Génération et récupération des cellules β-Sphéroïdes partir de l'étape de croissance peptidiques hydrogels de PEG-

Résumé

Le protocole suivant fournit des techniques d'encapsulation du pancréas β-cellules à l'étape de croissance PEG-peptide hydrogels formés par thiol-ène photo-cliquez réactions. Cette plate-forme matérielle offre non seulement un micro-cytocompatible pour l'encapsulation de cellules, mais permet également contrôlé par l'utilisateur récupération rapide des structures cellulaires formés dans les hydrogels.

Résumé

Hydrogels sont les polymères réticulés hydrophiles qui fournissent un micro-environnement en trois dimensions avec des tissus en forme de l'élasticité et de perméabilité élevée pour la culture de cellules ou de tissus thérapeutiquement pertinents. Les hydrogels préparés à partir de poly (éthylène glycol) (PEG) sont dérivés de plus en plus utilisé pour une variété d'applications d'ingénierie tissulaire, en partie en raison de leurs propriétés accordables et cytocompatible. Dans ce protocole, nous avons utilisé thiol-ène-étape de croissance photopolymérisations pour fabriquer des hydrogels de PEG-peptide pour l'encapsulation du pancréas min6 cellules B. Les gels ont été formés par 4-bras PEG-norbornène (PEG4NB) macromère et un agent de réticulation peptide chymotrypsine-sensible (CGGYC). Le caractère hydrophile et non encrassement du PEG offre un microenvironnement cytocompatible pour la survie et la prolifération cellulaire en 3D, tandis que l'utilisation de la séquence peptidique chymotrypsine-sensible (C GGY ↓ C, flèche indique le site de clivage enzymatique, kyste terminal pendanteine résidus ont été ajoutés pour thiol-ène réticulation) permet la récupération rapide des constructions cellulaires formant au sein de l'hydrogel. Le protocole suivant développe des techniques pour: (1) L'encapsulation des cellules β min6 de thiol-ène hydrogels, (2) qualitatifs et quantitatifs des tests de viabilité cellulaire pour déterminer la survie et la prolifération cellulaire; (3) Recouvrement de sphéroïdes de cellules utilisant la chymotrypsine médiation gel l'érosion, et (4) l'analyse structurale et fonctionnelle des sphéroïdes récupérés.

Introduction

Les hydrogels sont des polymères hydrophiles réticulés avec un potentiel exceptionnel en tant que matériaux d'échafaudage pour la réparation et la régénération des tissus. ^1-3 La forte teneur en eau des hydrogels permet une diffusion facile d'oxygène et d'échange de nutriments et de produits cellulaires métaboliques, qui sont tous essentiels au maintien de la viabilité cellulaire. En outre, les hydrogels sont porteurs d'excellents pour la libération contrôlée de cellules et la livraison en raison de leur grande accordabilité. ² hydrogels synthétiques tels que ceux préparés à partir de poly (éthylène glycol) (PEG) sont de plus en plus utilisés dans les applications d'ingénierie tissulaire, en grande partie en raison de leur cytocompatibilité, tissus comme l'élasticité, et l'accordabilité élevé en matière des propriétés physiques et mécaniques ^4-6.

