意識マウスにおける糸球体濾過率の測定のためのハイスループット法

要約

糸球体濾過率（GFR）の測定は、腎機能の評価のための金本位である。ここでは、二相指数関数的減衰モデルで血漿およびGFRの計算に単一のボーラス注射、フルオレセインイソチオシアネートの判定（FITC）-イヌリンを使用して、意識のあるマウスでGFRを決定することができる高スループット方法を説明する。

要約

糸球体濾過率（GFR）の測定は、腎機能の評価の金本位である。現在、研究者らは、内因性のバイオマーカークレアチニンまたは外因適用放射性ラベルされたイヌリン^（3 Hまたは¹⁴ C）のレベルを測定することにより、GFRを決定します。クレアチニンは、全腎クレアチニン排泄の約50％のための近位尿細管分泌アカウント実質的な欠点を持っており、したがって、クレアチニンは、信頼性の高いGFRマーカーではありません。行った実験に応じて、イヌリンクリアランスは、単一の静脈内ボーラス注射または連続注入（静脈内又は浸透圧ミニポンプ）によって決定することができる。両方のアプローチは、それぞれ血漿または血漿および尿の収集を必要とする。放射性ラベルされたイヌリンの他の欠点は、同位体の使い方、動物の時間がかかる手術の準備、および端末実験の要件が含まれています。ここでは、単一のボーラス注射を使用する方法を説明フルオレセインイソチオシアネート（FITC）ラベルイヌリンと希釈血漿中1-2μLでその蛍光を測定する。マウス当たり8血液コレクションを、二コンパートメントモデルを適用することにより、それが特別な作業フローのプロトコルを使用して、1日24までのマウスにおいてGFRを測定することができる。このメソッドは、非拘束と目を覚ましマウスで収集されるすべての血液サンプルとの短いイソフルラン麻酔を必要とします。別の利点は、それが数ヶ月や治療（ すなわち、食生活の変化または薬物アプリケーションと対実験を行う）にわたってマウスに追従することが可能であるということである。我々はGFRを測定するこの手法は、マウス腎機能を研究他の研究者にとって有用であり、そのような血漿クレアチニンと血中尿素窒素などの腎機能を推定する精度の低い方法を置き換えることを願っています。

概要

糸球体のプラズマ限外濾過の生成速度は、腎機能（糸球体濾過率、GFR）を評価するための基礎となっている。 GFRを決定するための理想的なマーカーは自由にも分泌されないか、再吸収と代謝されない、フィルタリングされるべきである。このような挙動は、イヌリンのために真であることが判明した、とイヌリンクリアランスはGFR ³の決定のためのゴールドスタンダードとなっている。クレアチニンのクリアランスを広くヒトおよび動物におけるGFRの尺度として使用されるのに対して、クレアチニン、理想的なGFRマーカーの要件を満たしていない。 10まわり-ヒトにおけるクレアチニンクリアランスの40％が尿細管分泌活性^1,11の結果である、およびクレアチニンの腎分泌はまた、マウスおよびラット^{4、図7、図9、図22}において顕著である。腎機能障害はGFR ^1,2のマーカーとして、その値を制限するクレアチニンの尿細管分泌を増加させることが知られている。我々は以前に、有機アニオントランスアイソフォームを示している3（OAT3）ネズミ腎クレアチニン分泌²²に貢献しています。しかし、イヌリンクリアランスは通常、放射性ラベルされたイヌリン^（3 Hまたは¹⁴ C）を使用する必要があります。イヌリンの放射能測定は、麻酔と意識の両方のマウスで使用されますが、数多くの安全規制、放射性同位元素の使用に固有の厳格な取り扱いの問題の欠点を抱いてすることができます。これらの線に沿って、GFRを決定するための手術クリアランスの準備には時間がかかるだけでなく、自然の中で、端末である。 1999年にローレンツら ^12は麻酔したマウスの単一ネフロンGFRのマーカーとしてFITC-イヌリンを導入しました。 5年後チーら ¹⁵ FITC-イヌリンを使用することによって意識のマウスにおける全体腎臓GFRを決定した。代替プロトコルは今や意識と麻酔したマウスでGFRを測定する外因性マーカーとしてFITC-イヌリンを使用しています。これらのプロトコルは、蛍光detectiを使用して、放射性イヌリンの感度を維持するで、放射性ラベルマーカーでの作業の欠点を回避。 FITC-イヌリンアッセイは、光度3300 fluorospectrometerの微量の能力を活用するために、他^7,8および私達^22,23によって変更された。これは、GFR測定ごと<100μlの血液に必要な総サンプル量を低減することができる。

