高速スキャンサイクリックボルタンメトリーによる線条体の脳スライスにおけるシナプス前ドーパミンのダイナミクス

要約

線条体の脳切片に電気的に誘発シナプス前ドーパミンのダイナミクスを測定するための高速スキャンサイクリックボルタンメトリーを使用する。

要約

大規模な調査が原因乱用薬物（例えば、コカインとアンフェタミン）、精神疾患で、それが果たす役割（例えば、統合失調症や注意欠陥多動性障害）、及び変性への関与の作用機序でその重要性神経伝達物質のドーパミンに焦点を当てているパーキンソン病やハンチントン病などの疾患。正常な生理的条件下では、ドーパミンは、運動活性、認知、学習、感情的な影響、および神経内分泌ホルモンの分泌を調節することが知られている。ドーパミンニューロンの最大密度の一つは、側坐核と尾状核 - 被殻と呼ばれる2つの別個の神経解剖学の領域に分けることができる線条体、中にです。目的は、マウスの線条体の中でスライス高速スキャンサイクリックボルタンメトリー（FSCV）の一般的なプロトコルを説明することです。 FSCVはdでリアルタイムにドーパミンの放出と取り込みを測定する機会を提供し、明確に定義された電気化学的手法です。iscreteの脳領域。炭素繊維の微小電極（〜7μmの径）ドーパミン酸化を検出するためにFSCVで使用されています。ドーパミンを検出するためにFSCVを使用しての分析の利点は 、in vivoマイクロダイアリシスのために補完的な情報を提供し、100ミリ秒未満の10ミクロンの空間分解能のその拡張された時間分解能である。

プロトコル

1。実験的な必需品

電極の作製

• ほとんどが社内で行われるので、多数のカーボンファイバー微小電極の製造方法があります。一般的にどのような電極の製造の詳細を規定する電極（例えばアンペロメトリー対FSCV）に適用される電気化学的手法です。 FSCVの場合は、微小電極は、次の3段階の手順を使用して社内で行うことができます。炭素繊維電極の製造の詳細な説明については、最近のJoveの記事^1を参照してください。しかし、後述の電極は、上記のプロトコルからアンペロメトリーカーボンファイバー微小電極対作製に少ないステップを必要とする円筒状のカーボンファイバー微小電極、であることに注意してください。この簡略化されたプロトコルは、ガラスキャピラリーを火災研磨、またはガラス繊維の接合部をシールするためにエポキシ樹脂を使用して、アセトンで炭素繊維を沸かす必要はありません。
• 真空吸引アスピルを使用するミクロフィラメント（; AMシステム、Carlsborg、WA長さ10センチ、外径1.2ミリメートル、ID 0.68ミリメートル）とキャピラリーホウケイ酸ガラスに、炭素繊維（グッドフェローオークデール、ペンシルバニア直径7μmの）を食べた。
• 毛細血管が半分に引っ張られる電極プラー（ナリシゲ、東京、日本）にスレッドキャピラリーを置きます。電極プラーの出力設定は、ラボからラボに変化はありません。参考のために、引き手のための私達の出力設定が90.7主磁石、23.2サブ磁石、およびヒーターのための53.4です。出力設定は、炭素繊維の周りタイトなシールで、長さが約4.4 mmであるガラステーパを生成するために経験的に洗練されたはずです。
• 顕微鏡（オリンパス、東京、日本）の下で、炭素繊維の約50〜200μmが密閉インタフェースから突出することができますガラスの先端から伸びる炭素繊維を（手術用メスの刃を使用して）トリミング。

ソリューションの準備

人工的なセールの3つのタイプbrospinal液（ACSF）ソリューションは、すべて超高純度（18MΩcm）の水に、事前に準備する必要があります。

• スクロース- ACSFをスライスする前に少なくとも一日調製することができる。スクロース- ACSFバッファは（mMで）で構成されています：180ショ糖、30のNaCl、4.5 KClを、1.0のMgCl _2、26のNaHCO _3、1.2のNaH ₂ PO _4、および10 D -グルコース（pH7.4）および95を使用して酸素化されるべき15分²の％O ₂ / 5％CO _2。事前に準備する場合、ソリューションは4℃冷蔵保存することができます℃で最長1週間。
• ボルタンメトリー記録用ACSFのソリューションは、実験の日を準備する必要があります。 126のNaCl、2.5 KClを、2.4のCaCl _2、1.2のMgCl _2、25のNaHCO _3、1.2のNaH ₂ PO _4、11 D -グルコース、0.4アスコルビン酸液（pH7.4）：ACSF液は（mMで）で構成されています。 95パーセント、室温でO2 / 5％CO ₂でバブリングによって酸素を実験、の過程で。
• 修正 -電極のキャリブレーションが含まれているためACSF溶液（mMで）：2.5 KClを、126のNaCl、1.2のNaH ₂ PO _4、2.4のCaCl _2、1.2のMgCl _2、および25のNaHCO _3（pH7.4）および最大1週間まですることなく、保持することができます冷凍または酸素化。

