Dinamica dopamina presinaptica in fettine di cervello striatale con Fast-scan Voltammetria ciclica

Riepilogo

Tramite scansione veloce voltammetria ciclica per misurare elettricamente evocate dinamiche dopamina presinaptica in fettine di cervello striatale.

Abstract

La vasta ricerca si è concentrata sul neurotrasmettitore dopamina a causa della sua importanza nel meccanismo d'azione dei farmaci d'abuso (ad esempio la cocaina e anfetamine), il ruolo che gioca in malattie psichiatriche (es. schizofrenia e Attention Deficit Hyperactivity Disorder), e il suo coinvolgimento in degenerativa disturbi come il Parkinson e la malattia di Huntington. In condizioni fisiologiche normali, la dopamina è noto per regolare l'attività locomotoria, conoscenza, apprendimento, influiscono emotivo, e la secrezione ormonale neuroendocrino. Uno dei più grandi densità di neuroni dopaminergici è all'interno del corpo striato, che possono essere suddivisi in due distinte regioni neuroanatomiche conosciuto come il nucleo accumbens e del caudato-putamen. L'obiettivo è quello di illustrare un protocollo generale per la fetta di scansione veloce voltammetria ciclica (FSCV) all'interno del corpo striato mouse. FSCV è una ben definita tecnica elettrochimica fornendo l'opportunità di misurare il rilascio di dopamina e la diffusione in tempo reale discrete cervello regioni. Microelettrodi in fibra di carbonio (diametro di circa 7 micron) sono utilizzati in FSCV per rilevare l'ossidazione della dopamina. Il vantaggio di utilizzare FSCV analitici per rilevare la dopamina è la sua migliore risoluzione temporale di 100 millisecondi e una risoluzione spaziale di meno di dieci micron, fornendo informazioni complementari al microdialisi in vivo.

Protocollo

1. Essenziali sperimentale

Elettrodo Fabrication

• Ci sono numerosi microelettrodi in fibra di carbonio fabbricazione metodi poiché la maggior parte sono realizzati in-house. Di solito quello che detta i dettagli elettrodo fabbricazione è la tecnica elettrochimica che viene applicata agli elettrodi (ad esempio amperometria vs FSCV). Per FSCV, microelettrodi può essere fatto in casa utilizzando la seguente procedura in tre fasi. Per una descrizione più completa della fabbricazione di elettrodi in fibra di carbonio, si veda un recente articolo JOVE ^1. Tuttavia, si noti che gli elettrodi descritti di seguito sono cilindriche microelettrodi in fibra di carbonio, che richiedono un minor numero di passi per fabbricare contro il microelettrodi amperometrico fibra di carbonio dal suddetto protocollo. Questo protocollo semplificato non richiede bollente la fibra di carbonio in acetone, il fuoco di lucidatura i capillari di vetro, o con resina epossidica per sigillare la giunzione con fibra di vetro.
• Mediante aspirazione ASPIR vuotomangiò una fibra di carbonio (diametro 7 micron; Goodfellow Oakdale, PA) in un capillare di vetro borosilicato con microfilamento (lunghezza 10 cm, diametro 1,2 mm, id 0,68 millimetri, sistemi di AM, Carlsborg, WA).
• Collocare il capillare filettato nel estrattore elettrodo (Narishige, Tokyo, Giappone), dove viene tirato il capillare a metà. Impostazioni di uscita per l'estrattore elettrodo variano da laboratorio a laboratorio. Per riferimento, le nostre impostazioni di uscita per l'estrattore sono 90,7 magnete principale, il 23,2 sub-magnete, e 53,4 per il riscaldamento. Le impostazioni di output dovrebbe essere empiricamente raffinato per generare un cono di vetro che è circa 4,4 mm di lunghezza, con una tenuta intorno alla fibra di carbonio.
• Al microscopio (Olympus, Tokyo, Giappone), tagliare la fibra di carbonio (con una lama da bisturi) si estende dalla punta di vetro permettendo di circa 5-20 micron della fibra di carbonio per sporgere dall'interfaccia ermeticamente chiusi.

Soluzione di preparazione

Tre tipi di cere artificialifluido cerebrospinale (aCSF) le soluzioni devono essere preparate in anticipo, il tutto in ultrapura (18 MΩ cm) di acqua.

