Создание и восстановление β-клетки сфероидов Из Шаг рост PEG-пептида Гидрогели

Резюме

Протокол предусматривает следующие методы инкапсуляции панкреатических β-клеток на стадии роста PEG-пептида гидрогелей образована тиоловых-ен фото кнопкой мыши реакций. Этот материал платформа предлагает не только cytocompatible микроокружение для сотовых инкапсуляции, а также позволяет пользователю контролируемого быстрого восстановления клеточных структур, образующихся в гидрогелей.

Аннотация

Гидрогели являются гидрофильными сшитые полимеры, которые обеспечивают трехмерное микроокружение с тканью, как эластичность и высокую проницаемость для культивирования терапевтически соответствующие клетки или ткани. Гидрогели получают из поли (этиленгликоль) (ПЭГ) производным все чаще используются для различных областей применения тканевой инженерии, в частности, в связи с их перестраиваемых и cytocompatible свойства. В этом протоколе, мы использовали тиоловых-ен шаг роста photopolymerizations для изготовления PEG-пептида гидрогелей для инкапсуляции панкреатических MIN6 В-клеток. Гели были сформированы 4-руки PEG-норборнен (PEG4NB) макромера и химотрипсин-чувствительных пептида сшивающего агента (CGGYC). Гидрофильные и не загрязнение природы PEG предлагает cytocompatible микроокружения за выживание и пролиферацию клеток в 3D, в то время как использование химотрипсин-чувствительных пептидной последовательности (C GGY ↓ C, стрелка указывает сайт расщепления ферментов, в то время как терминал кистаEine остатки были добавлены для тиоловых-ен сшивание) позволяет быстрое восстановление клеточных конструкций формирования в гидрогель. Следующий протокол разрабатывает методы: (1) Инкапсуляция MIN6 β-клеток в тиоловых-ен гидрогелей; (2) Качественный и количественный анализы жизнеспособность клеток, чтобы определить выживание и пролиферацию клеток; (3) восстановление клеточных сфероидов использовании химотрипсина-опосредованной гель эрозии, и (4) Структурно-функциональный анализ восстановленных сфероидов.

Введение

Гидрогели являются гидрофильными сшитые полимеры с исключительным потенциалом леса материалы для ремонта и регенерации тканей. ^1-3 высоким содержанием воды гидрогелей позволяет легко диффузии кислорода и обмен питательных веществ и клеточных продуктов метаболизма, которые имеют решающее значение для поддержания жизнеспособности клеток. Кроме того, гидрогели являются отличными носителями для контролируемого высвобождения и клеточной доставки из-за их высокой управляемость. ² Синтетическая гидрогели, такие как изготовленные из поли (этиленгликоль) (ПЭГ) все чаще используются в приложениях тканевой инженерии, в основном из-за их cytocompatibility, ткани как эластичность и высокая управляемость в материалах физические и механические свойства. ^4-6

Хотя обычно используется гидрогель платформы, исследования показали, что ПЭГ диакрилат (PEGDA) гидрогели образована цепочка роста photopolymerizations имеют тенденцию к повреждению инкапсулированные клетки Дуринг сшивания сети и на местах инкапсуляции клеток. ⁷ повреждение клеток была в значительной степени отнести к радикальным видов порожденных фотоинициатора молекул, которые распространяются через виниловых групп на PEGDA для сшивания полимерных цепей в гидрогелей. К сожалению, эти радикалы также вызывают стрессы и повреждение клеток в процессе клеточного инкапсуляции, особенно для радикально-чувствительные клетки поджелудочной железы, таких как β-клеток. ^8-10 Для того, чтобы получить более высокий размер ячейки для лучшего распространения и выживания клеток, более высоким молекулярным весом PEGDA часто используется для сотового инкапсуляции. Это, однако, ставит под угрозу кинетики полимеризации и приводит к неоптимальным гель биофизических свойств. ^7,11,12 В дополнение к выше недостатки, это очень трудно восстановить клеточные структуры от гидрогелей PEGDA в связи с неоднородностью и неразлагаемых природы сшитый сетей. В то время как протеазы, чувствительных к пептиды могут быть включеныв PEG макромера основой для визуализации в противном случае инертных PEGDA гидрогелей чувствительны к ферментативного расщепления, сопряжение часто использует дорогостоящих реагентов и в результате сетях по-прежнему содержат высокую степень неоднородности в связи с характером цепной полимеризацией. ^13-15