方法と本書に提供される高スループットプロトコルでは、我々は一日あたり24意識マウスにでGFRを測定の実現可能性を実証する。この手法は、マウスGFRを勉強し、他の研究者に有用である可能性が、我々はそのようなクレアチニンと血中尿素窒素などの腎機能の指標としてはあまり正確な方法を置き換えることを願っています。

プロトコル

1。ソリューション

1. 0.85％塩化ナトリウム：8.5グラムのNaCl / 1リットルのddH ₂ O（8.5グラム/ L）。
2. 0.5モル/ L pH7.4のHEPES（のddH _{2 O}を0.5 LのHEPESの59.6グラムを溶解し、10 N NaOHを用いてpHを7.4に調整）。

2。 FITC-イヌリン注射液の調製

1. 完全に溶解するまで90℃に加熱して0.85％のNaCl（通常100ミリグラム/ 2ミリリットル0.85％のNaCl）中の5％溶液を調製し、溶解するためFITC-イヌリンを量る。
2. 溶解したFITC-イヌリンソリューションとノートの重量を量る。
3. 透析膜の20センチ部分（分子量カットオフ：1,000）をカットし、30分間膜から残留のNaN _3を削除し、その後数回フラッシュするのddH ₂ Oに置く。
4. 透析膜にFITC-イヌリンを溶解埋めるとクロージャで適切にシールします。
5. 全体の透析膜重量を量る。
6. 1 L 0.85％NaCl溶液で透析膜を入れて、ROで24時間光保護ゆっくりかき混ぜるomの温度。
7. 再び全体の透析膜を秤量し、（水が浸透膜と結合していないFITCに移動する、または結合FITC-イヌリン<1,000分子量は、膜の外に移動します、したがって、FITC-イヌリンの濃度が大幅に低下します）新しい濃度​​を計算。
8. 新しいFITC-イヌリン濃度（c）は、以下の式を用いて計算される：C = N / V、ここで、n =初期FITC-イヌリン量、V =新しいボリューム（透析プラス初期の体積前と後の透析チューブの重量差FITC-イヌリンは、ソリューション）。
9. 0.22μmのシリンジフィルターを通して濾過することにより滅菌透析FITC-イヌリン溶液を使用前に。
10. FITC-イヌリン4で光（アルミ箔）から保護しておく℃まで透析とFITC-イヌリン滅菌は、最大2週間使用することができます。 FITC-イヌリンを数分間、90℃で再加熱することにより溶解させることができる参加した。

注：使用している場合透析を必要としないFITC-sinistrin ^16-18、透析に必要なすべてのステップをスキップすることができます。

3。注射や採血

1. 実験の前にマウスの体重（BW）を取る。
2. イソフルランで簡単にマウスを麻酔。
3. 6マウスの高スループットについては、図3に示すプロトコルに従ってください。
4. 針でG30½を用いて、後眼窩叢²⁴に透析FITC-イヌリンを2μl/ gの体重を注入する（ための針でG30½に切り替え、最初の針でG26½を用いて、100μlのハミルトンシリンジから気泡を除去し、注射）。
5. のNa-ヘパリンminicapillariesで注入後56〜75分、35、15、10、一度はさみでマウスの尾の1ミリメートルをカットし、3時に血を集める、5、7。チャアムシール付採血後にシールminicapillaries。
6. サンプルは光から保護しておく。
7. 密封されたminicapillaries内部造血を入れクリティカル毛細血管と5分間遠心する。
8. 0.2ミリリットルチューブにピペッティングによりダイヤモンドカッター、転送全体のプラズマを用いてminicapillariesを破る。
9. 新しい0.2ミリリットルチューブ（サンプルは4℃で一晩保存することができ℃の蛍光測定のために）でプラズマの2μLと18μlの0.5 mol / LのHEPES液（pH7.4）を用いて10倍希釈してください。
10. 重複での光度3300で希釈された試料の2μLを測定します。楽器の説明と使用法は⁵ここで説明されています。

