Generazione e recupero dei β-cellule Spheroids dal passaggio di crescita PEG-peptide idrogel

Riepilogo

Il seguente protocollo fornisce tecniche per l'incapsulamento pancreatiche β-cellule in fase di crescita PEG-peptide idrogel formati da tiolo-ene foto-click reazioni. Questa piattaforma materiale non solo offre un microambiente cytocompatible per l'incapsulamento delle cellule, ma anche controllato dall'utente consente un rapido recupero delle strutture cellulari formano all'interno dei idrogel.

Abstract

Gli idrogel sono polimeri reticolati idrofili che forniscono un microambiente tridimensionale con tessuto-come elasticità ed elevata permeabilità per coltura di cellule o tessuti terapeuticamente rilevanti. Idrogel preparati da poli (etilene glicole) (PEG) derivati ​​sono sempre più utilizzati per una varietà di applicazioni di ingegneria tissutale, in parte a causa delle loro proprietà e cytocompatible sintonizzabili. In questo protocollo, abbiamo utilizzato tiolo-ene-step crescita photopolymerizations per fabbricare PEG-peptide idrogel per incapsulare pancreatica MIN6 b-cellule. I gel sono stati formati da 4-braccio PEG-norbornene (PEG4NB) e un macromero chimotripsina sensibile reticolante peptide (CGGYC). La natura idrofila e non-fouling di PEG offre un microambiente cytocompatible per la sopravvivenza e la proliferazione cellulare in 3D, mentre l'utilizzo di chimotripsina-sensitive sequenza peptidica (C GGY ↓ C, freccia indica sito di clivaggio enzimatico, mentre cisti terminaleeine residui sono stati aggiunti per tiolo-ene reticolazione) permette un rapido recupero di costruzioni cellulari che formano all'interno del idrogel. Il seguente protocollo elabora tecniche per: (1) Incapsulamento di MIN6 β-cellule nel tiolo-ene idrogel, (2) analisi qualitativa e quantitativa della vitalità cellulare per determinare la sopravvivenza e la proliferazione cellulare, (3) Recupero di sferoidi cellulari usando chimotripsina-mediata gel erosione, e (4) Analisi strutturale e funzionale degli sferoidi recuperati.

Introduzione

Gli idrogel sono idrofili polimeri reticolati con un potenziale eccezionale come materiali ponteggi per la riparazione e la rigenerazione dei tessuti. ^1-3 L'alto contenuto di acqua degli idrogel permette facile diffusione di ossigeno e di scambio di nutrienti e prodotti del metabolismo cellulare, che sono tutti fondamentale per mantenere la vitalità cellulare. Inoltre, gli idrogel sono vettori eccellenti per rilascio controllato e consegna cellulare dovuta loro sintonizzabilità alta. ² idrogel sintetici come quelli preparati da poli (etilene glicole) (PEG) sono sempre più utilizzati in applicazioni di ingegneria tissutale, soprattutto a causa della loro citocompatibilità, tessuto- elasticità simile, e sintonizzabilità alta in materiale proprietà fisiche e meccaniche. ^4-6

Sebbene una piattaforma idrogel comunemente usato, studi hanno dimostrato che PEG diacrilato (PEGDA) idrogel formato da catene crescita photopolymerizations tendono a danneggiare le cellule incapsulate durireticolazione rete ng e in situ incapsulamento delle cellule. ⁷ Il danno cellulare è stato largamente attribuito alla specie radicali generati dalle molecole di fotoiniziatore che si propagano attraverso i gruppi vinilici su PEGDA per reticolare catene polimeriche in idrogel. Purtroppo, queste specie radicali anche causare sollecitazioni e danno cellulare durante l'incapsulamento delle cellule, in particolare per radicale cellule sensibili come β-cellule pancreatiche. ^8-10 Per ottenere una dimensione di maglia superiore per una migliore diffusione e la sopravvivenza cellulare, maggiore peso molecolare PEGDA vengono spesso utilizzati per l'incapsulamento delle cellule. Questo, tuttavia, compromette cinetica di polimerizzazione e provoca sub-ottimali proprietà biofisiche gel. ^7,11,12 Oltre ai suddetti inconvenienti, è molto difficile recuperare strutture cellulari da idrogel PEGDA causa della natura eterogeneità e non degradabile dei le reti reticolati. Mentre proteasi sensibili peptidi possono essere incorporatinel backbone macromero PEG rendere gli idrogel altrimenti inerti PEGDA sensibili alla scissione enzimatica, la coniugazione usa spesso reagenti costosi e le reti risultanti contengono ancora un'elevata eterogeneità a causa della natura della catena crescita polimerizzazione. ^13-15