電極のキャリブレーション

• 電極の生存率と感度が密閉参照電極（Ag / AgCl電極）との3ポートを含む流れ"T細胞"を使用して、それぞれ、前後のキャリブレーションによって決定されます。作製微小電極は流れ、"T細胞"に低下する。入口ポートを2 mL / minの流量で修正- ACSFの連続的な流れを可能にする、シリンジポンプに接続されています。 "T細胞"の第3ポートには、修正された - ACSFで行われた3μMのドーパミンで満たされた注射器に接続されている。
• に事前に校正、修正されたACSFのソリューションが約3のために流れるようになります - 7秒してから、手動で3μMのドーパミンの標準の1〜2 mLを注入する。各電極の事前に校正する、少なくとも3回の平均それぞれから得られた最大電流をキャリブレーションを繰り返します。
• すぐにスライスボルタンメトリー実験後（セクション3を参照）、電極は、上記と同様にポストキャリブレーションです。
• 校正係数は、（後でデータの解析中に使用される）ドーパミンの標準の濃度が現在の平均的なドーパミンの酸化（NA）を割ることによって決定されます。 3μMのドーパミンの標準を使用するとき、例えば、現在の応答を3で除算されます。

2。スライスの準備

1. 氷のバケツに小さなビーカーと所定の位置にショ糖ACSF 10mLを注ぐ。さらに、手の届くところに、氷のバケツに瞬間接着剤（ロックタイト404）を置きます。
2. それらをアルコールパッドできれいに拭いて、カミソリの刃や鉗子、へら、はさみなどの解剖に必要な必要なツールを、準備します。
3. 小型ガス茶でCO ₂窒息によりマウスを犠牲にする良く切れるはさみを使用して即座に斬首によって続いmber、。すぐに脳全体を削除します。約10分間氷冷スクロースACSFのビーカーで脳を置きます。
4. その間に、スライスのためビブラトームを準備。最初に、試料槽の一部の砕いた氷を置きます。試料室を置き、所定位置にしっかり保持するために締めます。ない氷がチャンバーに入ったないことを確認して、ギャップを埋めるために試料室周りの多くの氷を追加。ビブラトーム上ブレードホルダーできれいにかみそりの刃を配置し、氷冷スクロースACSFで試料室を埋める。
5. 脳を調製するための作業面を設定するには、上を向いたペトリ皿上に配置されているペーパータオルの部分にいくつかの冷ショ糖ACSFを注ぐ。使用して鉗子は、準備されたペトリ皿の上に脳を移す。冠状スライスの場合は、カミソリの刃と廃棄と内側 - 外側軸に沿って小脳をカット。これは、ビブラトームステージに貼付することができるフラットベースを作成します。
6. 場所試料ステージ上にロックタイトの接着剤の滴（ステップ1の間に氷のバケツに配置）。すぐに、貼付ステージ上で準備した脳の平らな終わりは、可能な限り垂直にそれを維持。試料室にステージを置き、脳が完全にチャンバー内のショ糖のACSFに浸漬されていることを確認、ネジを締めます。
7. ビブラトームの前面にあるコントロールを使用すると、脳の上部とステージのようにかみそりの刃のラインを調整する。ビブラトームのための最適なパラメータが低いため、周波数と速度を設定することにより得られる。低い速度がより高速に観察されている脳を、退治からブレードの力を最小限に抑えるために好ましい。スライス厚は400μmに設定されています。
8. 最初の数のスライスでは、線条体は含まれません。線条体を含むスライスが得られるまで、スライスを繰り返します。線条体領域は（解剖学的ランドマークが断言）に達すると、ビーカーにスライスと場所を持ち上げるために、ペイントブラシを使用してください酸素、室温ACSF。典型的には、尾状核 - 被殻および側坐核が含まれるように線条体複合体を含有する3〜4のスライスを得ることができます。
9. スライスは、実験に使用する前に、少なくとも1時間室温で酸素ACSFに順応することができます。

