虚血性創傷モデルを作製するための簡略化手法

要約

我々は、中心動脈と神経と頭蓋神経血管束を分割することによってウサギ虚血性耳創傷モデルを作成するには、低侵襲技術を開発した。皮下トンネルは、すべての皮下組織をカットします。この手順では、最小限の皮膚の中断を引き起こし、安全に糖尿病の動物に使用することができます。

要約

現在の糖尿病の創傷研究の一つの大きな障害は、安全に糖尿病の動物に使用することができます虚血性創傷モデルの欠如である。血管障害は、これらの傷の治癒を妨げている一つの大きな要因であるため、非虚血性創傷でうまく薬剤は、ヒト糖尿病の傷では動作しない可能性があります。我々は、低侵襲外科技術で作成されたウサギの耳の虚血性創傷モデルを記述する2007年の記事を掲載した。それ以来、私たちはさらに簡単に操作するための手順を単純化しています。片方の耳に、3の小さな皮膚切開は、血管茎、耳のベース1〜2センチメートルで行われた。中心動脈を結紮し、神経に沿って切断した。全体脳神経バンドルのみ尾枝はそのまま残して、カットと連結した。円周皮下トンネルは皮下組織、筋肉、神経、小血管を切断し、切開部を介して行われました。他の耳は、非虚血性コントロールとして用いた。四傷は腹側Oで行われたfはそれぞれの耳。このテクニックは、4虚血性創傷とペア比較のために、1つの動物の4つの非虚血性創傷を生成します。手術後、虚血性の耳は涼しく、チアノーゼであり、減少の動きと耳動脈におけるパルスの欠如を示した。虚血性の耳の皮膚温は、1〜10℃であり通常の耳のそれより低く、この差は1ヶ月以上維持されていた。耳組織の高エネルギーリン酸塩の内容は、コントロールの耳よりも虚血性の耳に低かった。創傷治癒時間は、同じ処理が使用された非虚血性耳に比べて虚血性の耳に長かった。この技術は現在23糖尿病（2週間から2歳までの糖尿病時間）された80以上のウサギに使用されています。単一のウサギの皮膚切開でそのような出血、感染、破裂などの手術の合併症を開発していない。モデルは、少し皮膚の中断、長い虚血時間、および他の多くのモデルに比べて高い成功率など、多くの利点があります。それは約nは安全に減少された抵抗を持つ動物で使用され、また別のテストの要件を満たすように変更することができます。

プロトコル

1。解剖学的根拠

ウサギの耳は20 ^世紀初頭以来、創傷ケアのために有利な研究の材料であった。耳は3維管束（中央、頭蓋、および尾）によって供給され、頭蓋と仙骨のバンドル内の血管のサイズが異なるしながら中央のバンドルは、最大です。時折、尾動脈は存在しないかもしれません。これらの血管の¹すべては耳が（ 図1）剃りされた後、簡単に背側に識別されます。腹側では、遠位の皮膚は、近位の血管から血液の供給を受けることはありません。背耳上の3つの容器のバンドルは、遠位腹部皮膚（ 図2）への血液供給を提供するために、軟骨を貫通する多数の枝を持っています。いくつかのウサギでは、非常に小さな皮下血管にもこれ以上腹の皮膚の1/3以下に血液を供給する腹側で発生します。オープン円周皮膚切開では、エッセンがあります腹切開からtially出血はありません。