• Saccarosio-aCSF possono essere preparati con almeno un giorno prima del taglio. Il saccarosio-aCSF tampone è costituito da (in mm): 180 saccarosio, 30 NaCl, 4.5 KCl, 1,0 MgCl _2, 26 NaHCO _3, 1,2 NaH ₂ PO _4, e 10 D-glucosio (pH 7,4) e deve essere ossigenato con 95 CO% O ₂ / 5% ₂ per 15 minuti ^2. Se preparato prima del tempo, la soluzione può essere conservato in frigorifero a 4 ° C per un massimo di 1 settimana.
• ACSF soluzione per le registrazioni voltammetria deve essere preparato il giorno dell'esperimento. La soluzione aCSF composto da (in mm): 126 NaCl, 2.5 KCl, 2,4 CaCl _2, 1.2 MgCl _2, 25 NaHCO _3, 1,2 NaH ₂ PO _4, 11 D-glucosio, 0,4 acido ascorbico (pH 7,4). Nel corso dell'esperimento, ossigenare facendo gorgogliare con il 95% O2 / _5% di CO2 a temperatura ambiente.
• Modified-aCSF soluzione per le calibrazioni elettrodo contiene (in mm): 2.5 KCl, 126 NaCl, 1.2 NaH ₂ PO _4, 2.4 CaCl _2, 1.2 MgCl _2, e 25 NaHCO ₃ (pH 7,4) e può essere conservato fino a una settimana, senza refrigerazione o ossigenazione.

Calibrazione dell'elettrodo

• Vitalità e la sensibilità degli elettrodi è determinata dalla pre-e post-calibrazione, rispettivamente, con un flusso di "t-cell", contenente 3 porte con un elettrodo di riferimento sigillato (Ag / AgCl). Il microelettrodo fabbricato è abbassato nel flusso "delle cellule T". La porta di ingresso è collegato ad una pompa a siringa, permettendo un flusso continuo di modificato aCSF ad un flusso di 2 ml / min. Il terzo porto della "t-cellula" è collegato ad una siringa riempita con 3 mM dopamina, realizzato in aCSF modificato.
• Per pre-calibrazione, permettono modificato aCSF soluzione di fluire per circa 3-7 secondi, quindi manualmente iniettare 1-2 ml dello standard di dopamina 3 micron. Per ogni elettrodoessere pre-calibrato, ripetere la calibrazione almeno 3 volte e la media delle correnti massime ottenute da ciascuno.
• Immediatamente dopo l'esperimento di voltammetria fetta (vedi sezione 3), l'elettrodo è post-calibrato nello stesso modo come descritto sopra.
• Il fattore di calibrazione (poi utilizzato durante l'analisi dei dati) è determinato dividendo l'ossidazione della dopamina media corrente (nA) e la concentrazione dello standard dopamina. Per esempio, la risposta corrente è diviso per 3 quando si utilizza un normale dopamina 3 micron.