3。スライスからボルタンメトリー記録

スライスは、インキュベートしている間、スライスの録音室を調製することができる。

1. 水没録音室（カスタムサイエンティフィック、デンバー、CO）と、室温のACSFをオキシ内の場所に接続されているチューブを取る。を1 mL / minの流量に灌流ポンプを（ワトソンマーロウリミテッド、ファルマス、イギリス）に設定します。 32℃に温度コントローラーを設定します。 ACSFは、特注のスライスホルダー（メッシュディスクのステージを改変）いっぱいにした後、針の注射器（BD脊髄針）を使用して気泡を除去することにより、スライスの準備をします。
2. 首相に真空を描画することによりスライス風呂フローを開始するために注射器を用いて流出管（ガラス廃液ボトルにつながる）。バッファオーバーフローを制御するために、スライスホルダーの端に芯として動作するようにキムワイプを置きます。
3. 1時間のインキュベーションの後、連続して95％O ₂ / 5％CO _2、室温のACSFを灌流された録音室内のスライスホルダー、にスライスを転送する。
4. 水没スライスホルダーにAg / AgCl参照電極（スライスチャンバーの蓋にテープ）とヘッドステージにワニ口クリップを使用して電極を接続してください。
   • Ag / AgCl参照電極の表面に塩化銀の薄層を堆積させるために5分を1 M HCl中（+1 V）250μmの銀線を（AMシステムズ、Carlsborg、WA）陽極酸化することにより社内で行うことができます。銀線。
5. 線条体の脳スライスの表面にタングステン刺激電極（プラスチックOne、ロアノーク、バージニア州）を下げます。刺激電極は、それが上に置いたとしてスライスに接触しそれが、しかし穿刺スライスをされるべきではありません。我々の実験のセットアップでは、刺激がNeurolog刺激装置によって生成されます。
6. 炭素繊維の作業微小電極は、BD脊髄針を用いて150mMのKCl溶液で逆充填されている。リード線は、ワニ口クリップを使用して低ノイズChemClampポテンショスタット（ダガン企業、ミネアポリス、ミネソタ州）のヘッドステージに接続されているし、挿入（スクワイアーズエレクトロニクス、コーネリアス、OR）、です。 200μm程度離れて双極刺激電極、スライスへの深い約75μmから - 作用電極は、約100を配置されます。
7. どちらのシングル（単相、350μA、60 Hzの、そして4ミリ秒のパルス幅）または複数（例えば5パルス、350μA、20 Hzから、4ミリ幅）のパルスを用いて電気刺激は、神経伝達物質を喚起する刺激電極によって配信されますリリース^3。
8. FSCVを使用して電気的に誘発ドーパミンを測定するために、三角形の波形は、電極に印加される。 DOPのための代表的なパラメータアミン検出：カーボンファイバー微小電極が+1.2 Vの正の限界値まで上昇するAg / AgCl参照電極に対して-0.4 V、で開催され、その後400 V / sの走査速度で-0.4 Vに戻ってダウン状態の可能性。
9. スライスは、電気的に生じるドーパミンの流出の5分毎とボルタンメトリー測定は15秒のために作られて刺激される。
10. 少なくとも3つの安定な電気的刺激によるドーパミン放出の記録（ピーク高さの差が<10％）した後、興味のある薬理学的薬剤を含むACSFは、最大限の効果を得るために30分間のスライス以上1mL /分の流速で灌流される。電気的に刺激されたドーパミンの録音は、薬理学的灌流中に5分ごとに作られています。

4。データ分析

ワイトマンで説明したようにスライスから得られた結果、現在の対時間トレースは、ミカエリス - メンテン型の方程式のセットに非線形回帰によって適合することができますLabVIEWで書かれたソフトウェアで、同僚（ナショナルインスツルメンツ、オースティン、テキサス州^）4-6。このソフトウェアでは、現在の対時間のトレースは、2つのパラメータを変化させて装着することができる、V _最大 （nm / sの、トレースの降順相が示すようにドーパミントランスポーターによる取り込みの速度に対応する）とパルスあたりのドーパミン濃度（nM 、ピーク高さの最大値に対応する）。ドーパミントランスポーターのドーパミンの親和性の反射K _m値は、160 nmに設定し、変更されません。実験後に決定される電極の較正係数をフィッティングする前に必要です。 LabVIEWソフトウェアは、決定係数（R ^2）適合度（R ²の値> 0.8が使用されている）を決定するパラメータが含まれています。

