Geração e recuperação de β-esferóides de células a partir do passo de crescimento-PEG-péptido Hidrogéis

Resumo

O protocolo a seguir fornece técnicas para encapsular as células pancreáticas β na etapa de crescimento-PEG-péptido hidrogeles formados por reacções foto-clique tiol-eno. Esta plataforma de material não só proporciona um microambiente cytocompatible para encapsulamento de células, mas também permite que controlado pelo utilizador a recuperação rápida de estruturas de células formadas dentro dos hidrogéis.

Resumo

Os hidrogéis são polímeros reticulados hidrófilos que proporcionam um microambiente tridimensional com tecido semelhante a elasticidade e permeabilidade elevada para a cultura de células ou tecidos terapeuticamente relevantes. Hidrogeles preparados a partir de poli (etileno glicol) (PEG), os derivados são cada vez mais utilizados para uma variedade de aplicações de engenharia de tecidos, em parte devido às suas propriedades e cytocompatible sintonizáveis. Neste protocolo, utilizamos tiol-eno etapa de crescimento photopolymerizations para fabricar PEG peptídeo-hidrogéis para encapsular pancreático MIN6 b-células. Os géis foram formadas por 4 braços PEG-norborneno macrómero (PEG4NB) e um agente de reticulação de péptidos quimotripsina-sensível (CGGYC). A natureza hidrófila e não-incrustante de PEG proporciona um microambiente cytocompatible para sobrevivência e proliferação celular em 3D, enquanto o uso de quimotripsina sensível sequência peptídica (C GGY ↓ C, seta indica local de clivagem da enzima, enquanto cisto terminaiseine resíduos foram adicionados por tiol-eno reticulação) permite uma recuperação rápida de estruturas celulares que formam dentro do hidrogel. O protocolo que se segue desenvolve técnicas para: (1) encapsulamento dos MIN6 β células-tiol-eno hidrogéis, (2) ensaios de viabilidade qualitativa e quantitativa de células para determinar a sobrevivência e proliferação das células, (3) A recuperação de esferóides de células usando quimotripsina mediada gel erosão, e (4) a análise estrutural e funcional dos esferóides recuperados.

Introdução

Hidrogéis são hidrofílicas polímeros reticulados com potencial excepcional como materiais de andaimes para reparar e regenerar os tecidos. ^1-3 O alto teor de água de hidrogéis permite fácil difusão de oxigênio e troca de nutrientes e produtos metabólicos celulares, os quais são fundamentais para a manutenção da viabilidade celular. Além disso, os hidrogéis são excelentes veículos para a libertação controlada e distribuição das células, devido a sua alta tunability. ^Dois hidrogeles sintéticos tais como aqueles preparados a partir de poli (etileno glicol) (PEG) são cada vez mais utilizados em aplicações de engenharia de tecidos, em grande parte devido à sua cytocompatibility, tecido- como a elasticidade, e tunability elevado em material as propriedades físicas e mecânicas. ^4-6

Apesar de uma plataforma de hidrogel de uso geral, os estudos mostraram que o PEG diacrilato (PEGDA) hidrogeles formados por cadeia de crescimento photopolymerizations têm uma tendência para danificar as células encapsuladas during reticulação da rede e na encapsulação de células in situ. ⁷ O dano celular foi largamente atribuída a espécies de radicais livres gerados pelas moléculas de fotoiniciador, que se propagam através dos grupos de vinil sobre PEGDA a cadeias de polímero em ligação cruzada de hidrogéis. Infelizmente, estas espécies radicalares também provocar tensões e danos celulares durante a encapsulação de células, especialmente para radical células sensíveis, tais como as células pancreáticas β. ^8-10 De modo a obter um tamanho de malha maior para uma melhor difusão e sobrevivência celular, pesos moleculares mais elevados PEGDA são muitas vezes utilizados para a encapsulação de células. Isto, no entanto, compromete a cinética de polimerização e causa sub-óptimas propriedades de gel biofísicos. ^7,11,12 Além das desvantagens acima mencionadas, é muito difícil recuperar as estruturas celulares a partir de hidrogéis PEGDA devido à natureza heterogeneidade e não degradável de as redes reticuladas. Enquanto protease sensíveis péptidos podem ser incorporadosem PEG backbone de macrómero para processar os hidrogéis de outro modo inertes PEGDA sensíveis à clivagem enzimática, a conjugação frequentemente utiliza reagentes dispendiosos e as redes resultantes contêm ainda elevado grau de heterogeneidade devido à natureza da cadeia de crescimento-polimerização. ^13-15