2。外科的処置

1. ウサギを秤量し、耳は首の後ろと一緒に、剃られています。
2. ブプレノルフィン（0.01 mg / kg）の前投薬は、手術前にIM一時間が与えられています。
3. 麻酔は、ケタミン（50 mg / kg）及びキシラジン（5 mg / kg）をIMの混合物によって誘導される。
4. ウサギは、手術時の加熱パッドで保護されている、目が軟膏で保護され、そのバイタルサインは手術中に監視されています。
5. 外科分野は外科スクラブで無菌的に調製し、両耳が露出されるように覆われています。
6. 他の耳がペアになって非虚血性コントロールとして機能しながら、片方の耳には、虚血性レンダリングされます。
7. 3血管茎は、動脈と静脈で識別されます。
8. ＃15ブレードを使用して、3の小さな垂直切開（1〜1.5 cm）の耳の基部から血管茎、約1〜2 CMで作られています。
9. 中心静脈は、周囲の組織から単離され、縫合糸は、撤回のためにそれを取り囲むように使用されています。中心動脈は4から0縫合糸で結紮し、分割されています。
10. 付随する中枢神経も切断されます。
11. 全体脳神経茎を結紮し、分割されています。
12. 尾椎弓根は保持されます。
13. 皮下トンネルは3つの切開部を介して行われます。これはナイフとハサミでクランプと鋭い解剖の鈍的切開することによって達成される。皮下組織、筋肉、神経、小血管の枝のすべてが中止されています。真皮の下の小さな血管系は完全に分かれています。皮下組織のすべてがブレードと軟骨のレベルまでカットされています。
14. さらに、シャープと鈍い解剖は5〜10 mm程度裸の軟骨が広いまま、ベースをクリーンアップするために使用されます。
15. この手順では、割り込み皮下血管の枝のすべてを迅速に担保を確立することからそれらを防ぐことができます。
16. 出血がある最小限の。いずれかが存在する場合、それは容易に電気焼灼を必要とせず、ガーゼの圧縮によって制御されます。
17. 耳の内側の皮膚は非常に血液の供給を行いませんので切開されていません。
18. 3皮膚切開は4から0または5から0縫合糸を使用してクローズし、滅菌ガーゼで覆われています。
19. 3つの小さな皮膚切開と被っ開腹手術よりもはるかに少ない肌のダメージの手順の結果。
20. 4つの円形全層皮膚創傷は、6 mmのステンレススチールパンチで各耳の腹側に作成されます。傷の間の距離は、少なくとも20〜30 mmである。パンチの傷内部の皮膚が軟骨から削除されます。軟骨膜はまた、皮膚または別々に、削除されます。 （ 図3）造粒と上皮化が行われているベースは軟骨であるが、軟骨があきません。
21. 対照薬はAPPLている間に両方の耳の傷が完了したときに、試験薬は二つの傷の一方の側に適用されます反対側にある傷にiedを。密封包帯（TegaDerm、3M）は、創傷部位をカバーするために使用されています。これは乾燥になってから傷を防ぎます。
22. 耳の底部の傷は、通常、耳の上部に傷がより速く回復する。創傷治癒の比較研究のために、それは反対側の2つの傷を片側に2つの傷を比較する、または別々に上部と下部の傷を比較することをお勧めします。

3。術後処置

1. Duragesicパッチは可能な限り痛みを軽減するために2-3日間フェンタニル（25μgの/時間）解放するために背部皮膚に取り付けられています。
2. ウサギは食べ物や飲み物への無料アクセスを許可されています。
3. ドレッシングの変更は、毎日行われている。古い包帯が削除され、傷は滅菌綿棒で掃除されています。デジタル写真は、比較のために取られています。新しいドレッシングが適用され、傷はTegaDermにより再びカバーされています。いいえ麻酔薬は、chをドレッシング中には必要ありませんアンジェス。
4. 皮膚温度は、比較のためにそれぞれの耳に毎日測定されています。
5. 追加の耳の血液循環は、経皮酸素張力計やレーザードップラー血流計で測定することができます。
6. 縫合糸は1週間後に削除される可能性があります。
7. 非糖尿病動物のために、耳の傷のほとんどは、通常2-3週間以内に治癒する。

4。潜在的な合併症とその回避方法

この低侵襲手術は安全であり、合併症は稀である。過渡的な術後軽度の耳浮腫を除いて、私たちのウサギはいずれも重篤な術後合併症を持っていませんでした。それにもかかわらず、この手順のいくつかの潜在的な合併症があります。

1. 出血。止血が不完全な場合または大きい血管が（例えば、主茎血管の一つとして）が破損している場合出血は切開で発生する可能性があります。これは簡単に注意して解剖することによって回避されています。三大維管束に加えて、そこに多くのマイナー皮下血管の枝を再び。皮下トンネルが行われたときに、これらの船舶はカットがない抱き合わせは必要ありませんされています。止血は、ガーゼを押すだけで達成することができます。これは簡単に数分間トンネルにガーゼのコーナーを挿入することによって行われます。切開を閉じる前に、アクティブな出血が存在しないことを確認してください。
2. 切開感染と裂開：切開が汚染されている場合、これらの合併症が発生する可能性があります。これは、厳格な無菌操作を使用することによって回避することができず、抗生物質は必要ありません。しかし、感染症が発生しない場合、適切な排水やドレッシングの変更が必要とされている。
3. 耳の浮腫：血管の結紮やリンパ循環の混乱のために、軽度の耳浮腫が数日間提示することができる。しかし、それ自体が消滅し、無治療の必要はありません。

5。代表的な結果

2007年以来、我々は23糖尿病を含む、70以上のウサギでは、この手順を使用しているimals。糖尿病群では、手術は別の糖尿病の回で行われました：7ウサギは、糖尿病時の二週間は、それらの4つの12ヶ月いた10、2ヶ月を持っていた、2は糖尿病時の24ヶ月を持っていた。