Recentemente, PEG-peptide idrogel formati tramite step-crescita tiolo-ene fotopolimerizzazione hanno dimostrato di esibire proprietà preferenziali per incapsulamento di cellule nel idrogel formati dalla catena crescita fotopolimerizzazione. ⁷ La cinetica di gelazione superiori di tiolo-ene idrogel è attribuita al 'click 'natura della reazione tra tiolo e funzionalità ene. Rispetto alla catena crescita polimerizzazione di PEGDA, tiolo-ene reazione è inibita meno ossigeno che si traduce in velocità di gelificazione veloce. ^16,17 tiolo-ene idrogel hanno anche maggiore efficienza di polimerizzazione e le proprietà biofisiche gel migliori rispetto alla catena crescita PEGDA idrogel, ^{7 , 18 <}/ Sup> che si traduce in limitate danni cellulari provocati dai radicali specie durante la fotopolimerizzazione.

Precedentemente, tiolo-ene idrogel formato dal braccio 4-PEG-norbornene (PEG4NB) macromero e bis-cisteina reticolanti contenenti peptidi, come proteasi sensibili peptidi sono stati utilizzati per l'incapsulamento delle cellule. ^7,18 sintonizzabilità Massima reti idrogel PEG offre flessibile e controllabile microambiente 3D per indagare la sopravvivenza cellulare e l'attività, mentre l'utilizzo di proteasi sensibile sequenza peptidica fornisce un modo delicato per il recupero dei costrutti cellulari formano naturalmente all'interno di idrogel. In questo protocollo utilizziamo passo-crescita photopolymerized tiolo-ene idrogel fabbricato utilizzando 4-braccio PEG-norbornene (PEG4NB) e chimotripsina sensibile reticolante peptide (CGGY ↓ C) per l'incapsulamento di MIN6 β-cellule. Questo protocollo elabora sistematicamente le tecniche per lo studio della formazione di sopravvivenza, proliferazione e sferoidale di MIN6β-cellule tiolo-ene idrogel. Abbiamo inoltre fornisce metodo per β-cellule recupero sferoide e caratterizzazione biologica di sferoidi recuperati.

Protocollo

A. macromero e sintesi peptidica

1. Sintetizzare 4 bracci PEG-norbornene (PEG4NB) e litio arylphosphanate fotoiniziatore (LAP) utilizzando protocolli stabiliti. ^18,19
2. Sintetizzare bis-cisteina contenente chimotripsina sensibile peptide C CGGY ↓ (freccia indica sito di taglio della chimotripsina) con standard di sintesi peptidica in fase solida in un sintetizzatore di peptidi a microonde (CEM Discover SPS).
   1. Calcolare la quantità di resina (resina Rink amide-MBHA) richiesta in base al rapporto di sostituzione della resina e la scala di sintesi. Rigonfiare la resina in dimetilformammide (DMF) in un recipiente di reazione (RV) per 15 min.
   2. Rimuovere Fmoc-gruppo protettivo dalla resina con una soluzione di deprotezione contenente 20% Piperidina e 0,1 M HOBt in DMF. Utilizzare i parametri elencati nella tabella qui sotto per micro-onde Fmoc-deprotezione (per tutti i Fmoc-amminoacidi):

