ステップ成長PEG-ペプチドハイドロゲルからβ細胞のスフェロイドの発生と復旧

要約

次のプロトコルは、チオール - エン写真クリック反応により形成された段階成長PEG-ペプチドハイドロゲルで、膵β細胞をカプセル化するための技術を提供する。この材料プラットフォームは、細胞のカプセル化のためのcytocompatible微小環境を提供していますが、また、ヒドロゲル内に形成されたセル構造のユーザ制御の迅速な復旧を可能にするだけでなく。

要約

ヒドロゲルは、培養治療に関連する細胞または組織のための組織のような弾力性と高透磁率を有する三次元微小環境を提供する親水性架橋ポリマーである。ポリ（エチレングリコール）（PEG）誘導体から調製されたヒドロゲルはますます彼らの同調可能とcytocompatible特性に起因して部分的には、組織工学の様々なアプリケーションに使用されています。このプロトコルでは、B細胞、膵臓MIN6をカプセル化するためにPEG-ペプチドハイドロゲルを作製するために、チオール - エン段階的成長photopolymerizationsを利用した。ゲルは4アームPEG - ノルボルネン（PEG4NB）マクロマー及びキモトリプシン敏感なペプチド架橋剤（CGGYC）によって形成された。 PEGの親水性及び非汚染性の性質は、3Dで細胞の生存と増殖のためcytocompatible微小環境を提供しながら、キモトリプシン感受性のペプチド配列（の使用C GGY↓C、矢印は酵素切断部位を示している一方、端末の嚢胞アイネ残基）はチオール - エン架橋のために追加されたハイドロゲル内に形成細胞構成物の迅速な復旧を可能にします。以下のプロトコルがためのテクニックを詳しく説明します：チオール - エンヒドロゲルでMIN6β細胞の（1）カプセル化、（2）定性的および定量的な細胞生存率アッセイ細胞の生存と増殖を決定するために、（3）細胞スフェロイドの回復は、キモトリプシン媒介ゲルを用い浸食、そして回収されたスフェロイドの（4）の構造と機能の解析。

概要

ヒドロゲルは修復および再生組織のための足場材料として非常に優れたポテンシャルを有する親水性架橋ポリマーである^。1月3日ヒドロゲルの高含水の栄養素と細胞代謝産物の酸素と交換の容易な拡散を可能にし、これらの全てが細胞の生存を維持するために重要です。また、ヒドロゲルは、彼らのcytocompatibilityが主因、ポリ（エチレングリコール）（PEG）から調製したものとして²合成ヒドロゲルはますます組織工学用途で使用されている。放出制御とその高い同調性による細胞送達のための優れたキャリアである組織のような弾力性、材料の物理的および機械的性質の高い同調性^4-6

一般的に使用されるハイドロゲル·プラットフォームが、研究では、連鎖成長photopolymerizationsによって形成されたPEGアクリレート（PEGDA）ヒドロゲルは、カプセル化された細胞をドゥーリを損傷する傾向があることが示されているngのネットワーク架橋および in situ細胞カプセルインチ ⁷細胞の損傷は、主にヒドロゲルに架橋ポリマー鎖にPEGDA上のビニル基を介して伝播する光開始剤分子によって生成されたラジカル種に起因するものであった。残念ながら、これらのラジカル種は、特にそのような膵β細胞などのラジカル感受性細胞では、細胞のカプセル化中にストレスや細胞の損傷を引き起こす^。8-10良く拡散し、細胞生存のためのより高いメッシュサイズを得るためには、より高い分子量はPEGDA多くの場合、細胞のカプセル化に使用されます。しかし、これは、重合速度を損なうと次善ゲル生物物理学的特性を引き起こします^{。7,11,12は、}上記の欠点に加えて、それが原因の異質性と非分解性の性質にPEGDAハイドロゲルからの細胞構造を回復するのは非常に困難である架橋ネットワーク。プロテアーゼ感受性ペプチドを配合することができますが酵素による切断に感受性がそうでなければ不活性PEGDAヒドロゲルをレンダリングするために、PEGマクロマーバックボーンに、結合はしばしば高価な試薬を使用し、結果としてネットワークの中には、依然として、連鎖成長重合の性質による不均質性の高い学位を含む^。13-15

