단계 성장 PEG-펩타이드 Hydrogels에서 β-세포 Spheroids의 생성 및 복구

요약

다음 프로토콜은 thiol - 에너지 사진을 클릭 반응에 의해 형성 단계 성장 PEG-펩타이드 hydrogels에서 췌장 β-세포를 캡슐화에 대한 기술을 제공합니다. 이 물질 플랫폼은 세포 캡슐화에 대한 cytocompatible microenvironment를 제공뿐만 아니라 hydrogels 내에 형성된 세포 구조의 사용자 관리 빠른 복구를 허용합니다뿐만 아니라.

초록

Hydrogels는 배양 therapeutically 관련성이 높은 셀이나 조직에 탄력과 높은 투자율 조직과 같은과 3 차원 microenvironment를 제공 친수성 ​​가교 폴리머입니다. 폴리 (에틸렌 글리콜) (PEG) 파생 상품에서 준비 Hydrogels는 점점 자신의 조정할 수 있으며 cytocompatible 특성으로 인해 부분적으로 조직 공학 응용 프로그램의 다양한 사용됩니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 췌장 MIN6 B-세포를 캡슐화에 대한 PEG-펩타이드 hydrogels를 조작하는 thiol - 에너지 스텝 성장 photopolymerizations를 활용. 젤은 4 - 팔 PEG-norbornene (PEG4NB) macromer과 키모 트립신에 민감한 펩타이드 crosslinker (CGGYC)에 의해 형성되었다. PEG의 친수성과 비 오염 자연은, 3D로 세포 생존과 증식을위한 cytocompatible microenvironment를 제공하며 키모 트립신에 민감한 펩타이드 시퀀스 (의 사용 C GGY ↓ C, 화살표 효소 절단 사이트를 나타냅니다 반면, 터미널 낭종나란히 잔류)가 thiol-에너지의 crosslinking에 추가 된 히드로 겔 내에서 형성 세포 구조의 급속한 복구를 할 수 있습니다. 다음 프로토콜에 대한 기술을 elaborates : thiol-에너지 hydrogels에 MIN6 β-세포의 (1) 봉지 (2) 질적 및 양적 세포 생존 능력의 assays는 세포 생존과 증식을 결정하기 위해, (3) 세포 spheroids의 복구 키모 트립신로 인한 젤을 사용하여 침식 및 복구 spheroids (4) 구조 및 기능 분석.

서문

Hydrogels는. 수리 및 재생 조직을위한 발판 재료 등의 뛰어난 잠재력을 지닌 친수성 가교 중합체 hydrogels ^1-3 높은 물 콘텐츠는 산소와 세포 생존 능력을 유지하는데 중요한 역할을하는 다양한 영양소와 세포의 신진 대사 제품의 교환을 쉽게 확산을 할 수 있습니다. 또한, hydrogels는 제어 자료와 높은 tunability 인해 세포 제공을위한 훌륭한 캐리어입니다. 같은 폴리 (에틸렌 글리콜) (PEG)에서 준비 것과 ^같은이 합성 hydrogels가 점점 더 크게 인해 cytocompatibility에, 조직 공학 응용 분야에 사용되며, 조직 - 재료 물리적, 기계적 성질을에서와 같은 탄성, 높은 tunability. ^4-6

일반적으로 사용되는 히드로 겔 플랫폼이지만, 연구 체인 성장 photopolymerizations에 의해 형성 PEG diacrylate (PEGDA) hydrogels는 캡슐화 세포에게 duri을 손상하는 경향이 있습니다 것으로 나타났습니다NG 네트워크 crosslinking 및 현장 세포 캡슐화 인치 ⁷ 세포의 손상은 크게 hydrogels에 crosslink 폴리머 체인에 PEGDA에 비닐 그룹을 통해 전달 photoinitiator 분자에 의해 생성 된 라디칼 종에 기인했다. 불행하게도, 이러한 급진적 인 종은 특히 췌장 β-세포와 같은 급진적 인에 민감한 세포에 대해 세포 캡슐화하는 동안 스트레스와 세포 손상을 유발할 수 있습니다. ^8-10은 위해 더 나은 확산 및 세포 생존, 높은 분자량 PEGDA에 대한 높은 메쉬 크기를 얻기 위해 종종 세포 캡슐화하는 데 사용됩니다. 그러나, 중합 반응 속도론을 떨어 뜨리고 하위 최적의 젤 biophysical 속성을 발생합니다. ^7,11,12은 위에서 언급 한 단점 외에도,이 때문에의 이질성과 비 degradable 자연 PEGDA의 hydrogels에서 셀 구조를 복구하는 것은 매우 어렵습니다 가교 네트워크. 단백 분해 효소에 민감한 펩티드는 통합 될 수 있지만효소 절단에 민감한 기타 불활성 PEGDA의 hydrogels을 렌더링하기 위해 PEG macromer 백본으로, 활용은 종종 고가의 시약을 사용하고 그 결과 네트워크는 여전히 인해 체인 성장 중합의 성격에 이질성의 높은 수준을 포함합니다. ^13-15

