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Method Article
우리는 더 나은 접근 장물과 스펙트럼을 사용하여 수용체의 형광 단백질 태그를 포함한 접근 방법의 조합을 사용하여 니코틴 중독의 메커니즘을 이해하기 위해 CNS의 뉴런의 특정 subtypes의 subcellular 지역 내에서 nicotinic 아세틸콜린 수용체 변화를 quantifying의 소설 기법을 개발했습니다 공촛점 이미징.
중추 신경계 (CNS)의 리간드 게이트 이온 채널은 심각한 의료 및 사회적 결과와 다양한 조건에 연루된다. 예를 들어, 담배 흡연을 통해 니코틴에 대한 중독은 조기 사망 전 세계 (세계 보건기구)의 주요 원인이며 가능성이 뇌 1 이온 채널 배포판의 변경에 의해 발생합니다. 1-3 뇌 조직의 nicotinic 아세틸콜린 수용체 (nAChRs)의 증가 숫자 모두 설치류 동물과 인간 결과에서 만성 니코틴 노출. 마찬가지로, glutamatergic GluN1 또는 GluA1 채널의 변경 같은 코카인, 암페타민과 약물 4-6와 같은 다른 중독성 약물에 sensitization를 실행에 연루되었습니다.
따라서 특정 이온 채널의 유통 및 표현 패턴을 매핑하고 계량하는 능력은 중독의 메커니즘을 이해하는데에 매우 중요합니다. 뇌의 특정 지역과 관련된 EF의 연구개별 약물 fects 같은 방사성 리간드와 같은 기술의 출현에 의해 승진되었다. 그러나 방사성 리간드 바인딩의 낮은 공간 해상도는 뉴런의 특정 subtypes에 리간드 게이트 이온 채널을 계량하는 능력을 방지한다.
같은 녹색 형광 단백질 (GFP) 및 여러 색상의 변형과 같은 유전적으로 인코딩 형광등 기자는 생물학 7 분야에 혁명을했습니다. 유전자 태그를 추가하여 하나가 생체내 7-10에서 단백질을 시각화 수있는 내생 단백질에 형광 기자. 프로브로 fluorescently 태그 단백질의 한 가지 이점은 nonspecificity하고 대상 단백질에 대한 접근의 문제가 항체 이용 철폐입니다. 우리는 교양 transfected 세포 11 포스터 공명 에너지 전송 (무서워)를 사용하여 수용체 어셈블리의 연구를 활성화 fluorescently 라벨 nAChRs,이 전략을 사용했습니다. 최근에는 우리가 knoc를 사용한K-의 스펙트럼 공촛점 현미경을 통해 12 CNS의 뉴런에서 submicrometer 해상도의 수용체 전의 생체내의 정확한 양을 정함있게 α4 nAChR의 subunits (α4YFP를) 태그로 노란색 형광 단백질과 엔지니어 마우스에 접근합니다. 타겟팅 형광 장물에 돌연변이 wildtype 생쥐에서 태그가 지정되지 않은 수용체에 비해 표현과 수용체의 규제의 정상적인 수준을 생산, 내생 현장에와 토착 발기인의 통제하에 통합됩니다. 이 장물의 접근법은 fluorescently 다른 이온 채널에 태그를 확장하고 CNS에있는 수용체를 시각화하고 quantifying의 강력한 접근 방식을 제공 할 수 있습니다.
본 논문에서 우리는 만성 니코틴에 노출된 후 특정 CNS의 뉴런에 nAChR 표현의 변화를 계량하기위한 방법론을 설명합니다. 우리의 방법은 미니 삼투 펌프 주입, intracardiac 관류 고정, 이미징 및 fluorescently 태그가 nicotinic 레크 리에의 분석을 포함에서 eptor의 subunits α4YFP 장물의 생쥐 (그림 1). 우리는 자세하게 정확하게 α4YFP 형광 신호를 얻기 위해 autofluoresent 신호를 뺀것하는 선형 스펙트럼 unmixing 알고리즘과 함께 스펙트럼 공촛점 현미경을 사용하여 우리의 이미징 방법론에 대해 설명 고정 뇌 tissue.We에서 autofluorescence을 최소화하기 위해 고정 기술을 최적화했습니다. 마지막으로, 우리는 해마의 중간 perforant 경로에 α4YFP 수용체의 만성 니코틴을 유발 upregulation 결과를 보여줍니다.