Même si une plate-forme d'hydrogel couramment utilisés, des études ont montré que le PEG diacrylate (PEGDA) hydrogels formés par la chaîne de croissance photopolymérisations ont tendance à endommager les cellules encapsulées Duriréticulation du réseau ng et dans l'encapsulation cellulaire in situ. ⁷ Le dommage cellulaire a été largement attribuable à des espèces radicalaires générées par les molécules photo-initiateurs, qui se propagent à travers les groupes vinyle sur PEGDA de réticulation des chaînes de polymères dans des hydrogels. Malheureusement, ces espèces radicalaires également provoquer des contraintes et des dommages cellulaires au cours de l'encapsulation de cellules, en particulier pour les cellules sensibles radical tel que β-cellules pancréatiques. ^8-10 Afin d'obtenir une plus grande taille de maille pour une meilleure diffusion et la survie des cellules, des poids moléculaires supérieurs PEGDA sont souvent utilisés pour l'encapsulation cellulaire. Ceci, cependant, compromet cinétique de polymérisation et provoque propriétés de gel sous-optimales biophysiques. ^7,11,12 En plus des inconvénients mentionnés ci-dessus, il est très difficile de récupérer les structures cellulaires à partir d'hydrogels PEGDA raison de la nature hétérogène et non-dégradable les réseaux réticulés. Alors que la protéase sensibles peptides peuvent être incorporésdans macromère PEG squelette de rendre inertes les hydrogels autrement PEGDA sensibles à un clivage enzymatique, la conjugaison utilise souvent des réactifs coûteux et les réseaux résultants contiennent encore des haut degré d'hétérogénéité due à la nature de la chaîne de croissance de polymérisation. ^13-15

Récemment, le PEG-peptide hydrogels formés par l'étape de croissance de thiol-ène photopolymérisation a été démontré que présentent des propriétés préférentiels pour l'encapsulation de cellules plus hydrogels formés par la chaîne de croissance de photopolymérisation. ⁷ Les cinétiques de gélification supérieures de thiol-ène hydrogels est attribué au clic » «la nature de la réaction entre un thiol et fonctionnalités ène. Par rapport à la croissance de la chaîne de polymérisation de PEGDA, thiol-ène réaction est inhibée moins d'oxygène qui en résulte rythme plus rapide gélification. ^16,17 thiol-ène hydrogels ont aussi une plus grande efficacité de polymérisation et les propriétés biophysiques de meilleures gel par rapport à la chaîne de croissance PEGDA hydrogels, ^{7 , 18 <}/ Sup> qui se traduit par des dommages cellulaires causés par les espèces peu radicales au cours de photopolymérisation.

Auparavant, thiol-ène hydrogels formés par 4-bras PEG-norbornène (PEG4NB) macromère et bis-cystéine peptidiques contenant des agents de réticulation, tels que les protéases sensibles peptides ont été utilisés pour l'encapsulation cellulaire. ^7,18 accordabilité haut de réseaux d'hydrogel de PEG offre une flexible et contrôlable microenvironnement 3D pour étudier la survie cellulaire et l'activité, tandis que l'utilisation de la protéase sensible séquence peptidique fournit un moyen doux pour la récupération des constructions cellulaires formés naturellement au sein des hydrogels. Dans ce protocole, nous utilisons l'étape de croissance photopolymérisée thiol-ène hydrogels fabriqués en utilisant 4-bras PEG-norbornène (PEG4NB) et un agent de réticulation sensible à la chymotrypsine peptide (CGGY ↓ C) pour l'encapsulation de cellules β min6. Ce protocole élabore systématiquement des techniques pour étudier la formation de survie, la prolifération et l'ellipsoïde de min6β-cellules dans thiol-ène hydrogels. Nous avons en outre fournir une méthode pour β-cellule de récupération sphéroïde et la caractérisation biologique des sphéroïdes récupérés.

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Protocole

A. Macromère et Peptide Synthesis

1. Synthétiser 4-bras PEG-norbornène (PEG4NB) et arylphosphanate Lithium photoinitiateur (LAP) en utilisant des protocoles établis. ^18,19
2. Synthétiser les bis-cystéine contenant chymotrypsine sensible peptide C CGGY ↓ (flèche indique le site clivage par la chymotrypsine) en utilisant la norme de synthèse peptidique en phase solide dans un synthétiseur de peptides à micro-ondes (CEM Discover SPS).
   1. Calculer la quantité de résine (Rink-amide résine MBHA) nécessaire en fonction du taux de substitution de la résine et de l'échelle de synthèse. Gonfler la résine dans le diméthylformamide (DMF) dans un récipient de réaction (RV) pendant 15 min.
   2. Enlever groupe protecteur Fmoc de la résine à l'aide d'une solution de déprotection contenant 20% de pipéridine et 0,1 M dans le DMF HOBt. Utilisez les paramètres répertoriés dans le tableau ci-dessous pour micro-ondes assistée par déprotection Fmoc-(pour tous les acides aminés Fmoc-):

