH5.5）： 表1に記載のグラジエント条件は、十分なピーク分離を得るために使用する必要があります。

	タイム	流量（ml /分）	％	％のB	％C
1		1.00	0.0	0.0	100.0
2	16.00	1.00	0.0	0.0	100.0
3	17.00	1.00	100.0	0.0	0.0
4	22.00	1.00	100.0	0.0	0.0
5	27.00	1.00	0.0	100.0	0.0
6	32.00	1.00	0.0	100.0	0.0
7	33.00	1.00	100.0	0.0	0.0
8	38.00	1.00	100.0	0.0	0.0
9	39.00	1.00	0.0	0.0	100.0
10	45.00	1.00	0.0	0.0	100.0

表1。プリン化合物のHPLC測定用溶剤変更。

4. サンプル中のプリン体の濃度を決定する。 表2に記載の保持と波長でピーク面積を求めることによりヒポキサンチン、キサンチン、尿酸を定量化する。2 - APのピーク面積を決定する。 2 - APにヒポキサン​​チン、キサンチン、及び尿酸の面積比を決定し、標準曲線を使用してμmolar濃度比を変換します。

	リテンションタイム*	観測はλmax *	λ 最大 19報告	ε 最大 19の報告
尿酸	〜3.5分	288	283 [2]	11500 [2]
ヒポキサンチン	〜7.0分	248	248 [1]	10800 [1]
キサンチン	〜9.5分	267	267 [2]	10200 [2]
2 -アミノプリン	〜12.5分	305	314 [2]	4000 [2]

表2。プリンと内部標準のための典型的な保持時間とは_λmax。 * 1mL/minの流速でアイソクラティック50mmのギ酸アンモニウム緩衝液（pH5.5）を用いたHPLCで決定。 pHは[]になります。

5. 三連ですべてのサンプルを分析するが、変動係数が10％未満である場合のみ、後で分析するための値が含まれています。

4。アラントインのGC / MS測定

1. サンプルの収集と処理中アラントインの定量用に確保して50μlの血漿に¹⁵ N（内部標準） - 1;50μlの10μMDL -アラントイン- 5 - ¹³ Cを追加。
2. このプラズマのソリューションに100μlのアセトニトリルを追加。
3. 渦10〜20秒、その後4℃で遠心° Cを2万グラムで10分間のための混合物。
4. 上清を除去、GC / MSバイアルに配置し、N ₂下で乾燥させます。
5. 乾燥後、エージェントピリジンのN - tert - ブチルジメチルシリル - N - methyltrifluoroacetamide（MTBSTFA）（1:1 vol / vol）の、キャップバイアルを誘導体化する50μlを加えると50で、それらをインキュベート℃で2時間- ¹⁵ N、それぞれ²⁰ 1、この誘導体化は、アラントインとDL -アラントイン- 5 - ¹³ Cのために398.0と400.0の一貫して定量的なm / zのピークが得られます。
6. オートサンプラーを装備したAgilent TechnologiesのGC 6890NとMS 5973でサンプルを分析する。 Agilentの122 - 5532Gキャピラリーカラム（25.7メートル長さ、0.25ミリメートル内径）に化合物の分離を実行します。 1.5ml /分の流量でキャリアガスとしてヘリウムを使用してください。スプリットモード（比20:1、スプリットフロー29.4ミリリットル/分、総流量33.8ミリリットル/分を分割）で誘導体化された製品（1μl）を注入する。 100カラム初期温度を設定° Cと180に増やす前に、2分間その温度で保持° C 10の速度で° C /分。 4分間温度を保持し、20℃の速度° C / minで260にまで増やす。実行が終了するまでこの温度を維持する。各サンプルの後に、ヘキサン中の2注射でカラムを洗浄します。
7. ^{15 N} - 1; 398.0メートル/ zのイオンアラントイン用と400.0メートル/ zのイオンをモニターしながら、DL -アラントイン- 5 - ¹³ Cについては選択イオンモニタリングモードを使用して、アラントインを定量化作製した標準曲線を使用してアラントインのマイクロモル濃度にアラントイン/（重いアラントイン）のイオン組成比を変換します。
8. すべてのサンプルは三重に分析されていますが、10％未満の変動係数を持つ唯一の値は、さらに分析に使用されています。

