Eine vereinfachte Methode zur Herstellung eines ischämischen Wundmodell

Zusammenfassung

Wir haben eine minimal-invasive Technik, ein Kaninchen ischämischen Wunde Ohr-Modell, indem die zentrale Arterie und Nerven und der Schädelbasis Gefäßnervenbündels erstellen entwickelt. Einen subkutanen Tunnel dann schneidet alle subkutanen Gewebe. Dieses Verfahren verursacht minimale Störung der Haut und kann sicher in diabetischen Tieren verwendet werden.

Zusammenfassung

Ein Haupthindernis bei der aktuellen diabetischen Wunden Forschung ist ein Mangel an einer ischämischen Wundmodell, die sicher in diabetischen Tieren verwendet werden. Medikamente, die gut funktionieren in nicht-ischämische Wunden möglicherweise nicht in der menschlichen diabetischen Wunden zu arbeiten, weil Vaskulopathie ist ein wichtiger Faktor für die Heilung dieser Wunden behindert. Veröffentlichten wir einen Artikel im Jahr 2007 beschreibt ein Kaninchen Ohr ischämischen Wunde Modell durch eine minimal-invasive OP-Technik erstellt. Seitdem haben wir weiter das Verfahren für eine einfachere Bedienung vereinfacht. Auf einem Ohr, wurden drei kleine Hautschnitte an den Gefäßstiele, 1-2 cm vom Ohr Basis. Die zentrale Arterie wurde ligiert und zusammen mit dem Nerv durchtrennt. Die ganze kraniale Bündel wurde geschnitten und ligiert, so dass nur die kaudale Zweig intakt. Eine umlaufende subkutanen Tunnel wurde durch die Einschnitte gemacht, um subkutanen Gewebe, Muskeln, Nerven, Gefäße und kleine schneiden. Das andere Ohr wurde als nicht-ischämischen Kontrolle verwendet. Vier Wunden wurden auf der Bauchseite aus of jedes Ohr. Diese Technik produziert 4 ischämischen Wunden und 4 nicht-ischämische Wunden bei einem Tier für gepaarte Vergleiche. Nach der Operation war der ischämischen Ohr kühl und zyanotisch, und zeigten eine reduzierte Bewegung und einen Mangel an Puls im Ohr Arterie. Hauttemperatur des ischämischen Ohr war 1-10 ° C niedriger als auf dem normalen Ohr und dieser Unterschied wurde für mehr als einen Monat aufrecht erhalten. Ohrgewebe Hochenergie-Phosphat niedriger waren in der ischämischen Ohr als die Kontrollgruppe Ohr. Wundheilung Zeiten waren mehr in der ischämischen Ohr als in der nicht ischämischen, Ohr, wenn die gleiche Behandlung verwendet wurde. Die Technik wurde nun auf mehr als 80 Kaninchen, in der 23 waren Diabetiker (Diabetes Zeit im Bereich von 2 Wochen bis 2 Jahre) verwendet worden. Kein einzelnes Kaninchen hat keine chirurgischen Komplikationen wie Blutungen, Infektionen oder Bruch in den Hautschnitte entwickelt. Das Modell hat viele Vorteile, wie wenig Haut Störungen, längere Zeit ischämischen und höhere Erfolgsrate, wenn zu vielen anderen Modellen verglichen. Es ca.n sicher in Tieren mit vermindertem Widerstand verwendet werden, und kann auch modifiziert werden, um verschiedene Tests zu genügen.

Protokoll

1. Anatomische Grundlagen

Das Kaninchen Ohr ist ein beliebter Studie Material für die Wundversorgung seit dem frühen ^20. Jahrhundert. Das Ohr wird von drei Leitbündel (Zentral-, Schädel-, und Schwanzflosse) geliefert; das zentrale Bündel ist die größte, während die Schiffe in den kranialen und kaudalen Bündel in der Größe variieren. Gelegentlich kann die Schwanzarterie fehlen. ¹ All diese Schiffe sind leicht auf der Rückenseite identifiziert, nachdem das Ohr wird rasiert (Abb. 1). An der ventralen Seite, wird das distale Haut nicht ihre Blutversorgung von den proximalen Behälter. Die drei Behälter Bündel auf der dorsalen Ohr haben zahlreiche Zweige, die durch den Knorpel, um die Blutversorgung zu dem distalen Bauchhaut (2) bereitzustellen eindringen. In einigen Kaninchen, eine sehr kleine Behälter subkutane tritt auch auf der Bauchseite, die mit Blut versorgt, um nicht mehr als 1/3 der Bauchhaut. In einem offenen umlaufenden Hautschnitt, gibt es Essentially keine Blutung aus einer ventralen Einschnitt.