2. Fetta di preparazione

1. Versare 10 ml di aCSF saccarosio in un bicchiere piccolo e collocare in un secchiello del ghiaccio. Inoltre, adesivo posto istantanea (Loctite 404) nel secchiello del ghiaccio, a portata di mano.
2. Preparare una lama di rasoio e gli strumenti necessari richiesti per la dissezione, quali pinze, spatola, e le forbici, con l'annientamento pulirli con un tampone di alcool.
3. Sacrificio mouse CO ₂ asfissia in un cha gas di piccole dimensionimber, seguita dalla decapitazione immediata con le forbici taglienti. Rimuovere rapidamente l'intero cervello. Mettere il cervello in coppa del freddo aCSF saccarosio per circa 10 minuti.
4. Nel frattempo, preparare Vibratome per affettare. In primo luogo, posto alcune ghiaccio tritato nel bagno campione. Posizione della camera campione e stringere a tenerla saldamente in posizione. Aggiungere più ghiaccio intorno alla camera campione per colmare le lacune, assicurandosi senza ghiaccio entra nella camera. Posizionare la lama di un rasoio pulito nel supporto lama sulla Vibratome e riempire la camera campione con ghiacciata aCSF saccarosio.
5. Per impostare un piano di lavoro per la preparazione del cervello, versare un po 'freddo aCSF saccarosio su un pezzo di tovagliolo di carta che è stata posta su un piatto rovesciato Petri. Utilizzando pinze trasferire il cervello sul piatto preparato Petri. Per le fette coronali, tagliare il cervelletto lungo il medio-laterale asse con una lametta e scartare. Questo crea una base piatta che può essere apposta sul palco Vibratome.
6. Postouna goccia di colla Loctite (posto nel secchiello del ghiaccio durante la fase 1) sul palco del campione. Immediatamente, apporre l'estremità piatta del cervello preparato sul palco, mantenendolo il più dritti possibile. Luogo la fase della camera campione e stringere la vite, garantendo che il cervello è completamente immerso nel aCSF saccarosio nella camera.
7. Utilizzando i controlli sulla parte anteriore del Vibratome regolare il palco in modo che le linee rasoio lama con la parte superiore del cervello. Parametri ottimali per il Vibratome si ottengono impostando la frequenza e la velocità al minimo. Velocità inferiori sono da preferire per ridurre al minimo la forza della lama da schiacciamento del cervello, che si osserva alle alte velocità. Spessore della fetta è impostato a 400 micron.
8. Le fette prime non conterrà il corpo striato. Ripetere l'affettamento finché fette contenente il corpo striato si ottengono. Una volta che la regione dello striato è raggiunto (affermato da punti di repere anatomici), utilizzare un pennello per sollevare la fetta e mettere in un bicchiere conossigenato, a temperatura ambiente aCSF. Tipicamente, si possono ottenere 3-4 fette contenente il complesso striatale in modo che il caudato-putamen e nel nucleo accumbens sono inclusi.
9. Lasciare le fette di acclimatarsi in aCSF ossigenata a temperatura ambiente per almeno 1 ora prima di utilizzare per gli esperimenti.

3. Registrazioni voltammetria da fette

Anche se le fette sono incubazione, la camera di registrazione fetta può essere preparato.

1. Prendere tubo collegato alla camera di registrazione sommersione (Custom Scientific, Denver, CO) e porlo in ossigenante, aCSF temperatura ambiente. Impostare la pompa di perfusione (Watson Marlow Limited, Falmouth, in Inghilterra) per una portata di 1 ml / min. Impostare il regolatore di temperatura a 32 ° C. Dopo aCSF riempie il custom-built titolare slice (modificato stadio disco in rete), si prepara per la slice, eliminando eventuali bolle d'aria con una siringa l'ago (BD ago spinale).
2. Primo bagno fetta disegnando un vuoto suldeflusso tubo (che porta alla bottiglia rifiuti di vetro liquido) usando una siringa per iniziare il flusso. Inserire una kimwipe di agire come uno stoppino sul bordo del titolare fetta di controllo di overflow del buffer.
3. Dopo 1 ora di incubazione, trasferire le fettine al titolare fetta nella camera di registrazione, che viene continuamente perfuso con il 95% O ₂ / 5% CO ₂ aCSF temperatura ambiente.
4. Immergere la Ag / AgCl elettrodo di riferimento nel supporto fetta (registrato al coperchio della camera di fetta) e collegare l'elettrodo con una clip a coccodrillo alla fase testa.
   • L'Ag / AgCl elettrodo di riferimento può essere fatto in casa con anodizzazione (+1 V) un filo d'argento 250 micron (PM Systems, Carlsborg, WA) in 1 M HCl per 5 minuti per depositare un sottile strato di AgCl sulla superficie del filo d'argento.
5. Abbassare l'elettrodo stimolante di tungsteno (Plastica Uno, Roanoke, VA), alla superficie della fetta cerebrale dello striato. L'elettrodo stimolante entra in contatto con la fetta in quanto poggia sulla parte superioredi esso, ma non dovrebbe forare la fetta. Nel nostro set-up sperimentale, la stimolazione è generato da uno stimolatore Neurolog.
6. Il microelettrodo in fibra di carbonio di lavoro è di back-riempita con una soluzione 150 mM KCl usando un ago spinale BD. Un filo di piombo viene quindi inserito (Squires Elettronica, Cornelius, O), che è collegato alla fase capo del basso livello di rumore ChemClamp potenziostato (Corporations Dagan, Minneapolis, MN) con un coccodrillo. L'elettrodo di lavoro è posto a circa 100-200 micron di distanza dal elettrodi bipolari stimolante, di circa 75 micron in profondità nel fetta.
7. Stimolazioni elettriche, utilizzando singoli (monofasico, 350 μA, 60 Hz, 4 ms e di larghezza di impulsi) o multipli (ad esempio 5 impulsi, 350 μA, 20 Hz, 4 ms e di larghezza) legumi, vengono consegnati dal elettrodo stimolante per evocare neurotrasmettitore versione ^3.
8. Per misurare la dopamina elettricamente evocate utilizzando FSCV, una forma d'onda triangolare viene applicato l'elettrodo. Parametri tipici per la dopammina rilevazione: potenziale della microelettrodo fibra di carbonio è tenuto a -0,4 V contro un Ag / AgCl elettrodo di riferimento, dilagato a un limite positivo del +1,2 V, poi portato giù a -0,4 V a una velocità di scansione di 400 V / s .
9. La fetta è elettricamente stimolato ogni 5 minuti e le misure di voltammetria l'efflusso dopamina risultanti sono fatte per 15 secondi.
10. Dopo almeno tre registrazioni dopamina stabile stimolati elettricamente rilascio (differenza tra l'altezza di picco è <10%), aCSF contenente agente farmacologico di interesse è perfuso ad un flusso di 1 ml / min sulla fetta per 30 minuti per ottenere il massimo effetto. Registrazioni dopamina stimolati elettricamente, vengono effettuati ogni 5 minuti durante la perfusione farmacologica.