최근 단계 성장 thiol-에너지의 photopolymerization을 통해 형성 PEG-펩타이드 hydrogels은 체인 성장 photopolymerization에 의해 형성 hydrogels을 통해 세포 캡슐화에 대한 특혜 속성을 전시하기 위해 표시되었습니다. thiol - 에너지 hydrogels ⁷ 우수한 겔화 반응 속도론은 '클릭에 따라 결정됩니다 thiol과 ​​에너지 절약의 기능 사이의 반응의 '자연. PEGDA의 체인 성장 중합에 비해, thiol-에너지 반응이있는 빠른 겔화 속도의 결과. 산소는 ^16,17 Thiol-에너지의 hydrogels도 높은 중합 효율성과 체인 성장 PEGDA hydrogels, ^7에 비해 더 나은 젤 biophysical 속성이 저해됩니다 ^{18 <}/ 저녁을 먹다> 이는 photopolymerization 동안 급진적 인 종으로 인한 제한된 세포의 손상을 발생합니다.

이전 thiol-에너지의 hydrogels 4 - 팔 PEG-norbornene (PEG4NB) macromer과 같은 비스 - 시스테인이 포함 된 펩타이드 crosslinkers에 의해 형성 단백 분해 효소에 민감한 펩티드가 세포 캡슐화에 활용하고 있습니다. PEG의 히드로 겔 네트워크 ^7,18 높은 tunability가 있습니다 세포 생존과 활동을 조사하는 유연하고 제어 3D microenvironment, 단백 분해 효소에 민감한 펩타이드 시퀀스의 사용 hydrogels 내에서 자연적으로 형성 세포 구조의 복구를위한 온난 한 방법을 제공하는 동안. 이 프로토콜에서 우리는 4 팔 PEG-norbornene (PEG4NB)와 MIN6 β-세포의 캡슐화를위한 키모 트립신에 민감한 펩타이드 crosslinker (CGGY ↓ C)를 사용하여 제조 단계 성장 photopolymerized thiol-에너지 hydrogels를 사용합니다. 이 프로토콜은 체계적으로 MIN6의 생존, 증식과 회전 타원체 형성을 공부에 대한 기술을 elaboratesthiol-에너지의 hydrogels의 β-세포. 우리는 더 β-세포 회전 타원체 복구 및 복구 spheroids의 생물학적 특성에 대한 방법을 제공합니다.

프로토콜

A. Macromer 및 펩타이드 합성

1. 기존 프로토콜을 사용하여 4 - 팔 PEG-norbornene (PEG4NB)와 photoinitiator의 리튬 arylphosphanate (랩). ^18,19를 합성
2. 합성 키모 트립신에 민감한 펩타이드를 포함하는 비스 - 시스테인 CGGY ↓ C 전자 펩타이드 합성기 (CEM 디스 SPS)에 표준 고체 상 펩타이드 합성을 사용하여 (화살표가 키모 트립신의 절단 사이트를 나타냅니다).에게
   1. 수지와 합성 규모의 대체 비율에 따라 필요가 있다고 수지 (링크 - 아미드 MBHA 수지)의 양을 계산할 수 있습니다. 15 분의 반응 용기 (RV)에 dimethylformamide (DMF)의 수지 그랬군요.
   2. 제거 Fmoc-보호 20 % 피 페리 딘과 DMF의 0.1 M HOBt를 포함하는 deprotection 솔루션을 사용하여 수지에서 그룹을. 전자 레인지를 이용한 Fmoc-deprotection (모든 Fmoc-아미노산)을 아래의 표에 나와있는 매개 변수를 사용하여 :