5。 MDAの分析のための内部標準、メチルマロンジアルデヒド（MMDA）を、準備

1. 100ミリリットルの丸底フラスコに1477μl7M NaOHに523μlの3 ethoxymethacroleinを追加。撹拌棒を追加。
2. 45℃の水浴中でCをフラスコを置き、反応が完了するまで失うまでかき混ぜる。これはおよそ140分を取る必要があります。 10分間隔で定期的に液体の10μlのアリコートを除去することにより反応の進行状況を監視します。 10 ⁵倍の50 mMリン酸カリウム緩衝液（pH 7）を使用し、紫外可視で吸光度を測定することにより、収集された各サンプルを希釈する。一度に275nmの吸光度は約0.658反応が完了に達する。反応が進行するにつれ、溶液は黄色にしてオレンジ色に変わります。
3. 反応は、さらに15分間進行することができます。
4. 丸底フラスコに蒸留脱イオン水5mlを追加し、分液漏斗にソリューションを移す。漏斗にフラスコの内容物を洗浄する水の追加の3 mlを使用してください。漏斗に水の追加の2ミリリットルを追加。
5. 5mlのジクロロメタンでソリューションを3回抽出する。各抽出後、有機層を捨てる。
6. 第三抽出後、丸底フラスコに水層を転送し、乾燥するまでrotovap。
7. 3ミリリットルのエタノールとあらかじめ秤量した15ミリリットルコニカルチューブへの転送に製品を再懸濁します。追加の2ミリリットルのエタノールでフラスコをすすぎ、コニカルチューブにリンスを追加。
8. 5ミリリットルベンゼンを追加し、製品がすぐに氷上で10分間チューブを配置して溶けるまで暖かい水でチューブをインキュベートする。 15000グラムで5分間、それを遠心し、上清を取り除く。
9. 降水に5ミリリットルのエタノールおよび5 mlイソプロピルエーテルを追加itant。非常に穏やかに暖かい水と定期的に傾斜チューブにチューブをインキュベートすることにより、沈殿を溶かす。沈殿物が溶解されると、氷上で10分間チューブを置きます。この再結晶をエタノールとイソプロピルエーテルで2回以上行います。製品の一部は不溶性の白い塊が形成されることがあります。
10. 最後の再結晶化ステップの後Speed​​vacの可能性と乾燥した結果、製品上清をできるだけ取り除く。合成品とのコニカルチューブの重量を量る。
11. チューブ、ボルテックスに5ミリリットルの水を追加し、残りの固形物を除外。
12. MMDAの最終濃度を決定するために紫外可視分光光度計を使用してください。 50mMリン酸カリウム緩衝液にMMDAのためのλmaxは、液（pH7）29900 M ^{-1 cm -1の14}の吸光係数と274 nmである。