4. Analisi dei dati

Risultante tracce corrente rispetto al tempo ottenuto dalla fetta può essere in forma con la regressione lineare di un insieme di Michaelis-Menten equazioni di base, come descritto da Wightmane colleghi di software scritto in LabVIEW (National Instruments, Austin, TX) ^4-6. In questo software, tracce di corrente in funzione del tempo può essere montato variando due parametri, V _max (Nm / s, corrispondente al tasso di assorbimento da parte del trasportatore della dopamina come dimostra la fase discendente della traccia) e la concentrazione di dopamina per impulso (nM , corrispondente alla massima altezza del picco). Il valore di K _m, riflette l'affinità della dopamina per il trasportatore della dopamina, è impostato a 160 Nm e non è cambiato. L'elettrodo post-calibrazione fattore che è determinata dopo l'esperimento è necessario prima del montaggio. Il software LabVIEW contiene il coefficiente di determinazione (R ²⁾ parametro per determinare la bontà di adattamento (R ² valori> 0,8 sono usati).

5. Rappresentante Risultati

FSCV è stato utilizzato per esaminare singolo impulso, stimolati elettricamente, il rilascio di dopamina e l'assorbimento nel caudato-putamen (CPU), il nucleo accumbens (NAc) core, e NAc shell nei topi. Risultati rappresentativi mostrato nella Figura 1A dimostrare trame corrente (o concentrazione) in funzione del tempo. La freccia rossa indica quando la stimolazione elettrica viene applicata la fetta seguito da un corrispondente aumento la quantità di corrente attribuibile a variazioni di concentrazione di dopamina nel microelettrodo fibra di carbonio. Il processo predominante durante la stimolazione elettrica è il rilascio di dopamina, ma altri processi come l'assorbimento e diffusione contribuisce l'altezza complessiva di picco osservato pure. La fase discendente del picco è dovuto prevalentemente alle ricaptazione del neurotrasmettitore dal suo trasportatore poiché la stimolazione neuronale è stato arrestato ^7. Tuttavia, il decadimento di picco non si limita alla ricaptazione, come la diffusione e il metabolismo anche contribuire alla diminuzione della corrente. E 'stato postulato che poiché la scala temporale della misura elettrochimica è una manciata di secondi, FSCV è troppo veloce per misurare contributions dal metabolismo ^7. In queste tracce corrente in funzione del tempo, l'asse y è convertita in concentrazione (mM) utilizzando il post-esperimento fattore di calibrazione. L'inserto per la Figura 1A è il background rispettivi sottratto voltammograms ciclica per le tracce di corrente in funzione del tempo. Tracciando la corrente misurata (asse y) contro il potenziale applicata agli elettrodi (asse x), la dopamina è chimicamente identificato con un picco di ossidazione osservato a 0,6 V e un picco corrispondente riduzione della dopamina-orto-chinone è osservato - 0,2 V contro un Ag / AgCl elettrodo di riferimento. La rappresentazione terzo dei dati utilizza un'immagine tridimensionale a colori pseudo-plot (Figura 1B) combinando le informazioni provenienti da entrambe le tracce corrente in funzione del tempo e la voltammogram ciclica per formare un unico appezzamento. Nel rappresentante pseudo-colore trama, il tempo è tracciata in pochi secondi lungo l'asse x, la tensione applicata al microelettrodo fibra di carbonio di lavoro è graficamente lungo l'asse y, e la corrente è rappresentato come false il colore lungo l'asse z. A causa delle piccole dimensioni di microelettrodi in fibra di carbonio (~ 7 micron di diametro), le dinamiche della dopamina stimolati elettricamente, può essere rilevato in discrete regioni anatomiche del corpo striato (CPU vs NAc nucleo contro NAc shell; Figura 2).