Recentemente, o PEG-péptido hidrogeles formados via passo crescimento fotopolimerização-tiol-eno Foi demonstrado que exibem propriedades preferenciais para a encapsulação de células sobre hidrogeles formados por fotopolimerização cadeia crescimento. ⁷ A cinética de gelificação superiores de tiol-eno hidrogéis é atribuído ao clique " "natureza da reação entre o tiol e funcionalidades Ene. Em comparação com o crescimento da cadeia de polimerização de PEGDA, tiol-eno reacção é menos inibida de oxigénio o que resulta em taxas mais rápidas de gelificação. ^16,17 tiol-eno hidrogeles também têm uma maior eficiência de polimerização e melhores propriedades biofísicas do gel comparado com o crescimento da cadeia-PEGDA hidrogéis, ^{7 , 18 <}/ Sup>, que resulta em dano celular limitada causada por espécies de radicais livres durante a fotopolimerização.

Anteriormente, tiol-eno hidrogéis formada por quatro braços-PEG-norborneno (PEG4NB) macrómero e de cisteína bis-reticuladores contendo péptidos, tais como a protease sensíveis péptidos têm sido utilizados para a encapsulação de células. Tunability ^7,18 Alta de redes de hidrogel de PEG proporciona um flexível e controlável microambiente 3D para investigar a sobrevivência de células e de actividade, enquanto que a utilização de protease-sensitive sequência peptídica fornece uma forma suave para a recuperação de estruturas celulares formadas naturalmente dentro de hidrogéis. Neste protocolo, utilizamos passo crescimento fotopolimerizável tiol-eno hidrogéis fabricado usando 4-braço PEG-norborneno (PEG4NB) e um agente de reticulação de péptidos quimotripsina-sensível (CGGY ↓ C) para a encapsulação de células β MIN6. Este protocolo sistematicamente elabora técnicas para estudar a formação de proliferação, sobrevivência e esferóide de MIN6β células-tiol-eno hidrogeles. Nós ainda proporcionar um método para a recuperação de células β esferóide e caracterização biológica de esferóides recuperados.

Protocolo

A. Macrómero e Peptide Synthesis

1. Sintetizar quatro braço-PEG-norborneno (PEG4NB) e arylphosphanate fotoiniciador lítio (LAP), usando protocolos estabelecidos ^18,19.
2. Sintetizar bis-cisteína contendo quimotripsina sensível peptídeo CGGY ↓ C (seta indica quimotripsina local de clivagem) utilizando padrão de síntese de péptidos em fase sólida num sintetizador de péptidos de microondas (CEM Discover SPS).
   1. Calcula-se a quantidade de resina (Rink amida-resina MBHA) necessário com base na relação de substituição da resina e a escala de síntese. Inchar a resina no seio de dimetilformamida (DMF) num recipiente de reacção (RV), durante 15 min.
   2. Remover grupo protector Fmoc a partir da resina utilizando uma solução de desprotecção, contendo 20% de piperidina e 0,1 M de HOBt em DMF. Use os parâmetros listados na tabela abaixo para o forno de microondas, Fmoc-desprotecção (para todos os ácidos Fmoc-amino):

      Escala de síntese	0,1 mmol	0,2 mmole
      Poder	20 W	50 W
      Temperatura	75 ° C	75 ° C
      Tempo	3 min	3 min

   3. Após desprotecção, lavar a resina com DMF e executar o teste de ninhidrina para confirmar a remoção do Fmoc (exposição de amina N-terminal). Resina deve ficar azul após 2 min a 95 ° C.
   4. Após a desprotecção bem sucedida par, o Fmoc-aminoácido primeiro no terminal-C (síntese decorre de C-para N-terminal) de uma solução de base de activador (0,28 M di-isopropiletilamina (DIEA) em DMF), com os parâmetros listados na tabela a seguir .

      Escala de síntese	0,1 mmol	0,2 mmole
      Poder	20 W	50 W
      * Temperatura	75 ° C	75 ° C
      * Tempo	5 min	5 min