Недавно PEG-пептида гидрогели образуются с помощью шаг за ростом тиоловых-ен фотополимеризации было показано, обладают свойствами льготных для сотовых инкапсуляция через гидрогелей образована цепочка роста фотополимеризации. ⁷ превосходную кинетику гелеобразования тиоловых-ен гидрогелей объясняется "нажмите "характер реакции между тиоловых и ен функций. По сравнению с цепным ростом полимеризации PEGDA, тиоловых-ен реакции меньше кислорода тормозится, что приводит к более быстрой скорости гелеобразования. ^16,17 Thiol-ен гидрогели также имеют более высокую эффективность полимеризации и лучше гель биофизические свойства по сравнению с цепным ростом PEGDA гидрогелей, ^{7 , 18 <}/ SUP>, что приводит к ограниченной сотовой ущерб, причиненный радикалов во время фотополимеризации.

Ранее тиоловых-ен гидрогелей образована 4-руки PEG-норборнен (PEG4NB) макромера и бис-цистеин содержащих пептидов сшивающие агенты, такие как протеазы, чувствительных к пептиды были использованы для клеточной инкапсуляции. ^7,18 Высокая управляемость сетей PEG гидрогель предлагает гибкой и управляемой 3D микросреду для исследования выживаемости клеток и активность, в то время как использование протеаз чувствительных к пептидной последовательности обеспечивает легкий путь для восстановления клеточных конструкций формируется, конечно, в гидрогелей. В этом протоколе мы используем шаг роста фотополимеризованных тиоловых-ен гидрогелей изготовлены с использованием 4-руки PEG-норборнен (PEG4NB) и химотрипсин-чувствительных пептида сшивающего агента (CGGY ↓ C) для инкапсуляции MIN6 β-клеток. Этот протокол систематически разрабатывает методы для изучения выживаемости, пролиферации и сфероида формирования MIN6β-клеток в тиоловых-ен гидрогелей. Мы также обеспечить метод для β-клетку сфероида восстановления и биологических характеристик восстановленных сфероидов.

протокол

А. Макромер и Синтез пептидов

1. Обобщение 4-руки PEG-норборнен (PEG4NB) и фотоинициатора литий arylphosphanate (LAP), используя установленные протоколы. ^18,19
2. Обобщить бис-цистеин содержащих химотрипсин-чувствительных пептида CGGY ↓ C (стрелка указывает химотрипсин сайт расщепления) с использованием стандартных твердофазного пептидного синтеза в микроволновом синтезаторе пептидов (CEM Discover SPS).
   1. Рассчитайте количество смолы (Ринк-амид MBHA смолы), необходимых на основе замещения соотношение смолы и синтез масштабе. Swell смолы в диметилформамиде (DMF) в реакционном сосуде (RV) в течение 15 мин.
   2. Удалить Fmoc-защитной группы из смолу с помощью снятия защиты раствор, содержащий 20% пиперидина и 0,1 М HOBt в ДМФ. Используйте параметры, перечисленные в таблице ниже для микроволновой помощью Fmoc-разблокировки (для всех Fmoc-аминокислот):

      Синтез масштабе	0,1 ммоль	0,2 ммоль
      Власть	20 Вт	50 Вт
      Температура	75 ° C	75 ° C
      Время	3 мин	3 мин

   3. После снятия защиты, промыть смолы с DMF и выполнять Ninhydrin тест, чтобы подтвердить удаление Fmoc (воздействие N-концевого амина). Смола должна синей после 2 мин при 95 ° C.
   4. После успешного снятия защиты, пару первых Fmoc-аминокислот на С-конце (синтез идет от C к N-конец) в решении базы активатор (0,28 M диизопропилэтиламин (DIEA) в ДМФА) с параметрами, перечисленными в таблице ниже .

      Синтез масштабе	0,1 ммоль	0,2 ммоль
      Власть	20 Вт	50 Вт
      Температура *	75 ° C	75 ° C
      Время *	5 мин	5 мин