      Échelle de synthèse	0,1 mmole	0,2 mmole
      Puissance	20 W	50 W
      Température	75 ° C	75 ° C
      Temps	3 min	3 min

   3. Après déprotection, laver la résine avec du DMF et effectuer un test à la ninhydrine pour confirmer la suppression de Fmoc (exposition d'amine N-terminal). Résine doit virer au bleu au bout de 2 min à 95 ° C.
   4. Après déprotection, le premier couple de succès Fmoc-aminoacide à l'extrémité C-terminale (C va de synthèse à extrémité N-terminale) dans une solution de base activateur (0,28 M diisopropyléthylamine (DIEA) dans du DMF) avec les paramètres indiqués dans le tableau ci-dessous .

      Échelle de synthèse	0,1 mmole	0,2 mmole
      Puissance	20 W	50 W
      * Température	75 ° C	75 ° C
      * Temps	5 min	5 min

      
      * Pour les kystes et Son, utilisez 50 ° C et 10 min pour réduire la racémisation.
   5. Rincer la résine et effectuer un test à la ninhydrine qualitativement confirmer la fin de l'accouplement (disparition de amine N-terminal). Résine doit être clair au bout de 5 min à 95 ° C. Répétez l'étape d'accouplement (A.2.d) si le test à la ninhydrine renvoie un résultat positif (couleur bleue).
   6. Déprotection de répétition (étape A.2.b) et le couplage (étape A.2.d) pour d'autres acides aminés dans la séquence se terminant par une étape de déprotection finale.
   7. Égoutter le RV, rincer la résine avec 25 ml de dichlorométhane (DCM). Cette étape a pour rincer le DMF, qui est une base et empêchera clivage du peptide.
   8. Préparer cocktail de clivage en mélangeant 250 mphénol dans 4,75 ml d'acide trifluoroacétique (TFA), 0,125 ml triisopropylsilane (TIS) et 0,125 ml ddH ₂ O. g
   9. Ajouter la solution de clivage dans le RV et s'attachera pendant 30 min dans le synthétiseur de peptides à micro-ondes (puissance = 20 W; Température = 38 ° C).
   10. Recueillir la solution de peptide dans un tube à centrifuger de 50 ml à l'aide distributeur de vide.
   11. Peptide précipité clivée dans 40 ml d'éther, vortex le tube et centrifuger à 3000 tours par minute pendant 5 minutes pour recueillir le peptide.
   12. Vider le surnageant et répéter A.2.k étape deux fois.
   13. Recueillir et sécher peptide dans le vide.
   14. Purifier le peptide par HPLC et le caractériser par spectrométrie de masse.

Préparation et stérilisation Matériel B.

1. Préparer une solution à 20% en poids dans du PBS PEG4NB, vortex le mélange jusqu'à ce que le macromère se dissout complètement, et la stérilisation de la solution de macromère à l'aide d'un filtre seringue. Conserver la solution stérilisée à -20 ° C (préparer des aliquotespour stockage à long terme).
2. Préparer et stériliser 2% en poids de photo-initiateur (LAP) en solution dans du PBS. Conserver la solution stérilisée à la température ambiante abri de la lumière.
3. Dissoudre le peptide (CGGYC) dans du PBS, vortex le mélange et la seringue, filtrer la solution pour la stérilisation. Aliquote de la solution de peptide et conserver à -20 ° C jusqu'à utilisation (éviter les cycles gel-dégel).
4. Déterminer thiol (-SH) de concentration dans la solution de peptide préparé en utilisant le réactif d'Ellman (suivre le protocole du fabricant). Cette étape donne une concentration peptidique exacte (c'est-[SH] / 2) qui est nécessaire pour le calcul de la quantité de peptide à utiliser dans thiol-ène-clic réactions photo.
5. Préparer les moules de gélification en coupant la partie supérieure hors de seringues de 1 ml stériles jetables en utilisant une lame de rasoir (bout ouvert pour le retrait gel). Stériliser les seringues moules par autoclave.
6. Sur la base de la formulation de gel désirée (thiol ratio ène = 1) et les concentrations de compagnon de stockriaux, calculer le volume nécessaire de polymère, un agent de réticulation peptide, photo-initiateur, et des solutions tampons nécessaires.