      
      * Para Cisto e Seu, use 50 ° C e 10 min para reduzir racemização.
   5. Enxaguar a resina e executar o teste de ninidrina para qualitativamente confirmar a conclusão do acoplamento (desaparecimento da amina N-terminal). Resina deve ser claro depois de 5 min a 95 ° C. Repita o passo de acoplamento (A.2.d) se o teste de ninidrina retorna resultado positivo (cor azul).
   6. Repetir a desprotecção (passo A.2.b) e de acoplamento (A.2.d passo) para aminoácidos adicionais na sequência termina com uma etapa de desprotecção final.
   7. Escorra a RV, lavar a resina com 25 ml de diclorometano (DCM). Este passo é para enxaguar DMF, que é uma base e impede a clivagem do péptido.
   8. Prepare cocktail de clivagem pela mistura de 250 mg de fenol em 4,75 ml de ácido trifluoroacético (TFA), 0,125 ml de triisopropilsilano (TIS) e 0,125 ml de DDQ ₂ O.
   9. Adicionar a solução de clivagem para a RV e decompor durante 30 minutos no micro-ondas sintetizador de péptidos (Power = 20 W; Temperatura = 38 ° C).
   10. Recolher a solução de péptido em um tubo de centrífuga de 50 ml, utilizando tubagem de vácuo.
   11. Peptídeo clivado precipitado em 40 ml de éter, o tubo de vórtice e centrifuga-se a 3000 rpm durante 5 min para recolher o péptido.
   12. Escorra o sobrenadante e repetir A.2.k passo duas vezes.
   13. Recolher e secar em vácuo de péptidos.
   14. Purifica-se o péptido por HPLC e caracterizá-lo com a espectrometria de massa.

B. Preparação de Material e Esterilização

1. Preparar solução a 20% em peso de PEG4NB em PBS, vórtice a mistura até que o macrómero dissolve-se completamente, e esterilizar a solução de macrómero a utilização de um filtro de seringa. Armazene a solução de esterilização a -20 ° C (preparar alíquotaspara armazenamento de longo prazo).
2. Preparar e esterilizar 2% em peso de foto-iniciador (LAP) solução em PBS. Armazene a solução de esterilização a temperatura ambiente, protegida da luz.
3. Dissolve-se o peptídeo (CGGYC) em PBS, a mistura de vórtice e seringa filtrar a solução para esterilização. Alíquota da solução de péptido e armazenar a -20 ° C até ser usado (evitar congelar-descongelar).
4. Determinar tiol (-SH), concentração na solução do péptido preparado usando o reagente de Ellman (seguir o protocolo do fabricante). Este passo irá dar uma concentração de péptido precisas (isto é, [SH] / 2) que é necessária para o cálculo da quantidade de péptido a ser utilizado em tiol-eno foto-clique reacções.
5. Preparar moldes de gelificação, cortando a porção superior fora de seringas de 1 ml estéreis descartáveis ​​usando uma lâmina de barbear (ponta aberta para a remoção do gel). Esterilizar os moldes de seringas em autoclave.
6. Com base na formulação de gel desejada (tiol para eno ratio = 1) e as concentrações de mate estoqueriais, calcular o volume necessário de polímero, agente de reticulação de péptidos, fotoiniciador, e soluções tampão requeridas.

C. Preparação celular

1. Equilibre meio de cultura celular (alta glucose DMEM contendo 10% de soro fetal de bovino; antibiótico-antimicótico com 100 U / penicilina ml, estreptomicina 100 ug / ml, 250 ng / ml de Fungizone, e 50 uM β-mercaptoetanol), Hank solução salina equilibrada ( HBSS, Ca ^{2 +,} Mg ^{2 +} livre), e de Tripsina-EDTA a 37 ° C.
2. Remover frascos contendo MIN6 β células de incubadora de CO ₂ e colocar as garrafas no câmara de fluxo laminar.
3. Aspirar os meios de cultura de células a partir dos balões e enxaguar a célula com HBSS.
4. Tripsinizar as células utilizando 3 ml de 2X (0,1%) Tripsina-EDTA e incubar os balões durante 4 min a 37 ° C e 5% CO _2.
   • Nota: Use 2X solução de tripsina permite a dissociação completa do MIN6 β células em suspensão de célula única.
5. Após a incubação, os frascos toque na superfície do exaustor suavemente para separar completamente as células. Confirmar o desprendimento e dissociação das células, usando um microscópio.
6. Adicionar um volume igual de meio de cultura celular para neutralizar a tripsina. Misture bem a solução por pipetagem suave, em seguida, transferir a mistura para um tubo de centrífuga e canónico durante 5 min a 1000 rpm.
7. Aspirar o sobrenadante e gentilmente re-suspender as células em 4-5 ml de meio de cultura.
8. Determinar a densidade celular, utilizando 50% de tampão de azul de Trypan, em um hemocitómetro.