4。規格の調製

1. ヘパリンコーティングされたヘマトクリット毛細管で同じ背景系統のマウスから血液を集め、スピンダウン、0.5 mol / LのHEPES（pH7.4）で1:10に希釈し、通常80μlの血漿+ 720μlのHEPES。
2. 次の標準希釈液を得るために希釈マウスプラズマでFITC-イヌリン注射液を希釈：
   午前1時10分：10μlの希釈していないFITC-イヌリンソリューション+90μlの希釈マウス血漿
   1:100：10＆ムー、L（1:10）ソリューション+90μlの希釈マウス血漿
   1:1,000：10μlの（1:100）ソリューション+90μlの希釈マウス血漿
   1:2,000：30μlの（1:1）ソリューション+30μlの希釈マウス血漿
   1:10,000：10μlの（1:5）ソリューション+40μlの希釈マウス血漿
   1:20,000：20μlの（1:1）水溶液+20μlの希釈マウス血漿
   1:100,000：10μlの（1:5）ソリューション+40μlの希釈マウス血漿
   基準の濃度は、透析に依存しており、常にFITC-イヌリンの各調製のために異なるであろう。これは、新しい標準曲線毎回濃度を入力する必要がある。
3. ここ^15,20に記載した代表的な結果の節に示すように、二相指数関数的減衰関数を使用して、適切なソフトウェア（ 例えばグラフパッドプリズム）でGFRを計算するためにデータを分析する。

結果

GFRは、以下の式を用いて計算される。

GFR = N /（A/K1 + B/K2）、ここで

N =注入量（N = C•V、C = FITC-イヌリン濃度、V =注入量）
=スパン1、除去のy切片
除去のための定数K1 =崩壊
B =スパン2、y切片分布
配布用の定数K2 =崩壊

（注）、K1、BおよびK2はグラフパッドプリズム、二相の指数関数的減衰を分析することのできるすべてのソフトウェアによって与えられている略語を使用することができますが、他の科学的なソフトウェアは、異なる略語を使用する場合があります。

プラズマFITC-イヌリン濃度に基づいて二相指数関数的減衰曲線フィットを採用することにより、 図1に示すものと同等の曲線が得られるべきである。上に示した式（でGFRを計算して、ここにに記載されて<> 20をSUP）1型糖尿病（ 図2）を持つマウスに見られるよう腎機能¹⁵または糸球体過剰ろ過^8、23の障害を検出することができます。

図1。意識のあるマウスでGFRを測定するために、単回静脈内注射後のFITC-イヌリンの血漿中動態が使用される。GFRを計算するために、2つのコンパートメントモデルが採用されている。 2区画モデルでは、初期の急激な減衰相は細胞外液の血管内区画からFITC-イヌリンの再分配を表している。 FITC-イヌリン濃度の遅い減衰との後の段階では、主にプラズマから全身クリアランスを反映している。

図2。 Detectionは、野生型マウスでは糖尿病の過剰濾過の。I型糖尿病は、ストレプトゾトシンを腹腔内アプリケーション（STZ、5日間連続して50 mg / kg）を誘導した。 GFRは、前に（基礎）と5週間糖尿病の誘導後に決定した。尿細管糸球体フィードバックのため、近位の再吸収の主な増加は、早期に糖尿病過剰濾過²¹野生型マウス（n = 10、P <0.01対基底同じマウス）で再現性がある発見を引き起こす。

図3。 6マウスのセットにおけるGFRを測定する。単回ボーラス注入法で全体腎臓GFRを測定するためのフローチャートは 、8血液サンプル10、15、35、56及び75分後、7,3、5 ​​で収集されなければならないFITC-イヌリン噴射。数字は時点を示している。括弧内の数字はサンプル数を示す。赤い縦線の左側の時点では、注射を示す時点（0、11、22、33、44、55分で）。各マウスは、異なる色でマークされています。シーケンシャル血のコレクションを取得するには矢印に従ってください。グレーボックスは次のマウスは注射前にイソフルラン麻酔のために準備しなければならない場合を示している。このプロトコルを使用して別のマウスから2血コレクション間の最小時間は1分です。

ディスカッション

本研究では、二相指数関数的減衰によって8血液サンプル中の蛍光の単一ボーラス注入および分析によって意識のあるマウスでGFRを測定するための技術が記載されている。 1マウスにおけるGFR測定は75分かかります。特別なフローチャートを用いて、それが130分で6匹のマウスのGFRを測定することができる。これは、1日4回まで、このフローチャートプロトコルを繰り返し、24マウスにおいてGFRを測定することが可能である。それは小さな尾スニップではなく尾静脈穿刺に比べて研究者が実行するための迅速かつ容易である尾静脈穿刺から血液を収集することが可能であるように、我々はこの方法を変更しました。 10μlのヘマトクリット毛細管と10倍希釈を用いて、それが<100μlに必要とされる血液の総量を低減することができる。最後に、蛍光を希釈試料の1-2μlの蛍光を決定することができる光度計3300 fluorospectrometerを用いて測定される。この方法では、関心のあるinvestigatoを与えるRA真のGFR値。これとは対照的に、マウスでのクレアチニンの測定値は "クレアチニンブラインド範囲"と具体的かつ敏感な決定に関わる難しさなど、いくつかの弱点がある。腎機能の50％が¹⁹失われるまで、血清クレアチニンが正常範囲に留まるので、 "クレアチニンブラインド範囲は、" GFRのためのマーカーとしての機能を制限する。遺伝子Xのノックアウトマウスを仮定すると、野生型マウスに比べて有意に低いGFR（40％）、持つことになりますいくつかの研究者は腎臓の生理学と病態生理学を研究するために彼らの研究における遺伝子改変マウスを利用するので、これは次のような問題を負担血漿クレアチニンを比較することにより、簡単なスクリーニングは、この差を検出しません。 GFR測定の良い​​正確な方法の必要性が小さく、より重要になってGFRの違いがなる。