      합성 규모	0.1 mmole	0.2 mmole
      힘	20 W	50 W
      온도	75 ° C	75 ° C
      시간	3 분	3 분

   3. deprotection 후, DMF와 수지를 씻어 Fmoc (N-터미널 아민의 노출)의 제거를 확인 닌 하이 드린으로 테스트를 수행합니다. 수지는 95 ° C.에서 2 분 후 파란색으로 설정해야합니다
   4. 성공 deprotection, 몇은 아래 표에 나와있는 매개 변수를 활성화 기반 솔루션의 C-말단 (합성 최신작 N-말단 C-로 실행) (DMF의 0.28 M Diisopropylethylamine (DIEA))에서 처음으로 Fmoc-아미노산 후 .

      합성 규모	0.1 mmole	0.2 mmole
      힘	20 W	50 W
      온도 *	75 ° C	75 ° C
      시간 *	5 분	5 분

      
      * 낭종와 그의를 들어, 50 ° C, 10 분 racemization을 줄일 수를 사용합니다.
   5. 수지 씻어 질적 커플 링의 완료를 (N-터미널 아민의 실종에) 확인 닌 하이 드린으로 테스트를 수행합니다. 수지가 95시 5 분 이후에 명확하게해야 ° C. 닌 하이 드린 테스트 긍정적 인 결과 (파란색)을 반환하면 커플 링 단계 (A.2.d)를 반복합니다.
   6. 최종 deprotection 단계로 끝나는 순서에 추가 아미노산에 대한 반복 deprotection (단계 A.2.b)와 커플 링 (단계 A.2.d).
   7. , RV를 배출 dichloromethane의 25 ML (DCM)와 수지를 씻어. 이 단계는 기본이며, 펩타이드 절단을 저해 할 DMF를 씻어 내 버리지하는 것입니다.
   8. 250m를 혼합하여 절단 칵테일을 준비4.75 ML Trifluoroacetic 산 (TFA), 0.125 ML Triisopropylsilane (TIS)과 0.125 ML ddH ₂ O.에서 페놀 g
   9. 전자 펩타이드 합성기의 30 분의 RV와 다니엘로 절단 솔루션을 추가 (전원 = 20 W, 온도 = 38 ° C).
   10. 진공 매니 폴드를 사용하여 50 ML의 원심 분리기 튜브의 펩타이드 솔루션을 수집합니다.
   11. 에테르의 40 ML에 침전물 흘리고 펩타이드, 소용돌이가 5 분 3,000 RPM에서 튜브와 원심 분리기는 펩타이드를 수집합니다.
   12. 표면에 뜨는을 배출하고 단계 A.2.k을 두 번 반복합니다.
   13. 수집 및 진공의 펩타이드를 건조.
   14. HPLC를 사용하여 펩타이드를 정화하고 질량 분광법으로 특성화한다.

B. 재료 준비 및 살균

1. macromer가 완전히 해소 될 때까지 PBS, 소용돌이 혼합물에서 20 중량 %의 PEG4NB 솔루션을 준비하고, 주사기 필터를 사용하여 macromer 솔루션을 소독. -20 ° C (준비 aliquots에서 살균 솔루션을 저장장기 저장을위한).
2. PBS 2 중량 %의 photoinitiator (랩) 솔루션을 준비하고 소독. 빛으로부터 보호 상온에서 살균 솔루션을 저장합니다.
3. PBS의 펩타이드 (CGGYC), 혼합물과 주사기는 살균을위한 솔루션을 필터링 소용돌이를 해산. 나누어지는 -20 ° C에서 펩타이드 솔루션과 상점까지 (냉동 해동 사이클을 방지)을 사용합니다.
4. thiol (-SH) Ellman의 시약을 사용하여 준비된 펩타이드 솔루션의 농도를 (제조업체의 프로토콜을 따라) 확인합니다. 이 단계는 thiol-에너지 사진 클릭 반응에 사용되는 펩타이드 금액을 계산에 필요한되는 (즉, [SH] / 2) 정확한 펩타이드 농도를 제공합니다.
5. 면도날 (젤 제거를 위해 오픈 팁)를 사용하여 멸균 한 일회용 주사기 ML의 상단 부분을 잘라내하여 겔화 금형을 준비합니다. 압력솥에 의해 주사기의 금형을 살균.
6. 원하는 겔 제제 (에너지 비율 = 1 thiol) 및 재고 메이트의 농도에 따라rials는 폴리머의 필요한 볼륨, 펩타이드 crosslinker, photoinitiator 및 필요한 버퍼 솔루션을 계산합니다.