Un vantaggio di usare striatale fette coronali è che elimina i contributi dei corpi cellulari della dopamina, e permette una indagine delle dinamiche dopamina presinaptica. Controllo presinaptico del rilascio di dopamina e l'assorbimento non è strettamente limitato alla autorecettori della dopamina o funzioni trasportatore come altri hanno mostrato ^{16, 17.} Eterorecettori di altri sistemi neurotrasmettitoriali della dopamina anche modulare le dinamiche di ^{18, 19.} Tracce attuale rappresentante in funzione del tempo mostrato nella Figura 3A dimostrare che quando le fette sono trattati con mM quinpirole 1 (agonista dei recettori D2/D3) per 30 minuti, una diminuzione del rilascio di dopamina elettricamente evocate si osserva. D'altra parte, quando un substratoper il trasportatore della dopamina, come la metanfetamina, è perfuso sulla fetta per 30 minuti, nessuna differenza di rilascio di dopamina si osserva (Figura 3B). Il decadimento di picco è spostato a destra, che in genere è associata ad alterazioni nella cinetica trasportatore della dopamina _(m K) ^3. Infine, la Figura 3C è una traccia rappresentante della traccia corrente in funzione del tempo una volta che la fetta è stata immersa in un ng / mL 100 derivato dal cervello fattore neurotrofico (BDNF) soluzione, che è stato ipotizzato per influenzare il rilascio di dopamina dinamiche ^{20, 21.} Da questa traccia di rappresentanza, si può notare che il BDNF ha la capacità di aumentare il rilascio di dopamina elettricamente evocate. Presi insieme, questi trattamenti farmacologici sottolineare l'utilità di FSCV per sondare le dinamiche della dopamina all'interno del corpo striato.

Il limite principale di usare fettine di cervello di indagare le dinamiche della dopamina presinaptica da FSCV è che il neurocircuitry da un cervello intatto è perduto.Con FSCV fetta è impossibile studiare gli effetti dei neurotrasmettitori da altre regioni del cervello, rendendo difficile comprendere i contributi di questi sistemi sulla funzionalità della regione indagato (per esempio il corpo striato) o per valutare i livelli di dopamina non stimolati. Tuttavia, i recenti progressi tecnici in FSCV ha consentito misure transitorie per la dopamina (con e senza stimolazione elettrica) in ratti liberi di muoversi in risposta ad una manipolazione farmacologica, auto-amministrazione, o novità ^22-24. Nel complesso, la fetta FSCV fornisce preziose informazioni sulla dinamica della dopamina presinaptica, e giunto risultati FSCV fetta di tecniche neurochimiche complementari quali microdialisi, elettrofisiologia, e / o di muoversi liberamente FSCV offre una visione più completa del funzionamento dei neurotrasmettitori nel cervello.