6。 MDAのGC / MS測定

1. 9ミリリットルのエタノールに0.11グラムBTHを追加し、10ミリリットルの最終的な音量を調整することにより、エタノールの0.5mmのブチル化ヒドロキシトルエン（BTH）の溶液を調製します。その後、990μlのエタノールにこの濃縮液10μlを加えることにより希釈を行う。
2. 暗いマイクロ遠心チューブ内の水の995μlにフェニルヒドラジンの4.92μlを追加することで、50mmのフェニルヒドラジンの溶液を調製します。渦解。
3. サンプルの収集と処理中にMDAのアッセイ用に確保して100μlの血漿に5μlの10μMMMDAを追加。
4. その後、10μlの0.5 BTHは、pH4で200μlの1Mクエン酸ナトリウムを加えてMMDA /プラズマ混合物に加える。 このpHはサンプルの正確な誘導体化にとって重要である。高いか低いpHが偏ってMDAのレベルになります 。
5. 480μlの最終容量に蒸留脱イオン水を加えることによって、最終的な混合物を希釈する。
6. 、20μlの50mmのフェニルヒドラジンを添加するバイアルをキャップし、オービタルシェーカー上で30分間25℃ソリューション℃でインキュベートすることによってソリューションを誘導体化する。
7. ヘキサン、1分間、および10分間3000rpmで遠心分離のための渦の1mlを追加します。
8. GC / MSバイアルに有機層を移し、N ₂流で100μLに解決策を集中する。
9. オートサンプラーを用いてGC / MSでサンプルを分析する。 Agilentの122 - 5532Gキャピラリーカラム（25.7 mの長さは、0.25ミリメートル内径）の化合物の分離を実行します。 0.6〜0.8ミリリットル/分の流量でキャリアガスとしてヘリウムを使用してください。スプリットモード（比20時01分スプリット、スプリットフロー23.0ミリリットル/分、総流量27.1ミリリットル/分）で誘導体化された製品（2μl）を注入する。 110で最初のカラム温度を設定° Cと250に増やすことを前に1分間その温度で保持℃〜40の速度で° C /分。実行が終了するまでこの温度を維持する。各サンプルの後に、ヘキサン中の2注射でカラムを洗浄します。
10. 144.00メートル/ MDAのためのzと158.00メートル/ MMDAのzを用いて選択イオンモニタリングモードを使用してMDAを定量化する。標準曲線を用いてマイクロモル濃度にMDA / MMDAイオンの組成比を変換します。
11. 三連でサンプルを分析し、唯一の10％未満の変動係数との値を使用します。

7。キサンチンオキシダーゼのHPLC測定

1. キサンチンオキシダーゼの機能の検出が敏感に適当な基質（プテリン）だけでなく、その製品（isoxanthopterin）のレベルを測定する能力に依存しています。プラズマは、0分（コントロール）用または4時間の基質とインキュベートされ、そして製品への変換インキュベーションに依存する基板が決定されます。
2. 各チューブ（0および4時間）に240μl0.2MのTris - HCl緩衝液（pH9.0）と4.63μl7.083x10 ^-3 Mプテリンを追加し、37℃で、それらをpreincubate℃で5分間。
3. 各チューブにプラズマの60μlを添加することにより酵素反応を開始する。
4. すぐにコントロールチューブ（0分）にHClO _4300μlの4％を加えるが、他の混合物を急冷する前に4時間HClO _4300μl4％の反応をインキュベートすることができます。
5. HClO ₄を添加した後、精力的にチューブを振とうし、℃で15000グラムで15分間、4℃で遠心する。
6. 上清の500μLを削除し、5M K ₂ CO ₃の20μlのを追加して中和する。精力的にチューブを振とうし、℃で15000グラムで15分間、4℃で遠心する。
7. 1 × 10 ^-8モル2 - APを含むマイクロ遠心チューブに中和溶液の350μLを追加。
8. 走査型蛍光検出器を備えたHPLC上でサンプルを分析する。三50μlの注射は、それぞれのサンプルに使用されます。サンプルはSupelguard LC - 18 - Sカラムのガードを装備Wacosil 5C - 18 - 200 250ミリメートル× 6.0ミリメートル、5μmのカラムに注入されます。流量1ml/minで95％20mMのKPO ₄緩衝液（pH 2.2）と5％メタノール：以下のアイソクラティック条件は、十分なピークの分離と同定を取得するために使用する必要があります。 345 nmでの蛍光検出器の励起波長と発光波長を設定します。410nmでの長さ。
9. 蛍光検出器のスペクトルからピーク面積を取得することによってpterineと2 - APへisoxanthopterineの比率を決定します。スペクトルの最初のピークは、〜5分、2 - APに対応しています。 2番目の（最大）のピークがpterineになります。 Isoxanthopterineピークは最後に溶出する。
10. 0と4時間のインキュベーション時間のポイント間のisoxanthopterine/2-APピーク面積比の差を求めます。標準曲線からXO活性を算出するためにこの値を使用します。
11. 連でサンプルを分析するが10％未満の変動係数との値のみを使用してください。