C. 셀 준비

1. 행크의 균형 소금 솔루션 (세포 배양 매체 (; 100 U / ML 페니실린, 100 μg / ML 스트렙토 마이신, 250 NG / ML Fungizone와 항생제 - Antimycotic 50 μM β-메르 캅토 에탄올 높은 포도당 DMEM 10 % 태아 소 혈청을 포함)을 평형 37 HBSS, 칼슘 ^{2 +,} MG ^{2 +} 무료) 및 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) ° C.
2. CO ₂ 인큐베이터에서 MIN6 β-세포를 포함하는 플라스크를 제거하고 층류 후드에 플라스크를 배치합니다.
3. 플라스크에서 세포 배양 미디어를 대기음하고 HBSS와 세포를 씻어.
4. 2X 3 ML (0.1 %) 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 사용하여 세포를 Trypsinize 37시 4 분에 플라스크를 길러 ° C 5 % CO _2.
   • 참고 : 사용 2X 트립신 솔루션은 단일 세포 현탁액에 MIN6 β-세포의 완전한 분리 할 수​​ 있습니다.
5. 부화 후, 완전히 세포를 분리 부드럽게 후드의 표면에 플라스크를 누릅니다. 현미경을 사용하여 세포의 분리와 분리를 확인합니다.
6. 트립신을 중화하기 위해 세포 배양 매체의 동일한 볼륨을 추가합니다. 부드러운 pipetting으로 잘 솔루션을 혼합 한 후 1,000 rpm으로 5 분을위한 표준 튜브와 원심 분리기로 혼합물을 전송합니다.
7. 표면에 뜨는을 대기음 부드럽게 4 셀을 다시 일시 중지 - 문화 매체의 5 ML 있습니다.
8. hemocytometer에서 50 % Trypan 파랑 버퍼를 사용하여 세포 밀도를 결정합니다.

D.의 히드로 겔 제조 및 세포 캡슐화

1. 세포 준비가되면, 혼합 (에너지 비율 1:1 thiol 기준) PEG4NB, CGGYC, 무릎, 셀 솔루션 및 microcentrifuge 관 HBSS의 필요 권.
2. 부드럽게 균일 한 혼합을 받아 주사기 금형에 대한 결과 솔루션의 25 μl를 추가하는 피펫을 사용하여 솔루션을 섞는다. UV 빛 (365에 주사기를 노출나노 미터, 2 분 5 MW / cm ^2).
3. 다음 photopolymerization, 멸균 24 잘 플레이트가 포함 된 세포 배양 매체에 빠지게 젤 37에 hydrogels을 길러 ° C 5 % CO _2.
4. 30 느슨하게 연결된 세포를 씻어하는 분을 취소 - 가교 macromers을위한 세포 배양 매체의 셀을이고 hydrogels을 씻는다. 신선한 중간에 젤을 전송합니다.
5. 새로 고침 세포 배양 매체는 모든 2~3일.

E. 세포 생존 능력 분석

캡슐화 된 세포 형태는 (합성 hydrogels 투명 때문에) 빛 현미경을 사용하여 관찰 할 수 있습니다. 세포 생존 능력은 시각화와 죽은 / 라이브 착색을 사용하고 양적 AlamarBlue 시약을 사용하여 질적 측정 할 수 있습니다.