2. Chirurgisches Vorgehen

1. Das Kaninchen wird gewogen und die Ohren sind rasiert, zusammen mit der Rückseite des Halses.
2. Eine Prämedikation von Buprenorphin (0,01 mg / kg) wird IM eine Stunde vor der Operation.
3. Die Betäubung wird durch eine Mischung aus Ketamin (50 mg / kg) und Xylazin (5 mg / kg) IM induziert.
4. Das Kaninchen mit einem Heizkissen ist während der Operation geschützt, werden die Augen mit Salbe geschützt, und seine Vitalfunktionen während der Operation überwacht.
5. Das chirurgische Feld ist aseptisch mit einem Handdesinfektionsmitteln vorbereitet und abgedeckt, so dass die zwei Ohren ausgesetzt sind.
6. Ein Ohr wiedergegeben wird ischämisch, während das andere Ohr dient als ein gekoppeltes nicht-ischämischen Kontrolle.
7. Die drei Gefäßstiele werden von den Arterien und Venen identifiziert.
8. Mit Hilfe einer # 15 Klinge, sind drei kleine vertikale Schnitte (1-1,5 cm) auf den Gefäßstiele gemacht, etwa 1-2 cm vom Ohr Basis.
9. Die zentrale Vene istisoliert von den umgebenden Geweben und eine Naht verwendet wird, um es für den Rückzug zu umgeben. Die zentrale Arterie wird mit 4-0 Fäden ligiert und durchtrennt.
10. Die begleitende zentrale Nervensystem wird auch geschnitten.
11. Die ganze kraniale Pedikel wird unterbunden und durchtrennt.
12. Die kaudalen Pedikelschrauben wird beibehalten.
13. Einen subkutanen Tunnel wird durch die 3 Schnitte gemacht. Dies wird durch stumpfe Dissektion mit einer Schelle und scharfe Dissektion mit einem Messer und einer Schere durchgeführt. Alle der subkutanen Gewebe, Muskeln, Nerven, Gefäße und kleine Äste sind abgebrochen. Die kleinen Blutgefäßverteilungen unterhalb der Dermis sind total geteilt. Alle Subkutangewebe auf das Niveau des Knorpels mit der Klinge.
14. Weitere scharfen und stumpfen Dissektionen werden verwendet zur Sanierung der Basis, so dass ein nackter Knorpel etwa 5-10 mm breit.
15. Dieser Vorgang unterbricht alle der subkutanen Gefäß-Filialen, um sie vor raschen Aufbau Sicherheiten zu verhindern.
16. Blutungen sindminimal. Wenn es eine gibt, ist es leicht mit Gaze Kompression gesteuert, ohne die Notwendigkeit zur Elektrokauterisation.
17. Die Haut im Ohr trägt nicht viel Blutversorgung und damit ist nicht eingeschnitten.
18. Die 3 Hautschnitte sind geschlossen mit 4-0 oder 5-0 Nähten, und mit steriler Gaze.
19. Die Prozedur ergibt drei kleine Hautschnitte und verursacht viel weniger Hautschäden als eine offene Operation.
20. Vier kreisrunde Vollhaut Wunden sind auf der Bauchseite jedes Ohr mit einem 6-mm-Edelstahl-Punsch erstellt. Der Abstand zwischen den Wunden ist mindestens 20-30 mm. Die Haut innerhalb des Stempels Wunde vom Knorpel entfernt. Das Perichondrium wird ebenfalls entfernt, mit der Haut oder getrennt. Die Basis, auf der Granulation und Epithelisierung stattfinden, ist der Knorpel, aber der Knorpel nicht perforiert ist (Abb. 3).
21. Wenn die Wunden an beiden Ohren abgeschlossen sind, ist eine Prüfung Medikament einer Seite von zwei Wunden aufgebracht, während die Steuerung Arzneimittel Applkopiert sind die Wunden auf der anderen Seite. Okklusivkörper (Tegaderm von 3M) ​​wird verwendet, um die Wundstelle zu decken. Dies verhindert, dass die Wunden immer ausgetrocknet.
22. Die Wunden am unteren Teil des Ohres in der Regel schneller als die Wundheilung an der Oberseite des Ohres. Für die Wundheilung Vergleichsstudie, wird empfohlen, die beiden Wunden auf einer Seite zu vergleichen mit den beiden Wunden auf der anderen Seite, oder um die oberen und unteren Wunden separat zu vergleichen.