Préparation des cellules C.

1. Equilibrer milieu de culture cellulaire (taux élevé de glucose DMEM contenant 10% de sérum de veau foetal; antibiotique-antimycotique avec 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine, 250 ng / ml Fungizone, et 50 uM β-mercaptoéthanol), solution saline équilibrée de Hank ( HBSS, Ca ^{2 +,} Mg ^{2 +} libre) et de trypsine-EDTA à 37 ° C.
2. Retirer flacons contenant min6 β-cellules de CO ₂ incubateur et placer les fioles dans la hotte à flux laminaire.
3. Aspirer milieux de culture cellulaire à partir des flacons et rincer la cellule avec du HBSS.
4. Trypsiniser les cellules en utilisant 3 ml de 2X (0,1%) de trypsine-EDTA et incuber les flacons de 4 min à 37 ° C et 5% de CO _2.
   • Remarque: Utilisez une solution de trypsine 2X permet la dissociation complète des min6 β-cellules en suspension cellulaire unique.
5. Après incubation, appuyez sur les flacons sont placés sur la surface du capot doucement pour détacher complètement les cellules. Confirmer le détachement et la dissociation des cellules à l'aide d'un microscope.
6. Ajouter un volume égal de milieu de culture cellulaire pour neutraliser la trypsine. Mélanger la solution ainsi par pipetage doux, puis transférer le mélange dans un tube canonique et centrifugation pendant 5 min à 1.000 rpm.
7. Aspirer le surnageant et remettre en suspension délicatement les cellules de 4 à 5 ml de milieu de culture.
8. Déterminer la densité cellulaire en utilisant 50% de bleu trypan tampon dans un hémocytomètre.

Fabrication d'hydrogel et D. Encapsulation Cellulaire

1. Une fois que les cellules sont prêtes, mélanger (basé sur un thiol 1:1 à taux ène) les volumes nécessaires de PEG4NB, CGGYC, LAP, la solution de la cellule, et HBSS dans un tube à centrifuger.
2. Mélanger doucement la solution à l'aide d'une pipette pour obtenir un mélange homogène et ajouter 25 ul de la solution obtenue dans un moule seringue. Exposer la seringue à la lumière UV (365nm, 5 mW / cm ²⁾ pendant 2 min.
3. Photopolymérisation suivant, gels plonger dans une solution stérile de 24 puits plaque de milieu de culture cellulaire contenant et laisser incuber les hydrogels à 37 ° C et 5% de CO _2.
4. Laver les hydrogels cellules chargées dans un milieu de culture cellulaire pendant 30 min à rincer les cellules faiblement attachées et non-réticulés macromères. Transférez les gels dans un milieu frais.
5. Actualiser les médias de culture cellulaire tous les 2 à 3 jours.

Essai E. Viabilité cellulaire

La morphologie des cellules encapsulées peuvent être observés à l'aide microscope optique (depuis les hydrogels synthétisés sont transparentes). La viabilité des cellules peut être visualisée et mesurée qualitativement en utilisant Live / Dead coloration et quantitativement en utilisant le réactif alamarBlue.