Figura 1. Elettricamente evocate Dopaminrilascio e misurata utilizzando FSCV come singolo impulso di stimolazione a fette CPu spinali dei topi C57BL/6J. (A) La concentrazione contro traccia temporale in cui è stato evocato il rilascio di dopamina da un singolo impulso (freccia rossa). L'asterisco singolo rappresenta i fattori che contribuiscono all'aumento della concentrazione, che è prevalentemente il rilascio di dopamina, ma l'assorbimento e la diffusione anche contribuire. Il doppio asterisco rappresenta il picco del segnale di ritorno alla linea di base, principalmente per l'assorbimento, ma anche la diffusione contribuisce. Inset visualizza la voltammograms ciclico corrispondente. (B) Rappresentante trame del colore dal momento dorsale visualizzazione CPU (asse x), applicato potenziale per il microelettrodo in fibra di carbonio rispetto a Ag / AgCl elettrodo di riferimento (asse y), e la corrente in pseudo-colore.

Figura 2. Rilascio di dopamina evocato da un singolo impulso di stimolazione elettrica (indicata dalla freccia rossa) nel nucleo NAcconchiglia e dai topi C57BL/6J. (A e C) La concentrazione rispetto al tempo e le loro tracce voltammograms ciclico corrispondente (riquadro) dal nucleo NAc e la shell. (B e D) Come descritto in precedenza, i grafici a colori rappresentante del nucleo NAc e la shell.

Figura 3 tracce Rappresentante dopo la partizione è stata trattata con un agente farmacologico per 30 minuti;. In tutti i casi, un singolo impulso è stato utilizzato per evocare il rilascio di dopamina nella CPU. (A) Domanda di agonista del recettore della dopamina D2, quinpirole (traccia rossa) rispetto al pre-trattamento (traccia nera). (B) perfusione metamfetamina (traccia viola) rispetto al pre-trattamento (traccia nera). (C) La capacità del cervello-derivato fattore neurotrofico di influenzare le dinamiche della dopamina (traccia blu) rispetto al pre-trattamento (traccia nera).

Discussione

Il protocollo presentato qui dimostra come preparare e utilizzare fette coronali del cervello del mouse per gli esperimenti FSCV. Anche se questo metodo è specifico per ottenere e misurare la dinamica della dopamina, neurotrasmettitori altri come l'adenosina, perossido di idrogeno, noradrenalina e serotonina sono stati monitorati in vivo o in vitro con FSCV ^{3, 8 - 11.} FSCV può essere utilizzato per monitorare alcune di queste sostanze neurochimiche altri semplici modifiche della forma ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome	Azienda	Numero CAS
Reagente
Cloruro di potassio	Pescatore	7447407
Cloruro di sodio	EMD chimici	7647145
Cloruro di magnesio	Pescatore	7791186
Cloruro di calcio	Pescatore	10035048
Bicarbonato di sodio	EMD chimici	144558
Fosfato di sodio, dibasico	EMD chimicas	7558794
D-glucosio	Pescatore	50997
Acido ascorbico	Pescatore	50817
Saccarosio	Pescatore	57501
Materiale	Venditore	Numero di catalogo
Fibra di carbonio	Goodfellow Oakdale, PA
Capillare di vetro	AM Sistemi Carlsborg WA.	602000
In filo d'argento	A-M Systems Carlsborg WA.	787000
Tungsteno elettrodo stimolante	Una plastica, Roanoke, VA
Filo di platino
Cavo	Elettronica scudieri, Cornelius, O
Loctite 404 adesivo istantaneo	Hankal Corp. Rocky Hill CT.
Lametta	Mondo precisione Instruments Inc. FL.
BD spinale ago	BD Medical Systems, Franlin Lake, NJ	REF 405234
Lama chirurgica	Piuma di sicurezza rasoio Co. LTD. Giappone
Software	Venditore	Numero di catalogo
TH software	ESA Inc., Chelmsford, MA
Strumento	Venditore	Numero di catalogo
Registrazione camera di immersione	Personalizzati scientifico, Denver, CO
Neorolog stimolo isolatore	Digitmeter, Hertfordshire, Inghilterra
Controllo automatico della temperatura	Warner Instrument Corporation
Microscopio (SZX7)	Olimpo
Microscopio	Pescatore
Vibratome 3000 sezionamento sistema	S. Louè, MO.
Perfusione pompa	Watson Marlow Limited, Falmouth Cornwall - Inghilterra	H110708
Micropipetta estrattore	Narishige, Tokyo, Giappone
ChemClamp potenziostato	Dagan Corporazioni, Minneapolis, MN.