最近では、段階成長チオール-エン光重合を介して形成されたPEG-ペプチドハイドロゲルは、連鎖成長重合によって形成されたハイドロゲルを介して細胞のカプセル化のための優先的な性質を示すことが示されている。チオール-エンヒドロゲルの⁷優れたゲル化動態は"クリックに起因している'チオールとエンの機能との間の反応の性質。 PEGDAの連鎖成長重合に比べて、チオール-エン反応は、より速くゲル化速度が得られる。少ない酸素が^​​16,17チオール-エンヒドロゲルはまた、より高い重合効率と連鎖成長PEGDAヒドロゲル^、7と比較してより良いジェル生物物理学的特性を有する阻害される^{、18 <}/ sup>の光重合中にラジカル種による限られた細胞の損傷をもたらす。

ペプチド架橋剤を含む4アームPEG -ノルボルネン（PEG4NB）マクロマー及びビス-システインにより形成された以前に、チオール-エンヒドロゲル、プロテアーゼ感受性ペプチドは細胞のカプセル化に利用されているような。のPEGヒドロゲルネットワークの^7,18ハイ同調性が提供細胞の生存と活動を調査するための柔軟かつ制御可能な3次元微小環境、プロテアーゼ感受性ペプチド配列の使用はヒドロゲル内で自然に形成された細胞構成体の回復のための穏やかな方法を提供している。このプロトコルでは、4アームPEG-ノルボルネン（PEG4NB）とMIN6β細胞のカプセル化のためのキモトリプシン敏感なペプチド架橋剤（CGGY↓C）を用いて製作段階成長光重チオール - エンハイドロゲルを利用しています。このプロトコルは、体系的にMIN6の生存、増殖およびスフェロイド形成を研究するためのテクニックを詳しく説明チオール - エンヒドロゲルでβ細胞。今後は、β細胞のスフェロイド回収し、回収スフェロイドの生物学的特性評価するための方法を提供する。

プロトコル

A.マクロマーとペプチド合成

1. 確立されたプロトコルを使用して、4アームPEG-ノルボルネン（PEG4NB）と光開始剤リチウム^{arylphosphanate（LAP）。18,19を}合成
2. マイクロウェーブペプチド合成装置（CEMディスカヴァーSPS）で標準的な固相ペプチド合成法を用いたキモトリプシン感受性のペプチドCGGY↓Cを（矢印はキモトリプシン切断部位を示す）を含むビス - システインを合成する。
   1. 樹脂および合成スケールの置換率に基づき、必要に応じ樹脂（スケートリンクアミドMBHA樹脂）の量を計算します。 15分間反応容器（RV）にジメチルホルムアミド（DMF）中の樹脂を膨潤。
   2. DMF中の20％ピペリジンと0.1M HOBtを含む脱保護溶液を使用して樹脂からのFmoc-保護基を除去。マイクロ波アシストのFmoc-脱保護（すべてのFmoc-アミノ酸のための）のために、以下の表にリストされているパラメータを使用します。

      合成スケール	0.1ミリモル	0.2ミリモル
      パワー	20 W	50 W
      温度	75℃	75℃
      時間	3分	3分

   3. 脱保護の後、DMFで樹脂を洗浄したFmoc（N末端アミンの露出）の削除を確認するニンヒドリンテストを実行します。樹脂は、95℃で2分後に青くなるはずです
   4. 成功した脱保護の後、カップル、次の表に示すパラメータを持つベーター塩基溶液（DMF中0.28 Mのジイソプロピルエチルアミン（DIEA））のC末端（合成はCからN末端から実行されます）の最初のFmoc-アミノ酸。