1. 펌프 주입
2. α4YFP 노크 -에서 마우스 고정 intracardiac 재관류에 의해
3. 스펙트럼 공촛점 현미경을 사용하여 이미징 형광의 nAChRs
4. 스펙트럼 공촛점 이미지 및 이미지 분석의 선형 unmixing
5. 대표 결과
우리는 스펙트럼 공촛점 현미경으로 찍은 homozygous α4YFP 마우스 (그림 3A)에서 중간 habenula의 이미지 람다 스택의 대표적인 진정한 컬러 투영을 보여줍니다. 우리는 또한 동일한 람다 스택 이미지 (그림 3B)에서 α4YFP 긍정적인 뉴런을 포함하는 관심 영역에서 발광 스펙트럼을 보여줍니다. 뚜렷한 발광 피크는 ~ 527 nm의에서 분명 어느 YFP의 정상 형광 방출이다. 중간 habenula 이웃 지역 α4YFP nAChR의 subunits의 부재를 나타내는 527 nm의 스펙트럼에서 피크가 부족 발광 스펙트럼을 보여줍니다. 중요한 방출의 중첩 (그림 4), YFP의 분리 및 autofluorescent 신호 YFP의 참조 스펙트럼과 마우스 뇌 autofluoresence를 사용하여 선형 스펙트럼 unmixing을 준수하면 매우 저조한 α4YFP unmixed 이미지, autofluorescent unmixed 이미지와 나머지 채널이 가능합니다. α4YFP 독감의 지우기 지방화orescence는 중간 habenula (그림 4)의 단단히 포장 소마에서 확인할 수 있습니다.
해마의 α4YFP에서는 주로 중간 perforant 경로 tempero-ammonic 경로와 alveus 12 현지있다. 이들은 해마의 모든 glutamatergic innervation 있습니다. 우리는 hippocampal perforant 경로 (그림 5)에서 α4YFP 표현에 만성 니코틴의 효과를 조사했다. 니코틴의 만성 행정 (10 일간 2 밀리그램 / ㎏ / HR)은 만성적인 니코틴 취급 생쥐 (P = 0.001, 윌콕슨이 순위 합계 테스트)에 대한 제어 염분 처리된 생쥐에서 α4YFP 형광 크게 증가 (69 ± 14 %) 결과 ( 그림. 5).
만성 니코틴과 α4YFP의 nAChR의 subunits의 이미지 변화 과정을 보여주는 그림 1. 플로우 차트. 미니 삼투 펌프는 염분이나 니코틴 하나 가득하고 & 탁월한에 subcutaneously 이식된다헥타르; 4YFP homozygous 생쥐. 10 일 마우스가 4 % paraformaldehyde와 마우스 머리로 perfused 및 고정 후 슬라이드에 (30 μm의 두께) sectioned 있습니다. 뇌 부분 스펙트럼 공촛점 현미경 (니콘 C1si)에 몇 군데와 spectrally YFP 및 autofluorescent 이미지로 unmixed있다. 그런 다음 α4YFP 이미지는 ImageJ 소프트웨어와 더 분석하고 있습니다.
그림 2. 스펙트럼 공촛점 현미경에서 몇 군데와 선형의 스펙트럼 구성 요소로 unmixed 람다 스택의 개략도. () 이미지의 람다 스택이 수집됩니다. (B) 람다 스택 방출 스펙트럼은 전체 스택에 걸쳐 각 픽셀에 대해 수집하도록 빛의 다른 파장에서 수집된 이미지로 구성되어 있습니다. YFP 및 조직 autofluorescence는 각 특성 스펙트럼 서명을 가지고 있기 때문에 (C), 람다 스택은의로 선형 unmixing 대수 알고리즘을 사용하여 deconvolved 수eparate YFP 및 autofluorescent 신호. 따라서 YFP 형광 매우 정확 부량도 autofluorescence 높은 수준과 조직을 결정하실 수 있습니다.