      
      * Для кисты и его, используйте 50 ° C и 10 мин для уменьшения рацемизации.
   5. Промыть смолу и выполняют Ninhydrin тест, чтобы качественно подтверждают завершение связи (исчезновении N-концевого амина). Смола должна быть ясной после 5 мин при 95 ° C. Повторите шаг связи (A.2.d), если Ninhydrin тест возвращает положительный результат (синего цвета).
   6. Повторите снятие защиты (шаг A.2.b) и связи (шаг A.2.d) для дополнительных аминокислот в последовательности заканчивая последним шагом снятия защиты.
   7. Слейте RV, промыть смолы с 25 мл дихлорметана (DCM). Этот шаг, чтобы смыть DMF, который является базовым и будет препятствовать пептида декольте.
   8. Подготовка расщепления коктейль путем смешивания 250 мг фенола в 4,75 мл трифторуксусной кислоты (ТФК), 0,125 мл триизопропилсилан (TIS) и 0,125 мл DDH ₂ O.
   9. Добавить расщепления решение в RV и прилепится в течение 30 мин в синтезаторе пептидов микроволновой печи (мощность = 20 Вт; температура = 38 ° C).
   10. Сбор пептидный раствор в 50 мл центрифужные пробирки помощью вакуумного коллектора.
   11. Осадок дрова пептида в 40 мл эфира, вихревая трубка и центрифуге при 3000 оборотов в минуту в течение 5 минут, чтобы собрать пептида.
   12. Слейте супернатант и повторите шаг A.2.k в два раза.
   13. Собирать и сушить пептида в вакууме.
   14. Очищают пептида с помощью ВЭЖХ и характеризуют его с масс-спектрометрии.

B. Подготовка материала и стерилизации

1. Подготовьте 20 мас решение PEG4NB% в PBS, вихрь смесь, пока макромера полностью растворяется, и стерилизовать макромера решение с помощью шприца фильтр. Храните стерилизованные решение при -20 ° C (подготовка аликвотыдля длительного хранения).
2. Подготовка и стерилизовать 2 мас фотоинициатора% (LAP) решение в PBS. Храните стерилизованные раствор при комнатной температуре в защищенном от света.
3. Растворите пептид (CGGYC) в PBS, вихрем смеси и шприц фильтрации раствора для стерилизации. Аликвотировать пептидный раствор и хранят при температуре -20 ° С до использования (предотвращения циклов замораживания-оттаивания).
4. Определить тиоловых (-SH) концентрация в приготовленный раствор пептида использованием реагента Эллман (следуйте протоколу производителя). Этот шаг даст точную концентрацию пептида (например, [SH] / 2), который требуется для расчета количества пептидов, которые будут использоваться в тиоловых-ен фото кнопкой мыши реакций.
5. Подготовка гелеобразования формы путем разрезания верхней части офф 1 мл стерильного одноразового шприца помощью лезвия бритвы (открытый наконечник для удаления геля). Стерилизовать шприц форм в автоклаве.
6. На основании желаемого геля (тиоловых в соотношении ен = 1) и концентрации на складе партнерариалов, рассчитать необходимый объем полимера, сшивателя пептид, фотоинициатора и буферных растворов необходимо.

C. клеточный препарат

1. Уравновесьте культуре клеток среды (высокий уровень глюкозы в DMEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки; антибиотикам противогрибковым с 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 250 нг / мл Fungizone и 50 мкМ β-меркаптоэтанол), сбалансированный солевой Хэнка решение ( HBSS, Ca ^{2 +,} Mg ^{2 +} бесплатно), и трипсина-EDTA до 37 ° C.
2. Удалить колбы, содержащие MIN6 β-клеток из CO ₂ инкубаторе и поместить колбы в ламинарном боксе.
3. Аспирируйте СМИ культуре клеток из колб и промыть клетки с HBSS.
4. Trypsinize клеток с использованием 3 мл 2X (0,1%) трипсина-EDTA и инкубировать в колбах в течение 4 мин при 37 ° C и 5% CO _2.
   • Примечание: Используйте 2X раствор трипсина позволяет полной диссоциации MIN6 β-клеток в суспензии отдельных клеток.
5. После инкубации, нажмите колбы на поверхности капота осторожно, чтобы полностью отделить клетки. Подтвердите отряда и диссоциации клеток с помощью микроскопа.
6. Добавить равный объем клеточной культуральной среде для нейтрализации трипсина. Смешайте раствор хорошо осторожным пипетированием, а затем передать эту смесь к каноническому трубку и центрифуги в течение 5 мин при 1000 оборотах в минуту.
7. Аспирируйте супернатант и осторожно повторно приостановить клеток в 4 - 5 мл культуральной среды.
8. Определить плотность клеток, используя 50% трипанового синего буфера в гемоцитометре.