      合成スケール	0.1ミリモル	0.2ミリモル
      パワー	20 W	50 W
      温度*	75℃	75℃
      時間*	5分	5分

      
      *嚢胞と彼のために、50℃、10分間、ラセミ化を減らすために使用します。
   5. 樹脂を洗浄し、質的にカップリングの完了（N末端アミンの消失）を確認するためにニンヒドリンテストを実行します。樹脂は、95℃で5分間後に明確にする必要がありますニンヒドリン試験が陽性の結果（青色）を返した場合にカップリング工程（A.2.d）を繰り返します。
   6. 最終脱保護工程で終わるシーケンス内の追加のアミノ酸に脱保護（ステップA.2.b）とカップリング（ステップA.2.d）を繰り返します。
   7. RVを排出し、25mlのジクロロメタン（DCM）で樹脂を洗浄してください。このステップは基本であり、ペプチド切断の妨げになるDMFを、洗い流すことです。
   8. 250メートルを混合することにより、切断カクテルを準備4.75ミリリットルトリフルオロ酢酸（TFA）、0.125ミリリットルトリイソプロピルシラン（TIS）と0.125ミリリットル蒸留H _{2 O}中のフェノールグラム
   9. マイクロウェーブペプチド合成装置で30分間RVおよび開裂に切断溶液を加える（パワー= 20 W、温度= 38℃）。
   10. 吸引マニホールドを用いて50 mlの遠心チューブ内のペプチド溶液を収集します。
   11. エーテル、渦ペプチドを収集するための5分間3000 rpmで遠心チューブと40mlに切断されたペプチドを沈殿させた。
   12. 上澄み液を排出し、ステップA.2.kを二回繰り返す。
   13. 真空中でのペプチドを採取し、乾燥させます。
   14. HPLCを用いてペプチドを精製し、質量分析法とそれを特徴付ける。

Bの材料の準備と滅菌

1. マクロマーが完全に溶けるまで、PBS中の20重量％PEG4NBソリューション、ボルテックス混合物を準備し、シリンジフィルターを用いてマクロマー溶液を滅菌する。 -20℃（準備アリコートで滅菌溶液を保存長期保管の場合）。
2. PBS中で2重量％の光開始剤（LAP）の溶液を調製し、滅菌する。光から保護して室温で滅菌溶液を保管してください。
3. PBS中のペプチド（CGGYC）を溶解、ボルテックス混合し、シリンジは滅菌のためのソリューションをフィルタリングします。アリコート使用するまで-20℃でペプチド溶液とストア（凍結融解サイクルを防ぐ）。
4. エルマン試薬を用いて調製されたペプチド溶液中のチオール基（-SH）濃度（製造業者のプロトコールに従う）を決定します。このステップでは、チオール-エン写真クリックで反応に使用されるペプチド量を算出するために必要とされる正確なペプチド濃度（ すなわち 、[SH] / 2）を与える。
5. かみそりの刃（ゲルの除去のための開口先端）を使用して滅菌した1ミリリットル使い捨て注射器の上の部分をカットしてゲル化金型を準備します。オートクレーブによる注射器の金型を滅菌する。
6. 所望のゲル製剤（ エン比= 1〜チオール ）と株式メイトの濃度に基づいてリアルでは、ポリマー、ペプチド架橋剤、光開始剤、および必要な緩衝液の必要量を計算します。

C.細胞の調製

1. 、ハンクス平衡塩溶液（細胞培養培地（;、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、250 ng / mlのファンギゾンと抗生物質抗真菌及び50μMのβ-メルカプトエタノール、10％ウシ胎児血清を含む高グルコースDMEM）を平衡化37〜HBSSは、Ca ^{2 +、Mg 2 +の}フリー）、およびトリプシン-EDTA℃に
2. CO ₂インキュベーターからMIN6β細胞を含むフラスコを取り外し、層流フード内でフラスコを置く。
3. フラスコから細胞培養培地を吸引除去し、HBSSで細胞を洗浄してください。
4. 2Xの3ミリリットル（0.1％）、トリプシン-EDTAを用いて細胞をトリプシン処理し、37℃で4分間フラスコをインキュベート℃、5％CO _2。
   • 注：使用2Xトリプシン溶液は、単一の細胞懸濁液にMIN6β細胞の完全な解離することができます。
5. インキュベーション後、細胞を完全に分離するために静かにボンネットの表面にフラスコをタップします。顕微鏡を用いて細胞の剥離と解離を確認してください。
6. トリプシンを中和するために、細胞培養培地の等量を追加します。穏やかにピペッティングにより良く混合し、1,000 rpmで5分間遠心し、正規のチューブに混合物を転送します。
7. 上清を吸引除去し、穏やかに4で細胞を再懸 - 培地5mlを。
8. 血球計数器では50％トリパンブルー緩衝液を用いて細胞密度を決定します。