E.1. 죽은 / 라이브 착색

1. 실온에서 죽은 / 라이브 착색의 시약을 해동.
2. 표준 관에서 스테인드 할 샘플의 수 (N)에 따라 PBS를 추가 할 :
   PBS = n의> 총 판매량 × 500 μl
3. Calcein AM 및 PBS를 포함하는 표준 관에 PBS 1 ML 당 EthD-1 2​​ μl의 피펫 0.25 μl. 구성 요소를 혼합하는 소용돌이 솔루션입니다.
4. 궤도 셰이커에 실온에서 1 시간에 라이브 / 데드 착색 솔루션에서 셀을이고 hydrogels을 (0.5 ML / 샘플) 품다.
5. 파스퇴르 피펫을 사용하여 염료 용액을 제거하고 PBS로 두 번 샘플을 씻어.
6. 커버 슬립 또는 유리 슬라이드에 샘플을 배치합니다. 관찰하고 공 촛점 현미경을 사용하여 이미지 셀.

E.2. AlamarBlue 분석

1. 10 V / 세포 배양 매체에서 V의 % AlamarBlue 솔루션을 준비합니다.
2. 보육에서 hydrogels를 제거하고 히드로 겔과 접촉하지 않고 각 좋지 미디어를 대기음.
3. 16 시간 10 % AlamarBlue 솔루션 500 μl에 세포 라덴 hydrogels하고 빈도 (대조군)을 품다.
4. 피펫 200 μl는 부화에 따라microplate 리더를 (: 560 nm의, 방출 : 590 nm의 여기)를 사용하여 96 잘 플레이트와 측정 형광의 AlamarBlue 솔루션.
   • 높은 세포 신진 대사 활동은 높은 형광 읽기를 제공 할 수있는 염료를 줄일 수 있습니다.
   • 빈 칸을 10 %로 Alamarblue 솔루션의 적어도 두 개의 우물을 포함해야합니다. 데이터를 분석 할 때 시료의 형광 읽기에서 평균 빈 형광 값을 뺍니다.

F. 키모 트립신은 젤의 침식 작용, 그리고 회전 타원체 복구를 매개

1. HBBS과 살균 필터 솔루션 트립신 무료 α-키모 트립신 솔루션의 1 MG / ML을 준비합니다.
2. 전체 겔 침식이 달성 될 때까지 부드러운 진동과 실온에서 키모 트립신 솔루션의 hydrogels (각 젤 500 μl)을 품다.
   • 25 μl 젤를 들어, 전체 침식을위한 시간은 약 5 분입니다.
3. 의 활동을 줄이기 위해 몇 분 동안 얼음에 판을 놓고키모 트립신.
4. 2 분 300 rpm에서 1 ML 튜브와 원심 분리기의 셀 솔루션, 4 ° C를 전송합니다.
5. 조심스럽게 목초지 피펫을 사용하여 표면에 뜨는을 제거하고 부드럽게 HBSS에 spheroids을 resuspend.
6. 24 잘 판에 복구 회전 타원체 솔루션을 전송하고 spheroids이 정착 할 수 있도록 얼음에 판을 놓습니다.
7. 크기 분석을 위해, 밝은 현미경을 사용하여 해결 spheroids의 위상 콘트라스트 이미지를 획득. 측정은 니콘 요소 소프트웨어 또는 ImageJ와 같은 소프트웨어를 사용하여 회전 타원체 직경을 복구했습니다.

복구 Spheroids의 G. 기능 분석

G.1. 복구 세포 spheroids에서 포도당 자극 인슐린 분비

1. 24 잘 플레이트에서 1 시간 2 MM 낮은 포도당 Kerbs 치기 버퍼 (KRB) 500 μl에 젤을 품다.
2. 젤을 침식하고 F.6에 단계 F.1를 사용하여 셀 spheroids를 복구합니다.
3. 을하지 않고 조심스럽게 표면에 뜨는을 대기음셀 spheroids 연락, 2 MM 낮은 포도당 KRB 500 μl에 spheroids을 resuspend.
4. 0.6 ML 튜브에 세포 spheroids 솔루션 100 μl를 전송하고 세포 내 ATP의 정량화를 위해 얼음에 배치.
5. 반으로 나머지 셀 회전 타원체 솔루션을 (두 microcentrifuge 튜브에) 분할, 300 RPM과 4에서 2 분 동안 원심 분리기 ° C.
6. 기음 표면에 뜨는 (거의 아래로)와 2 MM 낮은 포도당 KRB의 1 ML 25 MM 높은 포도당 KRB와 하반기 1 ML에 셀 spheroids의 첫 번째 절반을 resuspend.
7. 부드럽게 24 잘 판에 복구 셀 spheroids를 포함하는 솔루션을 피펫 및 전송할 수 있습니다. 37 1 시간에 판을 길러 ° C 5 % CO _2.
8. 부화 후, 2 천 rpm으로 분, 4 ° C.에 대한 microcentrifuge 튜브와 원심 분리기에 솔루션을 전송
9. 인슐린에 대해 4에서 다른 microcentrifuge 튜브 및 매장 ° C로 centrifuged 관에서 표면에 뜨는 500 μl를 전송엘리사.
10. 인슐린 엘리사 다음과 같은 제조업체의 프로토콜을 수행합니다.