5。代表的な結果

FSCVは、置く尾状の単パルス、電気的に刺激ドーパミン放出と取り込みを調べるために使用されたアーメン（CPU）、側坐核（NAC）コア、およびマウスのNACシェル。図1Aに示すように、代表的な結果は、現在の（または濃度）対時間のプロットを示しています。赤い矢印は電気刺激がカーボンファイバー微小電極でのドーパミン濃度の変動に起因する電流量に対応する上昇が続くスライスに適用されるかを示します。電気刺激時の支配的なプロセスは、ドーパミンのリリースですが、このような取り込みや拡散などの他のプロセスも同様に全体的な観測されたピークの高さに貢献しています。ピークの下降フェーズは、主に神経細胞の刺激は^、7を停止しているので、そのトランスポーターによる神経伝達物質の再取り込みに起因する。拡散と代謝も電流の減少に寄与しかし、ピークの減衰は、セロトニン再取り込みに限定されるものではない。それは、電気化学測定の時間スケールは、ほんの数秒なので、FSCVがcontributioを測定するために早すぎることが仮定されている代謝⁷からNS。これらの電流対時間のトレースでは、y軸は、後の実験のキャリブレーション係数を用いて濃度（μM）に変換されます。図1Aの挿入図は、それぞれのバックグラウンドは、現在の対時間トレースのサイクリックボルタモグラムを減算されます。電極（x軸）に印加さ​​れる電位に対して（y軸）測定電流をプロット、ドーパミンは、化学的に+0.6 Vで観測された酸化ピークとドーパミン - オルト - キノンの対応する還元ピークで観測されて識別されます - Ag / AgCl参照電極に対して0.2 V。データの第三の表現は一つのグラフを形成するために現在の対時間トレースし、サイクリックボルタモグラムの両方から情報を組み合わせて三次元擬似カラープロット（図1B）を使用します。代表的な擬似カラープロットでは、時間をx軸に沿って秒単位でプロットされ、炭素繊維作業微小電極への印加電圧は、y軸に沿ってグラフ化され、そして現在は、FALのように表されるz軸に沿ってSEの色。炭素繊維の微小電極（直径〜7μm）の小さいサイズのため、電気的に刺激ドーパミンのダイナミクスは、線条体（;図2 CPU対坐核対坐シェル）の離散的な解剖学的領域で検出することができます。

線条体冠状スライスを使用する利点は、ドーパミン細胞体からの貢献を排除し、シナプス前ドーパミン動態の調査のためにできることです。他の人が^16、17を示しているようにドーパミン放出と取り込みのシナプス前制御することは固くドーパミン自己受容体やトランスポーターの機能に限定されるものではない。他の神経伝達物質系のHeteroreceptorsもドーパミンダイナミクス^18、19を調節する。図3Aに示すように、代表的な電流対時間のトレースは、スライスを30分間に1μMquinpirole（D2/D3受容体アゴニスト）、電気的に誘発ドーパミン放出の減少で処理されるときに観察されていることを示しています。一方、時基板このようなメタンフェタミンなどのドーパミントランスポーター、のために、ドーパミン放出には差が（図3B）が観察されていない、30分間スライス上に灌流される。ピークの減衰は、通常、ドーパミントランスポーターの動態の変化（K _m）の³に関連付けられている右にシフトされます。スライスがドーパミン放出ダイナミクス^20、21に影響^を与えること^が仮定されている100 ng / mLの脳由来神経栄養因子（BDNF）溶液中に浸された後最後に、図3Cは、現在の対時間トレースの代表的なトレースです。この代表的なトレースから、それはBDNFが電気的に誘発ドーパミンの放出を強化する能力を持っていることがわかる。一緒に、これらの薬理学的治療は、線条体の中でドーパミン動態を調べるためにFSCVの有用性を強調する。

FSCVによるシナプス前ドーパミンのダイナミクスを調べるために脳スライスを使用する主な制限は、そのまま脳からneurocircuitryが失われることです。スライスFSCVで、それが難しい調査している地域の機能にこれらのシステムの貢献を理解する（線条体など）または非刺激ドーパミンのレベルを評価すること、他の脳領域からの神経伝達物質の効果を研究することは不可能です。 ^{24 -}しかし、FSCVにおける最近の技術的進歩は、自由に薬理学的操作、自己投与、または新規性^22〜反応してラットの移動でドーパミントランジェント測定（とと電気刺激なし）を可能にした。全体的に、スライスFSCVは、シナプス前ドーパミンの動態に関する貴重な情報を提供し、そのような微小透析、電気生理学、及び/または自由にFSCVを移動するなどの補完的な神経化学的手法にスライスFSCVの結果を結合することにより、脳内の神経伝達物質の機能のより包括的なビューを提供しています。