D.ハイドロゲルの作製とセルカプセル化

1. 細胞は準備ができたら、ミックス（エン比1:1〜チオールに基づく）PEG4NB、CGGYC、LAPは、細胞溶液、およびマイクロチューブにHBSSの必要なボリューム。
2. 穏やかに均質な混合物を得るとシリンジ型に得られた溶液の25μlを追加するには、ピペットを用いて溶液を混ぜる。紫外光（365シリンジを公開2分間程度、5 mW / cm ^2）を。
3. 以下の光重合、細胞培養培地を含む滅菌24ウェルプレートに飛び込むゲルおよび37℃、5％CO ₂のヒドロゲルをインキュベートする。
4. 緩く付着した細胞と未架橋マクロマーを洗い流すために30分間、細胞培養培地中の細胞を含んだハイドロゲルを洗浄します。新鮮な培地にゲルを移します。
5. 2〜3日ごとにリフレッシュ細胞培養用培地。

大腸菌細胞生存​​率アッセイ

カプセル化された細胞の形態は、（合成されたハイドロゲルは透明であるため）光顕微鏡を用いて観察することができます。細胞生存率を可視化し、LIVE / DEAD染色を使用して定量的にAlamarBlue試薬を用いて定性的に測定することができます。

E.1。 LIVE / DEAD染色

1. 室温でLIVE / DEAD染色試薬を解凍します。
2. 正規のチューブに染色されるサンプルの数（n）に応じてPBSを追加します。
   PBS = N×500μl の合計体積
3. カルセインAMおよびPBSを含む標準的なチューブにPBSを1mlあたりEthD-1の2μlのピペット0.25μlの。渦成分を混合するためのソリューションを提供します。
4. オービタルシェーカー上で室温で1時間ライブ/デッド染色溶液（0.5ミリリットル/サンプル）中の細胞を含んだハイドロゲルをインキュベートする。
5. パスツールピペットを用いて、色素溶液を除去し、PBSで2回サンプルをすすいでください。
6. カバースリップやスライドガラス上にサンプルを置きます。共焦点顕微鏡を用いて細胞を観察した画像。

E.2。 AlamarBlueアッセイ

1. 細胞培養培地中で10 V / V％AlamarBlue溶液を調製します。
2. インキュベーターからヒドロゲルを取り外し、ヒドロゲルとの接触をせずに、各ウェルの培地を吸引除去する。
3. 16時間10パーセントAlamarBlue溶液500μlで細胞を含んだハイドロゲルと空井戸（ネガティブコントロール）をインキュベートする。
4. インキュベーション、ピペットを200μl以下マイクロプレートリーダー（：波長560nm、発光：59​​0nmで励起）を用いて96ウェルプレートとメジャー蛍光のAlamarBlue液。
   • 高い細胞の代謝活動が高い蛍光測定値を与えるために染料を削減します。
   • ブランクとして10％Alamarblue溶液の少なくとも二つのウェルを必ず含めてください。データを分析する場合、試料の蛍光測定値から平均化された空白の蛍光値を減算します。

F.キモトリプシンはジェル侵食とスフェロイド回復を媒介

1. HBBSと滅菌フィルター溶液中でトリプシン遊離α-キモトリプシン溶液の1 mg / mlの準備をします。
2. 完全なゲルの侵食が達成されるまで、穏やかに振とうしながら室温でキモトリプシン溶液中のヒドロゲル（各ゲルに500μl）をインキュベートする。
   • 25μlのゲルの場合、完全な浸食のための時間は約5分です。
3. の活性を低下させるために数分間氷上にプレートを置きキモトリプシン。
4. 2分間300rpmで1ミリリットル管と遠心分離機で細胞溶液、4℃を転送します。
5. 慎重に牧草ピペットを用いて上清を除去し、優しくHBSS中のスフェロイドを再懸濁します。
6. 24ウェルプレートに回収した回転楕円体溶液を移し、スフェロイドが落ち着くできるように氷の上にプレートを置きます。
7. サイズの解析では、光学顕微鏡を用いた落ち着いたスフェロイドの位相コントラスト画像を取得する。尺度は、そのようなニコン要素ソフトウェアやImageJのようなソフトウェアを使用してスフェロイド直径を回復した。