3. Postoperative Pflege

1. Ein Duragesic Patch ist auf der Rückseite Haut an Fentanyl (25 ug / Stunde) für 2-3 Tage frei, um mögliche Schmerzen zu reduzieren.
2. Die Kaninchen werden den freien Zugang zu Nahrungsmitteln und Getränken erlaubt.
3. Verbandwechsel werden täglich ausgeführt. Die alten Verbände entfernt und die Wunden werden mit sterilen Wattestäbchen gereinigt. Digitale Fotos sind zum Vergleich genommen. Neue Verbände angelegt werden, und die Wunden werden wieder durch Tegaderm abgedeckt. Keine Narkose wird beim Abrichten ch benötigtAnges.
4. Die Hauttemperatur wird täglich auf jedem Ohr zum Vergleich gemessen.
5. Zusätzliche Ohr Durchblutung kann mit einem transkutanen Sauerstoffspannung Meter oder einem Laser-Doppler-Durchflussmesser gemessen werden.
6. Die Nähte können nach einer Woche entfernt werden.
7. Bei nicht-diabetischen Tieren, die meisten der Ohr Wunden in der Regel innerhalb von 2-3 Wochen heilen.

4. Mögliche Komplikationen und wie man sie vermeidet

Diese minimal-invasive Chirurgie ist sicher und Komplikationen sind selten. Bis auf ein Übergangsjahr postoperative milden Ohr Ödeme, keiner unserer Kaninchen hat keine schweren chirurgischen Komplikationen hatte. Dennoch gibt es mehrere mögliche Komplikationen für dieses Verfahren:

1. Blutungen. Blutungen können in den Einschnitten auftreten, wenn Hämostase unvollständig ist oder wenn eine größere Blutgefäß (z. B. eine der wichtigsten Stiel Zellen) beschädigt wird. Dies wird einfach durch sorgfältige Präparation vermieden. Zusätzlich zu den drei großen Leitbündel, dort einwieder viele kleine subkutane vaskulären Filialen. Wenn der subkutanen Tunnel gemacht wird, werden diese Schiffe geschnitten, aber kein Binden notwendig ist. Hämostase kann einfach durch Drücken von Gaze erreicht werden. Dies ist leicht durch Einsetzen einer Ecke von Gaze in den Tunnel für ein paar Minuten erledigt. Vor dem Schließen des Einschnitts, stellen Sie sicher keine aktive Blutungen vorhanden ist.
2. Inzision Infektionen und Dehiszenz: Diese Komplikationen können auftreten, wenn die Einschnitte kontaminiert sind. Dies kann durch Verwendung von stringenten aseptischen Bedingungen vermieden werden und kein Antibiotikum ist erforderlich. Jedoch werden, wenn eine Infektion auftritt, entsprechende Drainage und Verbandwechsel notwendig.
3. Ohr-Ödem: Aufgrund der vaskulären Ligationen und Störungen der Lymphzirkulation, mild Ohr Ödem kann für ein paar Tage zu präsentieren. Allerdings verschwindet es von selbst und keine Behandlung notwendig ist.

5. Repräsentative Ergebnisse

Seit 2007 haben wir dieses Verfahren in mehr als 70 Kaninchen verwendet, darunter 23 Diabetiker einimals. In der diabetischen Gruppe, wurde Chirurgie an verschiedenen diabetischen Zeiten durchgeführt: sieben Kaninchen hatten zwei Wochen Zeit, der diabetischen, vier von ihnen zwei Monaten hatte, zehn hatten 12 Monate und 2 hatten 24 Monate Zeit des diabetischen.

Unmittelbar nach der Operation, erschien der ischämischen Ohr kühl und zyanotisch, mit leichter Schwellung. Die wichtigste Arterie Ohr-the-Zentralarterie hatte einen starken Impuls in der normalen Ohr, aber dieser Impuls nicht anwesend war in der ischämischen Ohr. Ohr-Bewegung wurde reduziert, aber nicht völlig verschwinden. Die Haut zeigte deutliche Depressionen über den Tunnel, aber keine Ischämie oder Nekrose wurde bei einem Tier gefunden (Abb. 4).

Die Hauttemperatur der normalen und ischämischen Ohren wurden mit einem digitalen Thermometer (von Omron Healthcare Omron, Bannockburn, IL, oder ein Typ K Infrarot-Thermometer vor Ort von Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) gemessen. Die Temperaturdifferenz zwischen dem nicht-ischämischen und ischämischen Ohr reichte von 1 bis 10 ° C, wi-ten die meisten Kaninchen, die in den Bereich von 2-6 ° C Abb. 5 zeigt die durchschnittliche Temperatur Unterschiede von 30 Kaninchen. Der Temperaturunterschied war höher in den ersten Tagen nach der Operation sank allmählich nach Tag 15, wurde aber erst am Ende eines Monats erhalten.