D. Hidrogel de fabricação e encapsulamento celular

1. Uma vez que as células estão prontas, mistura (com base numa razão de 1:1 a tiol eno) os volumes necessários de PEG4NB, CGGYC, LAP, a solução da célula e, em HBSS em um tubo de microcentrífuga.
2. Misture a solução suavemente com uma pipeta para se obter uma mistura homogénea e adicionar 25 uL da solução resultante para um molde de uma seringa. Expor a seringa à luz UV (365nm, 5 mW / cm ²⁾ durante 2 min.
3. Fotopolimerização seguinte, géis mergulhar num meio com 24 cavidades da placa de cultura estéril contendo células e incubar os hidrogéis de 37 ° C e 5% CO _2.
4. Lave as células carregadas de hidrogéis em meio de cultura de células durante 30 minutos para lavar as células fracamente ligados e não-reticuladas macrómeros. Transferir o gel para um meio fresco.
5. Meios de cultura de células de actualização a cada 2 a 3 dias.

E. Ensaio de viabilidade celular

Morfologia da célula encapsulada pode ser observada usando microscopia de luz (uma vez que os hidrogeles são sintetizados transparente). A viabilidade celular pode ser visualizado e medido qualitativamente utilizando vivo / Dead coloração e quantitativamente utilizando o reagente AlamarBlue.

E.1. Vivo / Morto coloração

1. Descongele reagentes ao vivo / Dead coloração à temperatura ambiente.
2. Num tubo de canónica adicionar PBS de acordo com o número de amostras (n) a ser corado:
   O volume total de PBS = n × 500 ul
3. Pipetar ul de 0,25 calceína AM e 2 ul de EthD-1 por 1 ml de PBS ao tubo contendo PBS canónica. Solução a vórtice para misturar os componentes.
4. Incubar células carregadas de hidrogéis à solução de coloração Live / Dead (0,5 ml / amostra) durante 1 hora à temperatura ambiente num agitador orbital.
5. Utilizando uma pipeta de Pasteur, remover a solução de corante e lavar a amostra duas vezes com PBS.
6. Coloque em uma amostra de lamínula ou lâmina de vidro. Observe e células de imagem usando um microscópio confocal.

E.2. AlamarBlue Ensaio

1. Preparar 10 v / v% solução AlamarBlue em meio de cultura celular.
2. Remover hidrogéis da incubadora e aspirar a mídia para fora de cada bem, sem fazer qualquer contato com o hidrogel.
3. Incubar células carregadas de hidrogéis e um (controle negativo) bem vazio em 500 ul de solução a 10% AlamarBlue durante 16 horas.
4. Após a incubação, 200 uL de pipetada solução de AlamarBlue numa placa de 96 poços e fluorescência medida utilizando um leitor de microplacas (excitação: 560 nm, emissão: 590 nm).
   • Maior actividade metabólica celular reduz o corante para conferir uma maior leitura de fluorescência.
   • Certifique-se de incluir pelo menos dois poços de 10% de solução Alamarblue como espaços em branco. Ao analisar os dados, subtrair o valor em branco média de fluorescência a partir da leitura de fluorescência das amostras.

F. Chymotrypsin Mediada Erosão Gel e Recuperação Spheroid

1. Prepare 1 mg / ml de tripsina-livre solução α-quimotripsina em HBBS e estéril da solução no filtro.
2. Incubar hidrogéis à solução quimotripsina (500 uL para cada gel) à temperatura ambiente com agitação suave até que a erosão gel completa seja alcançada.
   • Para um gel de 25 ul, o tempo para a erosão completa é de cerca de 5 min.
3. Colocar a placa em gelo durante alguns minutos para reduzir a actividade dequimotripsina.
4. Transferir a solução de células em 1 ml de tubo e centrifuga-se a 300 rpm, 4 ° C durante 2 min.
5. Cuidadosamente remover o sobrenadante com uma pipeta de pasto e gentilmente ressuspender os esferóides em HBSS.
6. Transferir a solução recuperada esferóide para uma placa de 24 poços e colocar a placa em gelo para permitir que os esferóides se estabelecer.
7. Para a análise de tamanho, a aquisição de imagens de contraste de fase dos esferóides liquidadas utilizando um microscópio de luz. Medida recuperado diâmetros esferóides usando softwares como o elemento Nikon software ou ImageJ.