図1。dopaminを電気的に励起された電子の放出は、C57BL/6Jマウスから背側のCPUのスライスにFSCV以下のシングルパルス刺激を用いて測定。ドーパミンの放出が単一パルス（赤矢印）によって誘発された（A）濃度対時間のトレース。単一のアスタリスクはまた、主にドーパミン放出の濃度の上昇、しかし、取り込みと拡散に寄与する要因の貢献を表しています。二重アスタリスクは、主に摂取するだけでなく、拡散が寄与し、ベースラインに戻るのピーク信号を表します。挿入図は、対応する環状ボルタモグラムを表示します。 （B）背側のCPUの表示時間（x軸）からの代表的な色のプロットは、擬似カラーにAg / AgCl参照電極（y軸）に対して炭素繊維の微小電極への潜在的な、そして現在の適用。

NACのコア内の単一電気刺激パルス（赤い矢印で示される）により誘発される図2。ドーパミン放出C57BL/6Jマウスからとシェル。 （とC）NACコアとシェルから濃度対時間トレースし、それらの対応する環状クリックボルタモグラムは、（挿入図）。 （BおよびD）は、NACのコアとシェルから前述の、代表的なカラープロットとして。

図3スライス後の代表的なトレースが30分間薬剤で治療された。。すべてのケースでは、単一パルスがCPUにドーパミン放出を喚起するために使用された。前処理（黒のトレース）と比較するとドーパミンD2受容体アゴニスト、quinpirole（赤のトレース）の（）アプリケーション。 （B）メタンフェタミン灌流（紫のトレー​​ス）は、前処理（黒のトレース）と比較。 （C）ドーパミン動態に影響を及ぼす脳由来神経栄養因子の能力（青のトレース）は、前処理（黒のトレース）と比較。

ディスカッション

ここで紹介するプロトコルはFSCV実験用マウスの冠状脳スライスを準備し、使用する方法を示します。 ^{11 -}このメソッドはドーパミンダイナミクスを取得し、測定に固有のものですが、次のような他の神経伝達物質はアデノシン、過酸化水素、ノルエピネフリン、セロトニンはFSCV ^3,8とin vivoまたは in vitro でモニターされている。 FSCVは、作用電極^3,11に適用...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
の名前	会社	CAS番号
試薬
塩化カリウム	フィッシャー	7447407
ナトリウム塩化	EMDケミカルズ	764714​​5
マグネシウムの塩化	フィッシャー	7791186
カルシウム塩化	フィッシャー	10035048
重炭酸ナトリウム	EMDケミカルズ	144558
リン酸ナトリウム、二塩基性	EMDケミカルの	7558794
D -グルコース	フィッシャー	50997
アスコルビン酸	フィッシャー	50817
スクロース	フィッシャー	57501
材料	ベンダ	カタログ番号
炭素繊維	グッドフェローオークデール、ペンシルバニア州
ガラスキャピラリー	AMシステムCarlsborg WA。	602000
銀線	-MシステムズCarlsborg WA。	787000
タングステン刺激電極	プラスチックOne、ロアノーク、バージニア州
プラチナ線
リード線	スクワイアーズエレクトロニクス、コーネリアス、OR
ロックタイト404瞬間接着剤	Hankal株式会社ロッキーヒル CT。
かみそりの刃	世界精度インスツル株式会社FL。
BD脊髄針	BDメディカルシステム、 Franlinレイク、ニュージャージー州	REF 405234
外科ブレード	フェザー安全剃刀株式会社LTD。日本の
ソフトウェア	ベンダ	カタログ番号
THソフトウェア	ESA社、チェルムスフォード、MA
装置	ベンダ	カタログ番号
潜録音室	カスタムサイエンティフィック、デンバー、CO
Neorologの刺激アイソレータ	Digitmeter、ハートフォードシャー州、イギリス
自動温度調節器	ワーナー音源（株）
顕微鏡（SZX7）	オリンポス
顕微鏡	フィッシャー
ビブラトーム3000セクショニングシステム	聖ルー、MOです。
注入ポンプ	ワトソンマーロウリミテッド、ファルマスコーンウォール - イギリス	H110708
マイクロピペットプラー	ナリシゲ、東京、日本
ChemClampポテンシオスタット	ダガンの企業、 ミネアポリス、ミネソタ州。