E.1. Live / Dead coloration

1. Décongeler réactifs de coloration Live / Dead à la température ambiante.
2. Dans un tube canonique ajouter PBS en fonction du nombre d'échantillons (n) à teindre:
   volume total de PBS = n × 500 pi
3. Pipeter 0,25 ul de calcéine AM et 2 pi de EthD-1 par 1 ml de PBS au tube canonique contenant du PBS. Vortex de la solution pour mélanger les composants.
4. Incuber les cellules chargées des hydrogels dans une solution de coloration Live / Dead (0,5 ml / échantillon) pendant 1 heure à température ambiante sur un agitateur orbital.
5. En utilisant une pipette Pasteur, enlever la solution de colorant et rincer l'échantillon deux fois avec du PBS.
6. Placer l'échantillon sur une lamelle ou lame de verre. Observer et cellules d'image à l'aide d'un microscope confocal.

E.2. AlamarBlue Assay

1. Préparer 10 v / v% alamarBlue solution dans un milieu de culture cellulaire.
2. Supprimer les hydrogels de l'incubateur et aspirer le support sur chaque puits sans aucun contact avec l'hydrogel.
3. Incuber les cellules chargées des hydrogels et un vide (témoin négatif) puits dans 500 ul d'une solution alamarBlue 10% pendant 16 heures.
4. Après l'incubation, pipette 200 ulde la solution alamarBlue dans une plaque de 96 puits et la fluorescence mesure en utilisant un lecteur de microplaques (excitation: 560 nm, émission: 590 nm).
   • L'activité métabolique cellulaire plus élevé réduit le colorant de donner plus de lecture de fluorescence.
   • Assurez-vous d'inclure au moins deux puits de solution alamarBlue 10% de blancs. En analysant les données, il faut soustraire la valeur à blanc de fluorescence moyenne de la lecture de la fluorescence des échantillons.

F. chymotrypsine Médiation érosion du gel et de récupération Sphéroïde

1. Préparez 1 mg / ml de trypsine sans α-chymotrypsine solution dans HBBS et filtre stérile la solution.
2. Incuber hydrogels en solution chymotrypsine (500 ul pour chaque gel) à température ambiante sous agitation lente jusqu'à ce que l'érosion gel complet est réalisé.
   • Pour un gel 25 pi, le temps d'érosion complète est d'environ 5 min.
3. Placer la plaque sur la glace pendant quelques minutes pour réduire l'activité dechymotrypsine.
4. Transférer la solution de cellules dans 1 ml tube et centrifuger à 300 rpm, 4 ° C pendant 2 min.
5. Retirez délicatement le surnageant à l'aide d'une pipette pâturages et doucement remettre en suspension les sphéroïdes dans du HBSS.
6. Transférer la solution récupérée sphéroïde à une plaque de 24 puits et placer la plaque sur la glace pour permettre aux sphéroïdes de s'installer.
7. Pour l'analyse de la taille, d'acquérir des images à contraste de phase des sphéroïdes installés à l'aide d'un microscope optique. Mesure récupéré diamètres sphéroïdes aide de logiciels comme élément du logiciel Nikon ou ImageJ.

G. Essai fonctionnel des sphéroïdes récupérés

G.1. Sécrétion d'insuline stimulée par le glucose dans les cellules sphéroïdes récupérés

1. Dans une plaque 24 puits, incuber les gels dans 500 ul de 2 mM de glucose bas Bordures tampon Ringer (KRB) pendant 1 heure.
2. Erode le gel et récupérer sphéroïdes de cellules en utilisant les étapes F.1 à F.6.
3. Aspirer le surnageant attentivement sans faire aucuncontact avec les sphéroïdes de cellules et remettre en suspension les sphéroïdes dans 500 ul de 2 mM de glucose KRB bas.
4. Transférer 100 ul de cellules sphéroïdes solution dans un tube de 0,6 ml et le placer sur la glace pour l'ATP intracellulaire quantification.
5. Diviser la solution restante de la pile sphéroïde en deux (dans deux tubes à centrifuger) et centrifuger pendant 2 min à 300 rpm et 4 ° C.
6. Aspirer le surnageant (presque jusqu'au fond) et remettre en suspension la première moitié de sphéroïdes de cellules dans 1 ml de 25 mM de glucose à haute KRB et la seconde moitié dans 1 ml de 2 mM de glucose KRB bas.
7. Doucement pipette et transférer la solution contenant des sphéroïdes de cellules récupérées sur une plaque de 24 puits. Incuber la plaque pendant 1 heure à 37 ° C et 5% de CO _2.
8. Après l'incubation, transférer la solution dans un tube à centrifuger et centrifuger 2 min à 1000 rpm et 4 ° C.
9. Transférer 500 pl du surnageant du tube centrifugé à un autre microtube et conserver à 4 ° C pour l'insulineELISA.
10. Effectuer protocole d'insuline ELISA constructeur suivante.