      Sintesi scala	0,1 mmoli	0,2 mmoli
      Potenza	20 W	50 W
      Temperatura	75 ° C	75 ° C
      Tempo	3 min	3 min

   3. Seguendo deprotezione, lavare la resina con DMF ed eseguire test della ninidrina per confermare la rimozione del Fmoc (esposizione di ammina N-terminale). Resina dovrebbe diventare blu dopo 2 minuti a 95 ° C.
   4. Dopo deprotezione con successo, la prima coppia Fmoc-amminoacido al C-terminale (sintesi va da C a N-terminale) in una soluzione di base attivatore (0,28 M Diisopropiletilammina (DIEA) in DMF) con i parametri elencati nella tabella seguente .

      Sintesi scala	0,1 mmoli	0,2 mmoli
      Potenza	20 W	50 W
      Temperatura *	75 ° C	75 ° C
      Ora *	5 min	5 min

      
      * Per cisti e la sua, utilizzare 50 ° C e 10 min per ridurre racemizzazione.
   5. Risciacquare la resina ed eseguire test della ninidrina per confermare il completamento della qualitativamente accoppiamento (scomparsa di ammina N-terminale). Resina dovrebbe essere chiaro dopo 5 min a 95 ° C. Ripetere il punto di accoppiamento (A.2.d) se il test restituisce ninidrina risultato positivo (colore blu).
   6. Ripetere deprotezione (passo A.2.b) e giunto (A.2.d passo) per ulteriori amminoacidi nella sequenza che termina con un passo deprotezione finale.
   7. Scolare la RV, sciacquare resina con 25 ml di diclorometano (DCM). Questo passo è per sciacquare DMF, che è una base e ostacolerà clivaggio del peptide.
   8. Preparare cocktail scissione mescolando 250 mfenolo in 4,75 ml di acido trifluoroacetico (TFA), 0,125 ml triisopropilsilano (TIS) e 0,125 ml DDH ₂ O. g
   9. Aggiungere la soluzione di scissione nel camper e si unirà per 30 minuti nel forno a microonde sintetizzatore di peptidi (Potenza = 20 W, temperatura = 38 ° C).
   10. Raccogliere la soluzione del peptide in un tubo da centrifuga da 50 ml con collettore di vuoto.
   11. Peptide precipitato spaccati in 40 ml di etere, vortex la provetta e centrifugare a 3000 rpm per 5 minuti per raccogliere il peptide.
   12. Scolare il surnatante e ripetere A.2.k passaggio due volte.
   13. Raccogliere e asciugare peptide nel vuoto.
   14. Purificare il peptide mediante HPLC e caratterizzare con la spettrometria di massa.

B. Preparazione del materiale e sterilizzazione

1. Preparare 20 wt soluzione PEG4NB% in PBS, vortex la miscela finché il macromero dissolve completamente, e sterilizzare la soluzione macromero utilizzando un filtro siringa. Conservare la soluzione sterilizzata a -20 ° C (preparare aliquoteper la conservazione a lungo termine).
2. Preparare e sterilizzare due fotoiniziatore% in peso (LAP) soluzione in PBS. Conservare la soluzione sterilizzata a temperatura ambiente al riparo dalla luce.
3. Sciogliere il peptide (CGGYC) in PBS, vortex la miscela e siringa filtrare la soluzione per la sterilizzazione. Dispensare la soluzione di peptide e conservare a -20 ° C fino all'uso (evitare cicli gelo-disgelo).
4. Determinare tiolo (-SH) concentrazione della soluzione preparata peptide usando il reagente di Ellman (seguire il protocollo del produttore). Questo passo darà accurata concentrazione di peptide (cioè, [SH] / 2) che è richiesto per calcolare l'importo peptide da utilizzare in tiolo-ene fotografica clic reazioni.
5. Preparare stampi gelificazione tagliando la parte superiore fuori di sterili monouso siringhe da 1 ml con una lama di rasoio (punta aperta per la rimozione di gel). Sterilizzare gli stampi siringa in autoclave.
6. Basato sulla formulazione gel desiderato (tiolo rapporto ene = 1) e le concentrazioni di mate magazzinoriali, calcolare il volume richiesto di polimero, reticolante peptide, fotoiniziatore, e soluzioni tampone richieste.