8。代表的な結果：

プリン化合物のHPLCの定量化の例を図1Aに示されています。特定の保持時間とヒポキサンチン、キサンチン、及び尿酸の発光波長は、プリン化合物（ 表2）の同時定量を可能にする。アッセイが正しく実行されると、化合物は、十分な分離を持ち、ピーク形状はシャープと単峰性となります。これらのピークは、濃度、標準曲線を使用して、 表3に示す範囲に変換されます。このアッセイのためのサンプル処理が最小限であるため、発生する可能性がある唯一のサンプルベースの​​問題では、赤血球の溶解となります。サンプルは遠心分離される前に赤血球が溶解​​した場合、プラズマはオレンジ/赤の色にかかり、低酸素性虚血の評価には使用できません。プリンを測定する際に発生する可能性のある他の問題は、HPLCシステムとカラム（ 図1B）を伴います。 HPLCシステムでの空気の気泡がある場合は保持時間がシフトしますとHPLCの圧力が劇的に変動します。ガードカートリッジを変更する必要がある場合、圧力が増加し、ピークが拡大し、双方向またはトリ - モーダルになります。

	ヒポキサン​​チン（μM）	キサンチン（μM）	尿酸（μM）	キサンチンオキシダーゼ（（nmolの製品）/分）	マロンジアルデヒド（μM）	アラントイン（μM）
長期酸素正常状態	1.13から19.3（64）	0.02から3.69（61）	107.20から726.12（63）	2.47x10 -6 - 3.92x10 -3（20）	0.44から3.76（53）	NA
長期呼吸窮迫	1.78〜12.59（27）	0.07から11.8（24）	225.40から653.32（27）	0 - 1.03x10 -5（8）	0.82から2.73（24）	NA
長期低酸素	0.38〜31.80（13）	0.11から2.88（13）	235.65から1348.13（13）	1.20x10 -5 -236.44（9）	0.95から2.15（7）	NA
早産酸素正常状態	1.54から4.39（9）	0.03から1.77（9）	178.92から593.49（9）	2.46x10 -5 - 5.44x10 -4（2）	0.95から2.74（8）	2.30から5.26（67）
早産呼吸窮迫	3.04から8.04（2）	NA	327.56から365.11（2）	NA	2.40から3.46（3）	NA

最小 - 最大（N）

表3。プリン、キサンチンオキシダーゼ、マロンジアルデヒド、およびアラントインの代表的な範囲。

アラントインのGC / MS定量化の例を図2に示されています。 derivitizedアラントインとderivitized重いアラントインの質量が知られているので、イオンモードは質量分析でこれらの化合物を同定するために使用することができます]を選択します。アッセイが適切に行われた場合、2つのピークは同じ保持時間に観察される。アラントイン（398.00メートル/ z）と重いアラントイン（400.00メートル/ Z）に他のに対応するもの。これらのピークは、濃度、標準曲線を使用して、 表3に示す範囲に変換されます。アッセイが正しく実行され、サンプルが適切にderivitizedされていない場合、ピークが存在しない可能性がありますか定量的に代表することがあります。赤血球は溶解のであれば、やはり、プラズマは新生児低酸素性虚血における酸化ストレスを評価するために使用することはできません。

MDAの定量化のための結果は、2つのピークが異なる保持時間で観測されるという例外を除き、アラントインと似ています。 〜3.5分保持時間、MDAのための144.00メートル/ zのピーク時および〜4分の保持時間では、MMDAのための158.00メートル/ zのピークは（ 図3）が観察される。これらのピークは、濃度、標準曲線を使用して、 表3に示す範囲に変換されます。アッセイが正しく実行される、またはサンプルが適切にderivitizedされていない場合は144.00メートル/ zと158.00メートル/ zのために選択するとき、どのピークが観察されないことがありますそれはことに注意する必要がありますボーラス経口栄養や静脈内脂質の投与から血漿中の脂質の過剰がある場合、プラズマは乳白色の外観にかかりますし、新生児低酸素性虚血における酸化ストレスを評価するために使用することはできません。