D. изготовления гидрогеля и клеточной инкапсуляции

1. Как только клетки готовы, смешайте (на основе пропорции 1:1 тиоловых в соотношении ен) требуются объемы PEG4NB, CGGYC, LAP, сотовые решение, и HBSS в микроцентрифуге трубку.
2. Смешайте раствор осторожно с помощью пипетки до получения однородной смеси и добавить 25 мкл полученного раствора в шприце формы. Expose шприц к ультрафиолетовому излучению (365нм, 5 мВт / см ²⁾ в течение 2 мин.
3. После фотополимеризации, окунуться гелей в стерильный 24-луночный планшет среде, содержащей культуру клеток и инкубировать гидрогелей в 37 ° C и 5% CO _2.
4. Вымойте клетки-Ладена гидрогелей в клеточной среде культуры в течение 30 мин, чтобы смыть слабо прикрепленные клетки и снимите сшитый макромеры. Передача гелей в свежей среде.
5. Обновить СМИ культуре клеток каждые 2 до 3 дней.

Е. жизнеспособность клеток анализа

Encapsulated морфологии клеток можно наблюдать с помощью светового микроскопа (с синтезированной гидрогели являются прозрачными). Жизнеспособность клеток могут быть визуализированы и качественно измерять с помощью Live / Dead окрашивания и количественной AlamarBlue использованием реагента.

E.1. Онлайн / Dead окрашивания

1. Оттепель Онлайн / Dead реагентов окрашивания при комнатной температуре.
2. В каноническом трубки добавить PBS в зависимости от количества образцов (N), чтобы быть окрашенные:
   Общий объем PBS = N × 500 мкл
3. Внесите 0,25 мкл Calcein AM и 2 мкл EthD-1 в 1 мл PBS к каноническому пробирку, содержащую PBS. Vortex решение для смешивания компонентов.
4. Инкубируйте клетки-Ладена гидрогелей в Live / Мертвые красящим раствором (0,5 мл / образец) в течение 1 часа при комнатной температуре на орбитальном шейкере.
5. С помощью пипетки Пастера, удалить раствор красителя и промывки образца в два раза с PBS.
6. Поместите образец на листке обложке или стекло. Наблюдайте и изображений клеток с помощью конфокальной микроскопии.

E.2. Анализ AlamarBlue

1. Подготовьте 10 В / V% AlamarBlue решение в клеточной среде культуры.
2. Удалить гидрогелей из инкубатора и аспирации средств массовой информации из каждой лунки без каких-либо контактов с гидрогеля.
3. Инкубируйте клетки-Ладена гидрогелей и пустые хорошо (отрицательный контроль) в 500 мкл 10% AlamarBlue решение в течение 16 часов.
4. После инкубации, пипетки 200 мклрешения AlamarBlue в 96 ячейках и меры флуоресценции с помощью микропланшет-ридера (возбуждения: 560 нм, эмиссия: 590 нм).
   • Высшее сотовой метаболическую активность снижает краситель, чтобы дать высшее флуоресценции чтении.
   • Не забудьте включить по крайней мере, две скважины на 10% Alamarblue решение, как пробелы. При анализе данных, вычесть усредненный пустой флуоресценции значение флуоресценции чтение образцов.

F. Химотрипсин опосредованное Эрозия гель и сфероид восстановления

1. Подготовить 1 мг / мл трипсина-бесплатная α-химотрипсина решение в HBBS и стерильных фильтров решение.
2. Инкубируйте гидрогелей в растворах химотрипсин (500 мкл для каждого геля) при комнатной температуре при осторожном встряхивании до полного эрозии геля достигается.
   • Для 25 мкл геля, время для полной эрозии составляет около 5 мин.
3. Поместите пластину на льду в течение нескольких минут, чтобы снизить активностьхимотрипсина.
4. Передача ячейки раствор в 1 мл и трубки центрифуги при 300 оборотах в минуту, 4 ° C в течение 2 мин.
5. Осторожно удалите супернатант использования пастбищ пипетки и осторожно ресуспендируют сфероидов в HBSS.
6. Передача восстановленных сфероида решение 24-луночный планшет и поместите пластину на льду, чтобы сфероиды, чтобы успокоиться.
7. Для анализа размера, приобретают фазовый контраст изображения поселился сфероиды с помощью светового микроскопа. Измерение восстановился сфероид диаметром с использованием программного обеспечения, таких как Nikon элемент программного обеспечения или ImageJ.