Tissue Hochenergie-Phosphat-Gehalte wurden bei einigen Tieren gemessen, nachdem sie geopfert wurden. Sechs Gewebeproben wurden aus jedem Ohr entnommen und Hochenergie-Phosphat-Gehalte wurden mittels HPLC gemessen. Sowohl ATP und Gesamtenergie-Konzentrationen waren höher in den normalen Ohren als in den ischämischen Ohren. Abb. 6 zeigt ein Beispiel eines Kaninchens 23 Tage nach der Operation getötet. Die mittleren Gewebe ATP Inhalte waren 0,349 ± 0,047 mmol / g (Mittelwert ± Standardabweichung) in der normalen Ohr vs 0,237 ± 0,059 mmol / g in der ischämischen Ohr (p <0,005). Mittlere Gesamtenergie (ATP + ADP + AMP) war 0,882 ± 0,137 mmol / g im normalen Ohr vs 0,556 ± 0,115 mmol / g in der ische Mikrofon Ohr (p <0,001).

Wundheilung Zeiten waren zwar immer mehr für die ischämische Ohr als für die nicht-ischämischen Ohr in allen Gruppen (nicht-diabetischen oder diabetischer). Bild. 7 zeigt einen Vergleich der Heilung zwischen 26 Paare von Wunden auf ischämische und nicht ischämische Ohren. Healing Zeiten reichte von 13 bis 18 Tagen (im Mittel 14,9 ± 1,6 Tage) auf den normalen Ohren vs 17 bis 27 Tagen (im Mittel 20,5 ± 3,4 Tage) auf den ischämischen Ohren (p = 0,001). Die Wundheilung mal in Alters-und diabetische Tiere waren viel länger, vor allem wenn Diabetes Zeit mehr als 12 Monate war.

In diesen Kaninchen, ist alles, die Einschnitte in der Regel ohne Komplikationen verheilt, auch die Kaninchen mit 24 Monaten von diabetischen Zeit. Abbildung 8 a zeigt die Histologie Probe geheilt subkutanen Tunnel, in dem Muskel fehlt und wird durch Bindegewebe ersetzt. Jedoch ist die Haut intakt.

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Abbildung 1. Das Kaninchen Ohr wird von drei Leitbündel versorgt. Die zentrale ist die größte, ist die Schädelbasis kleiner, und die Schwanzflosse ist das kleinste Bündel. Diese Schiffe sind leicht auf der Oberfläche gesehen, nachdem das Ohr wird rasiert.

2. Die drei Behälter Bündel auf der dorsalen Ohr mit Blut versorgen nicht nur an der dorsalen Haut, sondern auch auf die Bauchhaut durch eindringendes Schiffe. Der Pfeil zeigt die eindringenden Schiffe durch den Knorpel. Der Einschub zeigt Querschnitt dieser Schiffe.

3. Vier 6-mm Wunden an der ventralen Seite des Ohres erzeugt und das Perichondrium wird ebenfalls entfernt. Die Basis, auf der Granulation und Epithelisierung stattfinden, ist der Knorpel, aber der Knorpel ist nicht perforiert. Das 3 smal l Hautschnitte werden mit sehr wenig Haut Störung geschlossen.

4. Nach die Hauteinschnitte geschlossen sind, wird die Einrückung über den subkutanen Tunnel deutlich zu erkennen.

Abbildung 5. Die durchschnittliche Hauttemperatur Unterschied zwischen dem normalen und ischämischen Ohr in 30 Kaninchen. Die ersten Differenz im Bereich von 7 ° C bis 10 ° C nach der Operation. Der Unterschied allmählich abnimmt aber noch die am Ende von einem Monat.

Abbildung 6. Ohrgewebe Hochenergie-Phosphat-Inhalte werden in der ischämischen Ohr reduziert, um nicht-ischämische Ohr bei 23 Tagen nach der Operation (p <0,001) verglichen.

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Abbildung 7. Die Wundheilung ist länger in den Ohren ischämischen als die nicht-ischämische Ohren (26 Wunden jedes). Heilung als die Wiederherstellung der Integrität verletzte Gewebe, dh die vollständige Reepithelialisierung der Wunde Standorte definiert.

Abbildung 8. Histologie Probe zeigt das Ohr Teil mit subkutanen Tunnel. Das Gewebe verheilt ist dünner als normales Ohr, ist die ursprüngliche Skelettmuskel abwesend und wird durch Bindegewebe ersetzt. Jedoch ist die Haut intakt.

Diskussion

Diabetes betrifft 23,6 Millionen Menschen in den USA, ^2,3 und 15-20% dieser Patienten entwickeln Fußgeschwüren in ihrem Leben, ^4,5 bei einer jährlichen Behandlungskosten von mehr als 25 Milliarden Dollar. ^3,6 Doch selbst die beste verfügbare Behandlungen erreichen nur eine 50% ige Heilungsrate und das ist oft zeitlich begrenzt, ⁷ mit Rezidivraten so hoch wie 66% bei Diabetikern. ^3,6 Wenn Geschwüre bei Patienten mit Diabetes, schweren Komplikationen wie Infektio...

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