慢性ニコチン投与によるマウスノックインで蛍光標識ニコチン性受容体のスペクトル共焦点イメージング

要約

私たちはより良いアプローチノックインおよびスペクトルを用いた受容体の蛍光タンパク質タグを含むアプローチの組み合わせを使用して、ニコチン中毒のメカニズムを理解するCNSニューロンの特定のサブタイプの細胞内領域内のニコチン性アセチルコリン受容体の変化を定量化する新しい技術を開発しました共焦点イメージング。

要約

中枢神経系（CNS）のリガンド依存性イオンチャネルは、深刻な医学的および社会的影響を持つ多数の条件に関与している。例えば、喫煙を介してニコチンへの中毒は、早死に世界的に（世界保健機構）の主要な原因である可能性が高いと脳¹のイオンチャネルの分布の変化によって引き起こされます。 ^1月3日脳組織内のニコチン性アセチルコリン受容体（nAChRs）数の増加の両方のげっ歯類およびヒトの結果の慢性ニコチン曝露。同様に、グルタミン酸作動性GluN1またはGluA1チャネルの変化は、そのようなコカイン、アンフェタミンとアヘン^4月6日のような他の依存性薬物に感作を誘発に関与している。

したがって、特定のイオンチャネルの分布と発現パターンをマッピングし、定量化する能力は、中毒のメカニズムを理解する上で非常に重要です。脳領域特異的EFの研究個々の薬剤のfectsこのような放射性リガンドとしての技術の出現によって進められた。しかし、放射性リガンド結合の低空間分解能は、ニューロンの特定のサブタイプのリガンド依存性イオンチャネルを定量化する能力を防ぎます。

そのような緑色蛍光タンパク質（GFP）とその多くの色の変種とし ​​て遺伝的にエンコードされた蛍光レポーターは、生物学の⁷分野に革命をもたらしました。遺伝的にタギングすることで蛍光レポーターは1つがin vivoで ^7-10 のタンパク質を可視化することができます内因性蛋白質に。プローブを用いた蛍光タグタンパク質の一つの利点は、標的タンパク質に非特異性とアクセシビリティの問題を抱えている抗体の使用の排除です。我々は、トランスフェクションした培養細胞¹¹にフェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）を用いた受容体アセンブリーの研究を有効にして蛍光ラベルnAChRs、この戦略を使用しています。最近では、我々は石油公社を使用しているK-のスペクトル共焦点顕微鏡^12を介して中枢神経系ニューロンのサブミクロンの解像度で受容体を ex vivoでの正確な定量を可能にする、α4のnAChRサブユニット（α4YFP）をタグ付け黄色蛍光タンパク質を持つエンジニアのマウスへのアプローチ。対象と蛍光ノックイン変異は野生型マウスのタグの付いていない受容体に比較した場合の発現と受容体の調節の正常なレベルを生産する、内因性遺伝子座にその天然のプロモーターの制御下に組み込まれています。このノックインアプローチは蛍光他のイオンチャネルをタグ付けしCNS内の受容体の可視化と定量化の強力なアプローチを提供していますように拡張することができます。

本稿では、慢性的なニコチンへの曝露後、特定のCNSニューロンでのnAChR発現の変化を定量化する方法を説明します。私たちの方法は、ミニ浸透圧ポンプ注入、心臓内灌流固定、蛍光標識ニコチンRECのイメージングと解析が含まれていからeptorサブユニットα4YFPノックインマウス（図1）。我々は、固定脳tissue.We詳細に正確にα4YFP蛍光シグナルを得るためにautofluoresent信号を減算する線形スペクトルアンミキシングアルゴリズムと組み合わせてスペクトル共焦点顕微鏡を使用して、私たちのイメージング手法を説明しますから、蛍光最小限に抑えるために固定技術を最適化しました。最後に、我々は、海馬の内側perforantパス内のα4YFP受容体の慢性的なニコチン誘発性の亢進の結果を示しています。

プロトコル

1。ポンプの注入

1. ポンプの注入前に、Alzetミニ浸透圧ポンプ（Alzet、モデル2002、クパチーノ、米国）は気泡を導入しないように注意して記入して準備します。ミニ浸透圧ポンプのこのモデルは、14日間で0.5μL/ hrの速度でソリューションを提供します。無菌状態を確認します。空と充填ポンプの重量を量る。実験（10日移植後）の終了時に、ポンプ内の残りの液体を注射器と注射針を除去し、ポンプ容積を計算するために計量することができます。
2. 制御ソリューションのポンプは（0.9％W / V、Teknova、S5819、ホリスター、アメリカ）生理食塩水が含まれています。 （ - ） - ニコチン酒石酸水素塩（シグマ社、カタログ番号N5260）生理食塩水で希釈する（0.9％w / v）と0.22μmのシリンジエンドフィルターを通して濾過することにより滅菌ニコチン溶液、1 Mのストック溶液を調製した。我々はこれまでに10日間の0.4および2 mg / kg体重/時（ニコチンの遊離塩基として計算）で、ニコチンを投与しています。
3. 3生理食塩水浴場（3つの準備10cmの生理食塩水）は、ペトリ皿を埋め尽くした。ポンプは充填し、キャップをした後、外殻に、薬物の痕跡を削除するそれぞれの連続した​​生理食塩水お風呂で十分にポンプを洗う。浸しは別の生理食塩水コンテナ内のコントロールとニコチンポンプを維持し、手術まで、ストレージ用の生理食塩水でポンプを満たした。
4. 健康回復を促進し、術後感....

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ディスカッション

量と特定のイオンチャネルの局在を決定するためのノックインマウスモデルにおける蛍光体の使用は多くの利点を提供しています。そのような普遍的にすべての細胞に発現しているアクチン、などのタンパク質とは対照的に、イオンチャネルは、はるかに少ない数で存在し、それらの発現は困難で、従来の免疫組織化学的手法を介して正確な分析を行うニューロンのサブタイプ間で異なり?.......

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資料

試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント
ミニ浸透圧ポンプ	Alzet	モデル2002
生理食塩水	Teknova	S5819
（ - ） - ニコチン酒石酸水素塩	シグマ	N5260
目薬	ノバルティス	涙ジェル
Vetbondグルー	3M	1469SB
ヘパリンナトリウム塩	シグマ	H4784
10倍PBS	インビトロジェン	70011
ケタミン	WyetHアニマルヘルス	0856-4403-01
medatomidine塩酸塩	ファイザー	1950673
23G翼状針	ベクトン·ディッキンソン	367253
パラホルムアルデヒド	電子顕微鏡学	15710
プラスチック製の埋め込み型	VWR	18986から1
10月取付物	組織 - Tek社	4583
Mowiol 4から88	EMD-カルビオケム	475904	pH 8.5の