Г. функциональный анализ из регенерированного сфероидов

G.1. Глюкоза стимулировать секрецию инсулина, восстановленные из сфероидов клетки

1. В 24-луночный планшет, инкубировать гелей в 500 мкл 2 мМ низкий уровень глюкозы в Бордюры-Ringer буфера (КРФ) в течение 1 часа.
2. Erode геля и восстановить клетки сфероиды, используя шаги, чтобы F.1 F.6.
3. Аспирируйте супернатант осторожно, не делая никакихсвязаться с клеткой сфероидов и ресуспендируют сфероидов в 500 мкл 2 мМ низкой KRB глюкозы.
4. Передача 100 мкл раствора ячейки сфероидов в 0,6 мл трубки и поместить его на льду в течение внутриклеточных количественного СПС.
5. Разделить оставшиеся клетки сфероида решение в два раза (на две трубки микроцентрифужных) и центрифугируют в течение 2 мин при 300 оборотах в минуту и ​​4 ° C.
6. Супернатант (почти до дна) и ресуспендируют первой половине ячейки сфероидов в 1 мл 25 мм KRB глюкозы и вторую половину в 1 мл 2 мМ низкой KRB глюкозы.
7. Аккуратно пипетки и передать раствор, содержащий восстановился сфероидов ячейки в 24-луночный планшет. Инкубировать в течение 1 часа при температуре 37 ° C и 5% CO _2.
8. После инкубации, передавать решение микроцентрифужную пробирку и центрифугируют в течение 2 мин при 1000 оборотах в минуту и ​​4 ° C.
9. Передача 500 мкл супернатанта из центрифугированных трубку в другую пробирку микроцентрифужных и хранить при температуре 4 ° С для инсулинаELISA.
10. Выполнить протокол инсулин ELISA следующих производителей.

G.2. CellTiter Glo анализа

1. ATP стандарты: Подготовка 10 мкМ АТФ решения и выполнять серийные разведения для получения серии из 8 стандартных решений.
2. Для белых 96-луночный планшет, добавить 50 мкл клеточной решение сфероида (с шагом G.1.6) и стандартов.
3. В каждую лунку содержащего образцы и стандарты, добавить 50 мкл реагента CellTiter Glo и инкубировать при комнатной температуре в течение 15 мин.
4. После инкубации мера люминесценции количество образцов и стандартов при помощи планшетного и калибровки образца ATP концентрации с использованием линейной кривой регрессии порожденное стандартов СПС.
5. Определение общей концентрации АТФ в образце и умножить на коэффициент разбавления образца, чтобы получить внутриклеточные концентрации АТФ в одной ячейке нагруженные гидрогеля.

G.3. Определить секреции инсулина

1. Рассчитать AmouNT инсулин выделяется из восстановленных сфероидов как отношение количества инсулина выделяется в высокой средней глюкозы в количестве инсулин выделяется в низкий средний глюкозы.
2. Нормализация количественно содержание инсулина в клетке сфероиды с соответствующим количеством внутриклеточной АТФ восстановленных сфероидов клетки.

Результаты

Цифры 1-4 показывают репрезентативные результаты для инкапсуляции, выживание, пролиферацию, сфероид образование, и сфероид восстановления тиоловых-ен гидрогелей. Рисунке 1 показана схема реакции (1) этап роста тиоловых-ен фотополимеризации использованием PEG4NB и CGGYC,...

Обсуждение

Описанный протокол представляет подробную информацию о легкой инкапсуляции клеток в тиоловых-ен гидрогелей формируется за шагом роста фотополимеризации. В то время как стехиометрических соотношении 1:1 норборнена в тиоловые функциональные группы была использована в данном протокол?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Имя	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
4-руки PEG (20kDa)	Jenkem технологии США	4ARM-PEG-20К
Fmoc-аминокислот	AnaSpec
Онлайн / Dead жизнеспособность клеток комплект	Invitrogen	L3224	Включает в себя Calcein AM и этидия гомодимером-1
AlamarBlue реагентов	Абд Serotec	BUF012
CellTiter Glo реагентов	Promega	G7570
DPBS	Lonza	17-512F	Без Ca +2 и Mg +2
HBSS	Lonza	10547F	БезCa +2 и Mg +2
DMEM с высоким содержанием глюкозы	Hyclone	SH30243.01
FBS	Gibco	16000-044
Антибиотик-противогрибкового	Invitrogen	15240-062
β-меркаптоэтанол	Sigma-Aldrich	M7522-100ML
Трипсина-EDTA	Invitrogen	15400-054
Трипсин свободной α-химотрипсина	Уортингтон Биохимические Corp	LS001432
Мышь Inusin ИФА	Mercodia	10-1247-01
1 мл одноразовый шприц	BD Biosciences