すぐに手術後、虚血性の耳は軽度の浮腫で、クールとチアノーゼ登場しました。最も重要な耳動脈中央動脈いた正常な耳に強いパルスが、このパルスは虚血性の耳には存在しませんでした。耳の動きは減少したが、完全に消えることはありませんでした。皮膚がトンネルを介して明確なくぼみを示したが、全く虚血または壊死は、任意の動物（ 図4）が見つかりませんでした。

正常および虚血性の耳の皮膚温度を（オムロンヘルスケア、バノックバーン、イリノイ州、またはフィッシャー·サイエンティフィック、ピッツバーグ、PAによって赤外線スポット温度計Kタイプ別オムロン）デジタル温度計で測定した。非虚血、虚血性耳の間の温度差は1〜10°C、Wであったi番目のほとんどのウサギは2-6℃の範囲で図に該当する。 5 30ウサギの平均温度差を示しています。温度差は、手術後の早い時期に高値であった15日後に徐々に減少したが、まだ1月末に維持した。

彼らは屠殺した後、組織の高エネルギーリン酸塩の内容はいくつかの動物で測定した。六組織サンプルは、それぞれの耳から採取し、高エネルギーリン酸塩の内容は、HPLCにより測定した。 ATPと総エネルギーの濃度の両方が虚血性耳に通常より耳のほうが高かった。 図。 6は 23日、手術後に屠殺ウサギの例を示します。平均組織ATPの内容は、0.349±0.047、正常耳におけるマイクロモル/ g以下（平均±SD）対0.237±虚血性の耳の中に0.059モル/ gであり（P <0.005）であった。総エネルギー（ATP + ADP + AMP）を意味すると0.882±0.137、正常耳におけるマイクロモル/ gの対0.556±ischeで0.115マイクロモル/ gであったマイク耳（P <0.001）。

創傷治癒時間はすべての群において非虚血性耳（非糖尿病または糖尿病）よりも虚血性の耳のために常に長かった。 図。 7は、虚血および非虚血性の耳の傷の26組の間の治癒の比較を示しています。癒しの時間は、虚血性の耳（P = 0.001）で17から27日対正常な耳（20.5平均値±3.4日）で13日から18日間（14.9を平均値±1.6日）であった。高齢者や糖尿病ウサギにおける創傷治癒時間は糖尿病の時間が12ヶ月以上であった場合は特に、はるかに長かった。

これらのウサギでは、糖尿病時の24ヶ月とウサギを含む任意の合併症もなく正常に治癒したすべての切開、 図8は、筋肉が存在せず、線維組織によって置換されている治 ​​癒皮下トンネルを示す組織サンプルです。しかし、皮膚は無傷です。

/ 3341fig1.jpg "/>
図1ウサギの耳は3維管束によって供給されます。中央には最大である、頭蓋は小さく、尾バンドルが最小である。耳が剃られた後にこれらの船は容易に表面に見られている。

図2。背部皮膚にではなく、貫通血管を通って腹の皮膚にだけでなく、背側の耳の血液を供給する血管の3つのバンドル。矢印は軟骨を貫通する血管を示しています。挿入図に示すようにこれらの血管のセクションを渡ります。

図3 4つの6 mmの傷は耳の腹側に作成され、軟骨も削除されます。肉芽組織と上皮化が行われているベースは軟骨であるが、軟骨があきません。 Smalの3 lの皮膚切開は、ほとんど皮膚の混乱で閉鎖されています。

皮膚切開が閉じられた後、 図4。、皮下トンネルを介してインデントが明確に見られている。

図5 30ウサギにおける正常および虚血性の耳の間の平均皮膚温の差。手術後7°Cから10°Cに初期の差の範囲である。差は徐々に減少しますが、まだ1ヶ月の終わりに維持しています。

手術後23日間（P <0.001）で、非虚血性耳に比べて、 図6耳組織の高エネルギーリン酸塩の内容は、虚血性の耳に削減されます。

41/3341fig7.jpg "/>
図7。創傷治癒時間は、非虚血性の耳（26傷それぞれ）よりも虚血性の耳の中に長くなります。治癒が負傷した組織への整合性の回復、すなわち、創傷部位の完全な再上皮化として定義されています。

図8。皮下トンネルを含む耳部を示す組織学的サンプル。治癒組織が正常耳よりも薄いですが、オリジナルの骨格筋は存在せず、線維性組織に置換されます。しかし、皮膚は無傷です。

ディスカッション

糖尿病は、米国^、2,3は23.6万人に影響を及ぼし、これらの患者の15-20％以上の250億ドルの年間治療費で^4,5一生の間に足潰瘍を開発しています^。3,6しかしながら、利用可能な最善の糖尿病患者では66％と高い再発率と治療はわずか50％の治癒率を達成し、これはしばしば一時的なもので^{、7 3,6}潰瘍、糖尿病患者に発生した場合は、そのような感染症と劇的に切断の?...

資料