回収されたスフェロイドのG.機能アッセイ

G.1。回収された細胞のスフェロイドからグルコース刺激によるインスリン分泌

1. 24ウェルプレート中で、1時間、2 mMの低グルコースKerbsリンガー液（KRB）500μlのゲルをインキュベートする。
2. ゲルを侵食しF.6にステップF.1を用いた細胞スフェロイドを回復。
3. いずれかをせずに慎重に上清を吸引し細胞スフェロイドと連絡し、2mMの低グルコースKRB500μlのスフェロイドを再懸濁する。
4. 0.6mlのチューブに細胞スフェロイド溶液100μLを移し、細胞内ATPの定量化のための氷の上に置きます。
5. 半分に残りの細胞スフェロイド溶液（2マイクロ遠心チューブに）分割し、300 rpmおよび4℃で2分間遠心℃、
6. 上清を吸引（ほぼ底まで）および25 mMの高グルコース、KRBと2mM低グルコースKRB 1ml中の後半1mlの細胞スフェロイドの前半を再懸濁します。
7. 穏やかに24ウェルプレートに回収された細胞のスフェロイドを含む溶液をピペットと転送します。 ℃、5％CO _2で 37℃で1時間静置します。
8. インキュベーション後、℃、1,000 rpmで、4℃で2分間微量遠心チューブと遠心分離機にソリューションを転送
9. インスリンを4で別のマイクロ遠心チューブや店舗℃に遠心分離管からの上清500μlをELISA法。
10. インスリンELISA以下、製造業者のプロトコルを実行します。

G.2。 CellTiterグロアッセイ

1. ATPの規格：10μMATP溶液を準備し、8つの標準ソリューションのシリーズを取得するために希釈を行う。
2. 白色96ウェルプレートに、細胞スフェロイド溶液（ステップG.1.6から）と基準の50μlを添加する。
3. 各ウェル含有試料と基準に、CellTiter Glo試薬50μlを追加し、室温で15分間インキュベートする。
4. インキュベーション後、マイクロプレートリーダーを用いて試料および標準のメジャー発光数とATPの基準によって生成された線形回帰曲線を用いて、試料のATP濃度のキャリブレーションを行います。
5. 試料中の総A​​TP濃度を決定し、1セルを含んだハイドロゲルで細胞内ATP濃度を得るために、試料希釈係数を掛けます。

G.3。インスリン分泌を決める

1. 天羽を計算低グルコース培地中に分泌されたインスリンの量を高グルコース培地中に分泌されたインスリンの量の比をとることによって回復スフェロイドから分泌されるインスリンのnt。
2. 回収した細胞スフェロイドの細胞内ATPのそれぞれの量を用いた細胞スフェロイドの定量インスリン含量を正規化します。

結果

図1-4ショーカプセル化のための代表的な結果、生存、増殖、スフェロイド形成、およびチオール-エンヒドロゲルで回転楕円体の回復を図1に PEG4NBとCGGYCを使用して（1）段階成長チオール-エン光重合の反応の概略図を示し、（表面浸食のメカニズムを次の2）キモトリプシン媒介ゲル浸食。ライブ/デッド染色とAlamarBlueアッセイを使用して得られた図2?...

ディスカッション

説明されたプロトコルはステップ成長重合によって形成されたチオール - エンハイドロゲル中の細胞の容易なカプセル化の詳細を提示します。チオール官能基ノルボルネンの1:1の化学量論比は、このプロトコルで使用されていたものの、比率は、実験に応じて調整することができる。正しい処方に加えて、それはプレポリマー溶液中で均一性を維持することが重要です。具体的には、細胞が?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
名前	会社	カタログ番号	注釈
4アームPEG（20kDa）	Jenkemテクノロジー米国	4ARM-PEG-20K
Fmoc-アミノ酸	Anaspec
LIVE / DEAD細胞の生存キッ​​ト	インビトロジェン	L3224	カルセインAMとエチジウムホモ-1を含む
AlamarBlue試薬	ABD Serotec社	BUF012
CellTiter Glo試薬	プロメガ	G7570
DPBS	ロンザ	17-512F	のCa +2およびMg 2なし
HBSS	ロンザ	10547F	せずにのCa +2およびMg 2
高グルコースDMEM	Hyclone社	SH30243.01
FBS	ギブコ	16000-044
抗生物質抗真菌	インビトロジェン	15240-062
β-メルカプトエタノール	シグマアルドリッチ	M7522-100ML
トリプシン-EDTA	インビトロジェン	15400-054
トリプシン遊離α-キモトリプシン	ワージントン生化学株式会社	LS001432
マウスInusin ELISAキット	Mercodia	10-1247-01
1ミリリットル使い捨て注射器	BD Biosciences社