G. Ensaio Funcional de esferóides Recuperadas

G.1. Glucose a secreção de insulina estimulada a partir dos esferóides de células recuperadas

1. Numa placa de 24 poços, incubam os géis em 500 ul de 2 mM de glucose baixa Kerbs-tampão de Ringer (KRB), durante 1 hora.
2. Corroer o gel e recuperar esferóides de células utilizando passos F.1 a F.6.
3. Aspirar o sobrenadante cuidadosamente, sem fazer qualquercontacto com os esferóides de células e ressuspender os esferóides em 500 ul de 2 mM de glucose KRB baixo.
4. Transferir 100 uL de solução de esferóides de células para um tubo de 0,6 ml e colocá-lo em gelo para a quantificação de ATP intracelular.
5. Dividir a solução de células remanescente em esferóide metade (em dois tubos de microcentrifugação) e centrifugar durante 2 minutos a 300 rpm e 4 ° C.
6. Aspirar o sobrenadante (quase para o fundo) e ressuspender a primeira metade de esferóides de células em 1 ml de 25 mM de glicose alta KRB e segunda metade, em 1 ml de 2 mM de glucose KRB baixo.
7. Pipetar suavemente e transferir a solução contendo esferóides de células recuperadas a uma placa de 24 poços. Incubar a placa durante 1 hora a 37 ° C e 5% CO _2.
8. Após a incubação, transferir a solução para um tubo de microcentrifugação e centrifugar durante 2 minutos a 1.000 rpm e 4 ° C.
9. Transferir 500 uL do sobrenadante a partir do tubo centrifugado para outro tubo de microcentrífuga e armazenar a 4 ° C para insulinaELISA.
10. Executar o protocolo do fabricante de insulina ELISA seguinte.

G.2. CellTiter Ensaio Glo

1. Padrões de ATP: Prepara-se uma solução de ATP 10 uM e realizar diluições em série para se obter uma série de 8 de soluções-padrão.
2. Para uma placa de 96 branco cavidade, adicionar 50 ul de uma solução de esferóide célula (a partir do passo G.1.6) e padrões.
3. A cada poço contendo as amostras e os padrões, adicionar 50 ul de reagente CellTiter Glo e incubar à temperatura ambiente durante 15 min.
4. Após a incubação, a contagem de medida de luminescência das amostras e padrões usando um leitor de microplacas e calibrar as concentrações de ATP de amostras, utilizando uma curva de regressão linear gerados pelos padrões de ATP.
5. Determinar a concentração de ATP total em amostra e multiplicar pelo factor de diluição da amostra para obter a concentração de ATP intracelular em uma célula carregada de hidrogel.

G.3. Determinar a secreção de insulina

1. Calcular a amount de insulina secretada a partir dos esferóides recuperados, tendo a razão entre a quantidade de insulina segregada no meio de glucose elevada a quantidade de insulina segregada no meio de glucose baixa.
2. Normalizar o teor de insulina quantificados de esferóides de células com respectiva quantidade de ATP intracelular dos esferóides celulares recuperados.

Resultados

As Figuras 1-4 mostram os resultados de sobrevivência representativos para a encapsulação, a proliferação, a formação de esferóides, e recuperação esferóide tiol-eno em hidrogéis. Figura 1 mostra o esquema da reacção de (1) um passo de crescimento de fotopolimerização tiol-eno usando PEG4NB e CGGYC, e ( 2) a quimotripsina erosão gel mediada que segue um mecanismo de erosão de superfície. Figuras 2 e 3 apresentam os resultados ob...

Discussão

O protocolo descrito apresenta detalhes sobre a encapsulação de células simples em tiol-eno hidrogeles formados a passo de crescimento de fotopolimerização. Enquanto uma proporção estequiométrica de 1:1 de norborneno para grupos funcionais tiol foi utilizada neste protocolo, a razão pode ser ajustada de acordo com as experiências. Para além de uma formulação correcta, é importante para manter a homogeneidade da solução de pré-polímero. Em particular, a utilização de pipetagem suave para assegurar que...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome	Companhia	Número de catálogo	Comentários
4 braço-PEG (20 kDa)	Jenkem Tecnologia EUA	4ARM-PEG-20K
Fmoc-aminoácidos	Anaspec
Vivo / Morto kit viabilidade celular	Invitrogen	L3224	Inclui calceína AM e etídio homodímero-1
Reagente AlamarBlue	Abd Serotec	BUF012
CellTiter reagente Glo	Promega	G7570
DPBS	Lonza	17-512F	Sem Ca +2 e Mg +2
HBSS	Lonza	10547F	SemCa +2 e Mg +2
Glicose alta DMEM	Hyclone	SH30243.01
FBS	Gibco	16000-044
Antibiótico-antimicótico	Invitrogen	15240-062
β-mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M7522-100ML
Tripsina-EDTA	Invitrogen	15400-054
Tripsina-livre α-quimotripsina	Worthington Corp Bioquímica	LS001432
Rato Inusin ELISA kit	Mercodia	10-1247-01
Uma seringa descartável ml	BD Biosciences