C. Preparazione cellulare

1. Equilibrare terreno di coltura cellulare (alta glucosio DMEM contenente 10% di siero fetale bovino, antibiotici antimicotica con 100 U / ml di penicillina, 100 ug / ml di streptomicina, 250 ng / ml Fungizone, e 50 mM β-mercaptoetanolo), Hank soluzione equilibrata salina ( HBSS, Ca ^{2 +,} Mg ^{2 +} libero), e Tripsina-EDTA a 37 ° C.
2. Rimuovere flaconi contenenti MIN6 β-cellule di CO ₂ incubatore e porre i matracci in cappa a flusso laminare.
3. Aspirare mezzo di coltura dalle beute e sciacquare la cella con HBSS.
4. Tripsinizzare le cellule utilizzando 3 ml di 2X (0,1%) Tripsina-EDTA e incubare i flaconi per 4 min a 37 ° C e 5% di CO _2.
   • Nota: Usare una soluzione di tripsina 2X permette di completa dissociazione MIN6 β-cellule in sospensione singola cella.
5. Dopo l'incubazione, toccare le beute sulla superficie della cappa delicatamente per staccare completamente le cellule. Confermare il distacco e la dissociazione delle cellule al microscopio.
6. Aggiungere uguale volume di mezzo di coltura cellulare per neutralizzare la tripsina. Mescolare bene la soluzione pipettando dolce, quindi trasferire il composto in una provetta canonica e centrifugare per 5 min a 1.000 giri al minuto.
7. Aspirare il surnatante e risospendere delicatamente le cellule in 4-5 ml di terreno di coltura.
8. Determinare la densità cellulare utilizzando 50% Trypan blue tampone in un emocitometro.

D. Fabbricazione Idrogel e Encapsulation cellulare

1. Una volta che le cellule sono pronte, mix (sulla base di un tiolo rapporto 1:1 ene) i quantitativi necessari di PEG4NB, CGGYC, LAP, soluzione cellulare, e HBSS in una provetta da microcentrifuga.
2. Mescolare lentamente la soluzione con una pipetta ad ottenere un impasto omogeneo e aggiungere 25 microlitri della soluzione risultante per uno stampo siringa. Esporre la siringa alla luce UV (365nm, 5 mW / cm ²⁾ per 2 min.
3. Dopo la fotopolimerizzazione, gel immergersi in una sterile 24 e mezzo di cella piastra contenente cultura e incubare le idrogel a 37 ° C e 5% di CO _2.
4. Lavare le cellule cariche di idrogeli in mezzo di coltura cellulare per 30 minuti per lavare le cellule debolmente collegate e poco reticolati macromeri. Trasferire i gel in terreno fresco.
5. Aggiornamento mezzo di coltura ogni 2 o 3 giorni.

E. Cella test di vitalità

Morfologia cellulare incapsulato può essere osservato mediante microscopio ottico (poiché gli idrogel sintetizzati sono trasparenti). La vitalità cellulare possono essere visualizzati e misurati qualitativa, utilizzando Live / Dead colorazione e quantitativamente usando il reagente AlamarBlue.

E.1. Live / Dead colorazione

1. Scongelare Live / Dead reagenti di colorazione a temperatura ambiente.
2. In una provetta aggiungere canonica PBS secondo il numero di campioni (n) di essere tinto:
   Volume totale di PBS = n × 500 microlitri
3. Pipettare 0,25 ml di calceina AM e 2 microlitri di ETHD-1 per 1 ml di PBS al tubo canonica contenente PBS. Vortex la soluzione per miscelare i componenti.
4. Incubare cellule cariche di idrogeli in soluzione colorazione Live / Dead (0,5 ml / campione) per 1 ora a temperatura ambiente su un agitatore orbitale.
5. Usando una pipetta Pasteur, rimuovere la soluzione di colorante e lavare il campione due volte con PBS.
6. Mettere campione su un vetrino coprioggetto o vetrino. Osservare e celle di immagine utilizzando un microscopio confocale.