그림 3. α4YFP의 nAChRs을 표현하는 뇌 영역의 스펙트럼 공촛점 이미지입니다. 니콘 C1si 스펙트럼 공촛점 현미경으로 촬영한 α4YFP 마우스 중간 habenula의 이미지 람다 스택의 () 진정한 컬러 투영. (B) α4YFP 포함하는 뉴런 (녹색), 그리고 중간 habenula (적색) 이외의 관심 영역을 포함하고 관심 영역에서 스펙트럼의 음모.
그림 4. 중간 habenula의 선형 스펙트럼 unmixing. unmixed α4YFP의 () 이미지와 (B) autofluorescence 따라 선형 스펙트럼 unmixing. YFP의 (C) 참조 스펙트럼 (녹색 트라이앵글)와 autofluorescence (노란색 동그라미)은 스펙트럼 unmixing을 위해 사용됩니다.
그림 5.의 해마에서 α4 nAChRs의 Upregulation α4YFP 장물의 만성 니코틴에 노출된 생쥐. () 해마에서 α4YFP 형광 타일 몽타주. 두 점선 선택 영역 분석은 각각의 마우스에 대해 수행되었다 해마의 perforant 경로의 열등한 사지의 대략적인 위치입니다. (B) α4YFP 형광 만성 식염수 (*, P = 0.001, 윌콕슨이 순위 합계 테스트)보다 만성 니코틴에 노출된 생쥐들의 perforant 경로에 상당히 높은했습니다. 결과가 나타내는 의미 ± SEM N에서 염분과 만성 모두 니코틴 취급 생쥐 (각 치료 그룹 5 생쥐)에 대한 측정 = 20.을
그림 6. 나은 Dα4YFP의 epth 표현은 항체 라벨링에 비해. 보조 라벨 (B)와 Cy5와 α4YFP 형광 ()와 VGlut2 항체의 XZ 직교 전망이 있습니다. (C) α4YFP (오픈 원)에 비해 항체 염색법 (검은색 사각형)에 대한 심도 이상의 큰 형광 신호 강도 저하를 보여주는 음모.
수량 및 특정 이온 채널의 지방화를 결정하는 장물의 마우스 모델에서 형광 수용체의 사용은 장점 번호를 제공합니다. 이러한 ubiquitously 모든 셀에 표시됩니다 actin 등의 단백질과 대조적으로 이온 채널이 훨씬 더 적은 숫자로 존재하는 그들의 표정은 도전하는 전통 immunohistochemical 기법을 통해 정확한 분석하기의 연결을 subtypes 사이에 다릅니다. α4YFP 유전자 제품은 동일한 발기인, 강화와 인신 ...
우리는 공개 할게 없다.
앤서니 Renda는 빅토리아 대학원 화목 상을 대학에 의해 지원되었다. Myre와 위너 프 리드 그렇소 기금, 혁신 기금, 브리티시 컬럼비아 기술 개발 기금을위한 캐나다 재단 -이 연구는 자연 과학 및 캐나다의 발견 그랜트 공학 연구 협의회, NARSAD 젊은 탐정 수상 (RN까지), 빅토리아 재단에 의해 지원되었다 그리고 자연 과학 및 캐나다 연구 도구 및 계측 그랜트 공학 연구 협의회. 우리는 우수한 마우스 축산을 위해 질리언 맥케이, 크리스티나 반즈, 에리얼 설리반, 제니퍼 맥도날드와 다니엘 Morgado 감사드립니다.
시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
미니 삼투 펌프 | Alzet | 모델 2002 | |
식염 | Teknova | S5819 | |
(-)-니코틴 수소 주석산 소금 | 시그마 | N5260 | |
점안액 | 노바티스 | 눈물 - 겔 | |
Vetbond 접착제 | 3M | 1469SB | |
헤파린 나트륨 소금 | 시그마 | H4784 | |
10X PBS | Invitrogen | 70,011 | |
케타민을 | WyetH 동물 건강 | 0856-4403-01 | |
medatomidine 하이드로 클로라이드 | 화이자 | 1,950,673 | |
23G 나비 바늘 | Becton 디킨슨 | 367,253 | |
paraformaldehyde | 전자 현미경 과학 | 15,710 | |
플라스틱 삽입 몰드 | VWR | 18986-1 | |
10월 장착 컴파 운드 | 조직 - 테크 | 4583 | |
Mowiol 4-88 | EMD-Calbiochem | 475,904 | 산도 8.5 |
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