マウスは、市販と干渉し、その血漿および尿中クレアチニン非chromagensの高濃度を有する利用クレアチニンアッセイ。結果として、アルカリピクリン酸ヤッフェ反応に基づいているアッセイは、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）測定^6,13に比べて血漿中クレアチニン濃度を過大評価。別の制限は、血清クレアチニン値はHPLC測定に比べて、以下のいくつかの市販のアッセイの検出限界です。しかしながら、酵素反応を用いて研究者は、マウス^10、22に血漿クレアチニンを決定することができた。

類似の範囲のGFRは匹敵するシングルボーラス注入法と同様、尿FITC-イヌリンクリアランス^14を使用して意識したマウスで発見された。彼らのプロトコルとは対照的に、尾スニップを使用して我々のプロトコルには、特別な注意が尾静脈または伏在静脈穿刺に比べて血管の整合性を維持する必要はありません。 FITC-イヌリン基づく尿/血漿クリアランスのためには、外科的に2浸透マイルを注入する必要がありますnipumps。二つのポンプが背景とは明確に区別される定常状態の十分に高いプラズマFITC-イヌリン濃度を達成するために必要である。これはまた、完全なタイミング尿収集のために代謝ケージの使用を必要とする。ケージは、特にすすぎなしで発生したFITC-イヌリンの25から37パーセントの損失を考慮してリンスする必要がある。

このFITC-イヌリン方法を使用しての落とし穴は限られている。調べでは、次の点に注意する必要があります：（i）が注入された量が計算されたGFRを決定し、（ので、（ii）の完全な球後注射が達成しなければならない、FITC-液の注入に使用シリンジ内に気泡がないことを保証ⅲ）マウスが75分GFRの実験中の可能性が最も高い排尿するので、腎臓濃度能力の結果として非常に高いFITC-イヌリン濃度を持つことになり、尿と血液サンプルを汚染しないようにしてください。

一般的な利点OfこのFITC-イヌリンメソッドは次のようなものがあります（I）は（ⅱ）は（iii）のアッセイは、意識的なマウスで行うことができます（同じマウスで測定を複数回繰り返すことが可能であり、非放射性手法ですiv）の無尿採集は、高スループットオプションを利用することができる（v）で必要とされる。単一のボーラス注入の欠点は、現在利用可能な特別な小型化装置^18を用いて経皮的に測定することができる優れたFITC-標識、FITC-sinistrinを使用することによって克服することができるFITC-イヌリンの透析の必要性を含む。 GFRを測定しているにもかかわらず、この方法では、流体またはイオンの分別排泄物を測定することは不可能である。

まとめると、この方法は、意識的なマウスでGFRを測定するためのハイスループットな方法の実現可能性を提供します。したがって、この技術はマウスで腎機能を決定する上で興味を持っている他の研究者のために興味があるかもしれません。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
FITC-inulin	Sigma-Aldrich	F3272
HEPES	Sigma-Aldrich	H7706
Isoflurane	Webster Veterinary	78366551
Dialysis membrane (MWCO 1000)	Spectrum Laboratories	132636
Membrane closure	Spectrum Laboratories	132736
80 μl Hematocrit capillaries	Drummond Scientific	22362566
Hematocrit centrifuge	IEC	Micro-MB
10 μl Na+-Heparin minicaps	Hirschmann	9000210
Syringe (100 μl)	Hamilton	80601
Fluorospectrometer	Thermo-Fisher Scientific	NanoDrop 3300
Filter (0.22 μm)	Spectrum Laboratories	880-26464-UE
Sealant	Châ-seal	510
Needles (G26 ½ and G30 ½)	Becton Dickinson	305111 & 305106