E.2. AlamarBlue Assay

1. Preparare 10 v / v soluzione% AlamarBlue nel mezzo di coltura cellulare.
2. Rimuovere idrogel da incubatore e aspirare i supporti su ciascun pozzetto senza alcun contatto con l'idrogel.
3. Incubare cellule cariche di idrogel e un vuoto (controllo negativo) e in 500 ml di soluzione al 10% AlamarBlue per 16 ore.
4. Dopo l'incubazione, pipettare 200 uldella soluzione AlamarBlue in una piastra a 96 pozzetti e fluorescenza misura utilizzando un lettore per micropiastre (eccitazione: 560 nm, emissione: 590 nm).
   • L'attività metabolica cellulare superiore riduce il colorante per dare maggiore lettura della fluorescenza.
   • Assicurati di includere almeno due pozzetti della soluzione al 10% Alamarblue come bianco. Nell'analizzare i dati, sottrarre il valore di bianco fluorescenza mediato dalla lettura della fluorescenza dei campioni.

F. Chymotrypsin Mediata Erosione Gel e ripristino Spheroid

1. Preparare 1 mg / ml di tripsina-α-chimotripsina libera in soluzione sterile HBBS e filtrare la soluzione.
2. Incubare idrogel in soluzione chimotripsina (500 microlitri per ogni gel) a temperatura ambiente agitando delicatamente fino erosione gel viene raggiunto.
   • Per un gel 25 pl, il tempo per la completa erosione è di circa 5 min.
3. Posizionare la piastra su ghiaccio per alcuni minuti per ridurre l'attività dichimotripsina.
4. Trasferire la soluzione cellulare in 1 ml provetta e centrifugare a 300 rpm, 4 ° C per 2 min.
5. Rimuovere con attenzione il surnatante con una pipetta pascolo e delicatamente risospendere le sferoidi in HBSS.
6. Trasferire la soluzione recuperata sferoide a un 24-pozzetti e posizionare la piastra su ghiaccio per consentire agli sferoidi di stabilirsi.
7. Per l'analisi dimensioni, acquisire immagini contrasto di fase delle sferoidi corrisposto tramite un microscopio ottico. Misura recuperato diametri sferoidali che utilizzano software come elemento software Nikon o ImageJ.

G. Analisi funzionale di sferoidi recuperati

G.1. Glucosio secrezione di insulina stimolata da sferoidi di cellule recuperate

1. In una piastra a 24 pozzetti, incubare i gel in 500 ml di 2 mM glucosio basso Cordoli-Ringer buffer (KRB) per 1 ora.
2. Erode il gel e recuperare sferoidi cellulari che utilizzano passi F.1 a F.6.
3. Aspirare il surnatante con attenzione senza fare alcunil contatto con gli sferoidi e risospendere le cellule in 500 microlitri sferoidi di 2 KRB mM glucosio basso.
4. Trasferire 100 ul di soluzione di sferoidi cellule in una provetta da 0,6 ml e posizionarlo sul ghiaccio per quantificazione dell'ATP intracellulare.
5. Dividere la soluzione rimanente cellula sferoidale a metà (in due provette da microcentrifuga) e centrifugare per 2 min a 300 giri al minuto e 4 ° C.
6. Aspirare il surnatante (quasi fino al fondo) e risospendere prima metà di sferoidi di cellule in 1 ml di 25 mM di glucosio KRB alta e metà in 1 ml di 2 mM KRB glucosio basso.
7. Delicatamente pipetta e trasferire la soluzione contenente sferoidi di cellule recuperate ad un 24-pozzetti. Incubare la piastra per 1 ora a 37 ° C e 5% di CO _2.
8. Dopo l'incubazione, trasferire la soluzione in una provetta e centrifugare per 2 min a 1000 rpm e 4 ° C.
9. Trasferire 500 pl del supernatante dal tubo centrifugato ad un'altra provetta da microcentrifuga e conservare a 4 ° C per l'insulinaELISA.
10. Eseguire protocollo insulina produttore ELISA successivo.