G.2. CellTiter 형광 분석

1. ATP 기준 : 10 μM ATP 솔루션을 준비 8 표준 솔루션 시리즈를 얻기 위해 시리얼 dilutions을 수행합니다.
2. 흰색 96 잘 판에, 50 셀 회전 타원체 솔루션의 μl (단계 G.1.6에서)과 기준을 추가 할 수 있습니다.
3. 각 잘 포함 된 샘플과 표준, CellTiter 형광 시약의 5​​0 μl를 추가하고 15 분 동안 실온에서 알을 품다.
4. 다음 부화, microplate 리더와 ATP 표준에 의해 생성 된 선형 회귀 곡선을 사용하여 보정 샘플 ATP 농도를 사용하여 샘​​플 및 기준의 측정 발광 카운트.
5. 샘플의 총 ATP 농도를 결정하고 한 칸을이고있는 히드로 겔에 세포 ATP 농도를 얻기 위해 샘플 희석 비율로 곱하면됩니다.

G.3. 인슐린 분비를 결정

1. amou을 계산인슐린 NT는 낮은 포도당 매체에 분비 인슐린의 양으로 높은 포도당 매체에 분비 인슐린의 양의 비율을 이용해 복구 spheroids에서 분비.
2. 복구 세포 spheroids의 세포 내 ATP의 각 양 세포 spheroids의 정량 인슐린 컨텐츠를 정상화.

결과

그림 캡슐화, 생존, 증식, 회전 타원체 형성, thiol-에너지의 hydrogels의 회전 타원체 복구를 위해 1-4 표시 대표 결과입니다. 그림 1은 PEG4NB과 CGGYC를 사용하여 (1) 단계 성장 thiol-에너지의 photopolymerization의 반응 도식을 보여줍니다, 그리고 ( 표면 침식 메커니즘을 다음과 2) 키모 트립신 매개 젤 침식. 라이브 / 데드 착색 및 AlamarBlue 분석을 사용하여 수득?...

토론

설명 프로토콜은 스텝 성장 photopolymerization에 의해 형성 thiol-에너지의 hydrogels의 셀을 쉽게 캡슐화에 대한 자세한 정보를 제공합니다. thiol 기능 그룹에 norbornene의 1시 1분의 화학 양 론적 비율이 프로토콜에 사용 된 동안의 비율은 실험에 따라 조정할 수 있습니다. 올바른 배합뿐만 아니라, 그것은 사전 고분자 용액에서 동질성을 유지하는 것이 중요합니다. 특히, 겔 속성에서 셀 및 유사 거리며 걷?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
이름	회사	카탈로그 번호	코멘트
4 팔 PEG (20kDa)	Jenkem 기술 USA	4ARM-PEG-20K
Fmoc-아미노산	Anaspec
죽은 / 라이브 세포 생존 키트	Invitrogen	L3224	Calcein AM 및 Ethidium homodimer-1을 포함
AlamarBlue 시약	아브드 Serotec	BUF012
CellTiter 형광 시약	Promega	G7570
DPBS	Lonza	17 512F	칼슘이와 MG 2없이
HBSS	Lonza	10547F	없이칼슘이와 MG 2
높은 포도당 DMEM	Hyclone	SH30243.01
FBS	Gibco	16000-044
항생제 - Antimycotic	Invitrogen	15240-062
β-메르 캅토 에탄올	시그마 - 알드리치	M7522-100ML
트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)	Invitrogen	15400-054
트립신 무료 α-키모 트립신	워싱턴 생물 화학 주식회사	LS001432
마우스 Inusin 엘리사 키트	Mercodia	10-1247-01
한 ML 일회용 주사기	BD biosciences