G.2. CellTiter Glo Assay

1. Normes ATP: Préparer une solution 10 uM d'ATP et d'effectuer des dilutions en série pour obtenir une série de 8 solutions standard.
2. Pour un blanc plaque de 96 puits, ajouter 50 ul de solution sphéroïde cellule (de l'étape G.1.6) et les normes.
3. Pour chacun des échantillons contenant bien et les normes, ajouter 50 ul de réactif CellTiter Glo et incuber à température ambiante pendant 15 min.
4. Après l'incubation, le nombre de luminescence mesure des échantillons et des étalons en utilisant un lecteur de microplaques et calibrer l'échantillon concentrations d'ATP en utilisant une courbe de régression linéaire générée par les normes ATP.
5. Déterminer la concentration totale d'ATP dans l'échantillon et multiplier par le facteur de dilution de l'échantillon pour obtenir la concentration intracellulaire d'ATP dans une cellule chargée de l'hydrogel.

G.3. Déterminer la sécrétion d'insuline

1. Calculer l'amount d'insuline sécrétée à partir des sphéroïdes récupérés en prenant le rapport de la quantité d'insuline sécrétée dans le milieu de glucose élevé de la quantité d'insuline sécrétée dans le milieu de glucose faible.
2. Normaliser la teneur en insuline quantifiés de sphéroïdes de cellules avec une quantité correspondante d'ATP intracellulaire des sphéroïdes de cellules récupérées.

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Résultats

Les figures 1-4 montrent des résultats représentatifs pour l'encapsulation, la survie, la prolifération, la formation sphéroïde, et la récupération sphéroïde dans thiol-ène hydrogels. Figure 1 montre le schéma de réaction (1) étape de croissance de thiol-ène photopolymérisation utilisant PEG4NB et CGGYC, et ( 2) L'érosion chymotrypsine gel de médiation qui suit un mécanisme de l'érosion de surface. figures 2 et 3 pr?...

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Discussion

Le protocole décrit présente des détails sur l'encapsulation de cellules dans facile thiol-ène hydrogels formés par l'étape de croissance de photopolymérisation. Alors qu'un rapport stoechiométrique de 1:1 de norbornène à fonctions thiols a été utilisé dans ce protocole, le ratio peut être ajusté en fonction des expériences. En plus d'une formulation correcte, il est important de maintenir l'homogénéité de la solution de pré-polymère. En particulier, utiliser un léger pipetage p...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
4-bras PEG (20 kDa)	Jenkem Technology USA	4ARM-PEG-20K
Fmoc-aminoacides	Anaspec
Live / Dead kit viabilité cellulaire	Invitrogen	L3224	Comprend calcéine AM et éthidium homodimère-1
Réactif alamarBlue	AbD Serotec	BUF012
CellTiter Glo réactif	Promega	G7570
DPBS	Lonza	17-512F	Sans Ca +2 et Mg +2
HBSS	Lonza	10547F	SansCa +2 et Mg +2
Glycémie élevée DMEM	Hyclone	SH30243.01
FBS	Gibco	16000-044
Antibiotique-antimycotique	Invitrogen	15240-062
β-mercaptoéthanol	Sigma-Aldrich	M7522-100ML
Trypsine-EDTA	Invitrogen	15400-054
Trypsine sans α-chymotrypsine	Worthington Biochemical Corp	LS001432
Souris Inusin kit ELISA	Mercodia	10-1247-01
1 ml Seringue jetable	BD biosciences