G.2. CellTiter Glo Assay

1. Norme ATP: Preparare una soluzione di 10 mM ATP e di eseguire diluizioni seriali per ottenere una serie di 8 soluzioni standard.
2. Per un bianco piastra a 96 pozzetti, aggiungere 50 ml di soluzione di cellule sferoide (dal punto G.1.6) e gli standard.
3. Per ciascun campione pozzetto contenente e standard, aggiungere 50 ml di reagente CellTiter Glo ed incubare a temperatura ambiente per 15 min.
4. Dopo l'incubazione, luminescenza conteggio misura dei campioni e degli standard usando un lettore di micropiastre e calibrare campione concentrazioni di ATP utilizzando una curva di regressione lineare generato dalle norme ATP.
5. Determinare la concentrazione totale di ATP presente nel campione e moltiplicare per il fattore di diluizione del campione per ottenere la concentrazione intracellulare di ATP in una cella carica di idrogel.

G.3. Determinare la secrezione di insulina

1. Calcolare la Amount di insulina secreta dalle sferoidi recuperati prendendo il rapporto della quantità di insulina secreta nel terreno di glucosio elevata quantità di insulina secreta nel terreno di glucosio basso.
2. Normalizza il contenuto di insulina quantificata sferoidi cellulari con quantità corrispondente di ATP intracellulare degli sferoidi di cellule recuperate.

Risultati

Figure 1-4 Mostra risultati rappresentativi per l'incapsulamento, la sopravvivenza, la proliferazione, la formazione di sferoide, e il recupero sferoidale in tiolo-ene idrogel. Figura 1 mostra lo schema di reazione (1) fase di crescita tiolo-ene fotopolimerizzazione con PEG4NB e CGGYC, e ( 2) l'erosione chimotripsina gel mediata che segue un meccanismo di erosione superficiale. figure 2 e 3, i risultati ottenuti con la vitalità presenti c...

Discussione

Il protocollo descritto presenta dettagli facile incapsulamento di cellule in tiolo-ene idrogel formati da passo-crescita fotopolimerizzazione. Mentre un rapporto stechiometrico di 1:1 di norbornene a tiolo gruppi funzionali è stato utilizzato in questo protocollo, il rapporto può essere regolata a seconda delle esperienze. Oltre a una corretta formulazione, è importante mantenere omogeneità nella pre-polimero soluzione. In particolare, utilizzare pipettaggio delicato per garantire che le cellule sono ben distribuit...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
4 bracci PEG (20kDa)	Jenkem Technology USA	4ARM-PEG-20K
Fmoc-amminoacidi	Anaspec
Live / Dead cella kit vitalità	Invitrogen	L3224	Include Calcein AM e etidio omodimero-1
AlamarBlue reagente	ABD Serotec	BUF012
CellTiter Glo reagente	Promega	G7570
DPBS	Lonza	17-512F	Senza Ca +2 e Mg +2
HBSS	Lonza	10547F	SenzaCa +2 e Mg +2
Alta glucosio DMEM	Hyclone	SH30243.01
FBS	Gibco	16000-044
Antibiotico-antimicotica	Invitrogen	15240-062
β-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M7522-100ML
Tripsina-EDTA	Invitrogen	15400-054
Tripsina-free α-chimotripsina	Worthington Biochemical Corp	LS001432
Mouse Inusin kit ELISA	Mercodia	10-1247-01
1 ml siringa monouso	BD Biosciences