キサンチンオキシダーゼの機能のHPLCベースの定量化の例を図4に示されています。アッセイが正しく実行され、三つのピークを蛍光検出器で観察する必要がある場合、プテリン、isoxanthopterin用に一つずつ、そして2 - AP用です。これらのピークは、濃度、標準曲線を使用して、 表3に示す範囲に変換されます。また、PDA検出器から生成されたスペクトル上isoxanthopterinと2 - APに対応するピークがあるはずです。酵素活性が存在しない場合は、isoxanthopterinに対応するピークは見られません。このアッセイは、酵素の機能を測定するため、サンプルの凍結融解は、これを変える可能性のある繰り返し。

図1。プリン化合物の同定のためのHPLCスペクトル 。 A）。代表的な結果分析が正しく実行された場合。 B）。代表的な結果はHPLC、カラム、またはガードカートリッジに問題がある場合。

図2。アラントインの定量化のためのGC / MSスペクトル。M / zはアラントインに対応するイオン398.00のピーク。イオン400.00メートル/ zのピークは重いアラントインに対応しています。

図3。 MDAの定量化のためのGC / MSスペクトルは。イオン144.00メートル/ zのピークは、MDAに対応しています。イオン158.00メートル/ zのピークはMMDAに対応しています。

図4。 XO活性の測定のためのHPLCスペクトル。）4時間のインキュベーション時間は0分のインキュベーションの時間およびB）代表的な結果の代表的な結果。 4時間のインキュベーション時間のためのより高いisoxanthopterineピーク（〜17分で）注意してください。蛍光スペクトルでは、2 - APは、〜10分で、次の〜5分とpterine溶出で最初に溶出する。

ディスカッション

メソッドは、新生児低酸素虚血の評価を許可するここで説明する。このプロトコルは存在、あるいは低酸素性虚血の程度の全体的な生化学的な像を得るためにエネルギー（ATP）剥奪のマーカーの測定、酸化ストレス、酸化的損傷、および酵素活性を兼ね備えています。この方法の有用性にもかかわらず、潜在的な制限があります。第一に、それは、アッセイのすべてを実行するのに十分なプ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント（省略可能）
6ミリリットルK3E EDTA K3チューブ	フィッシャーサイエンティフィック	2204061
5702R遠心	フィッシャーサイエンティフィック	05413319	13＆16MMアダプタ付
1.5ml微量遠心チューブ	米国サイエンティフィック	1615-5599
2 - アミノプリン	シグマアルドリッチ	A3509
バリアンキャリー100分光光度計	Agilantテクノロジーズ	0010071500
サバントSpeed​​Vac	サーモサイエンティフィック	SC210A - 115
ミクロン遠心フィルターデバイス	フィッシャーサイエンティフィック	UFC501596
Supelcosil LC - 18 - Sカラム	シグマアルドリッチ	58931
Supelcosil LC - 18 - S Supelguardカートリッジとホルダー	シグマアルドリッチ	59629
HPLC	ウォーターズ
GCMSバイアル	フィッシャーサイエンティフィック	03376607
DL -アラントイン- 5 -13℃、1 -15 N	CDNの同位体	M - 2307	ロット＃L340P9
MTBSTFA	サーモサイエンティフィック	48920
ピリジン	シグマアルドリッチ	270970
5973E GC / MSD	アジレントテクノロジー	G7021A	5975E GC / MSのための＃一部
3 - Ethoxymethacrolein	シグマアルドリッチ	232548
水酸化ナトリウム	シグマアルドリッチ	S5881
ジクロロメタン	シグマアルドリッチ	270997
ベンゼン	シグマアルドリッチ	401765
ジイソプロピルエーテル	シグマアルドリッチ	38270
BHT	シグマアルドリッチ	B1378
エタノール	シグマアルドリッチ	459844
フェニルヒドラジン	シグマアルドリッチ	P26252