Um Método de alta capacidade para medição de Taxa de filtração glomerular em ratos conscientes

Resumo

Medição da taxa de filtração glomerular (TFG) é o padrão ouro para avaliação da função renal. Aqui, nós descrevemos um método de alto rendimento que permite a determinação da taxa de filtração glomerular em ratinhos conscientes utilizando uma única injecção de bolus, a determinação de isotiocianato de fluoresceína (FITC)-inulina no plasma e no cálculo da TFG por um modelo de decaimento exponencial de duas fases.

Resumo

A medida da taxa de filtração glomerular (TFG) é o padrão ouro na avaliação da função renal. Actualmente, os investigadores a determinar TFG por medição do nível de creatinina no biomarcador endógena ou exogenamente aplicado radioactivos inulina marcada ⁽³ H, ou ¹⁴ C). Creatinina tem a desvantagem substancial de que as contas de secreção tubulares proximais para ~ 50% da excreção de creatinina e, por conseguinte, a creatinina é um marcador fiável da TFG. Dependendo da experiência realizada, a depuração de inulina pode ser determinada através de uma única injecção de bolus ou infusão intravenosa continua (intravenosa ou mini bomba osmótica). Ambas as abordagens requerem a recolha de plasma ou de plasma e urina, respectivamente. Outros inconvenientes da inulina rotulado radioactivo incluem o uso de isótopos, demorado preparação cirúrgica dos animais, e a exigência de uma experiência de terminal. Aqui, nós descrevemos um método que usa uma única injecção bolusfluoresceína isotiocianato (FITC) de inulina marcada e a medição da sua fluorescência em 1-2 ml de plasma diluído. Através da aplicação de um modelo de dois compartimentos, com oito coletas de sangue por mouse, é possível medir a TFG em até 24 ratos por dia usando um protocolo especial de fluxo de trabalho. Este método requer apenas anestesia isoflurano breve com todas as amostras de sangue a ser coletado em um mouse não-contido e acordado. Outra vantagem é que é possível seguir ratinhos durante um período de vários meses, e os tratamentos (isto é, fazendo experiências emparelhadas com as alterações dietéticas ou aplicações de droga). Esperamos que esta técnica de medição da TFG é útil para outros pesquisadores que estudam a função renal do rato e vai substituir métodos menos precisos para estimar a função renal, tais como creatinina plasmática e uréia.

Introdução

A taxa de formação de ultrafiltrado do plasma no glomérulo tornou-se a base para a avaliação da função renal (taxa de filtração glomerular, TFG). O marcador ideal para determinar a TFG deve ser filtrada livremente, nem segregada ou reabsorvido e não metabolizado. Tal comportamento foi encontrado para ser verdadeiro para inulina, e depuração de inulina tornou-se um padrão-ouro para a determinação da taxa de filtração glomerular ^3. Considerando que a liberação de creatinina é amplamente utilizado como uma medida da taxa de filtração glomerular em humanos e animais, a creatinina não preenche os requisitos de um marcador ideal da TFG. Cerca de 10 - 40% do clearance de creatinina em seres humanos é a conseqüência de secreção tubular ativa ^{1, 11,} e secreção renal de creatinina também é destaque em camundongos e ratos ^{4, 7, 9, 22.} A disfunção renal é conhecido para aumentar a secreção tubular de creatinina, que limita a sua utilidade como um marcador de ^uma taxa de filtração ^{glomerular, 2.} Nós mostramos anteriormente que ânion orgânico transportador isoforma3 (OAT3) contribui para murino secreção de creatinina ^22. No entanto, a depuração de inulina normalmente requer o uso de inulina marcada radioactiva ⁽³ H, ou ¹⁴ C). A determinação radioactiva da inulina pode ser utilizada tanto em ratinhos anestesiados e conscientes, mas abriga as desvantagens de vários regulamentos de segurança e problemas de manuseamento inerentes rigorosas com a utilização de isótopos radioactivos. Ao longo destas linhas, os preparativos apuramento cirúrgicas para determinação da TFG são demorados, bem como do terminal na natureza. Em 1999 Lorenz et al. ¹² introduzida FITC-inulina, como marcador do único nefrónio TFG em ratos anestesiados. Cinco anos mais tarde, Qi et al. ¹⁵ determinou todo rim TFG em ratinhos conscientes utilizando FITC-inulina. Protocolos alternativos estão usando agora FITC-inulina como um marcador exógeno para medir a taxa de filtração glomerular em ratos conscientes e anestesiados. Estes protocolos de reter a sensibilidade de inulina radioactivos usando fluorescência DETECTIe em contornar as desvantagens de se trabalhar com um marcador radioactivo marcado. O ensaio FITC-inulina foi modificado por outros ^{7, 8} e nos ^{22, 23} para aproveitar a capacidade microvolume do NanoDrop 3300 fluorospectrometer. Isto permite a redução do volume total de amostra necessária para <100 ul de sangue por TFG medida.

Com o método e o protocolo de alto rendimento fornecida nesta publicação, que demonstram a viabilidade da medição de GFR em até 24 ratinhos conscientes por dia. Esta técnica pode ser útil para outros pesquisadores que estudam GFR murino e esperamos que ele irá substituir métodos menos precisos como índices para a função renal, tais como creatinina e uréia no sangue.

Protocolo

1. Soluções

1. 0,85% de NaCl: 8,5 g de NaCl / 1 l _ddH2O (8,5 g / L).
2. 0,5 mol / L de HEPES pH 7,4 (dissolver 59,6 g de HEPES em 0,5 L de ddH ₂ 0 e ajustar o pH para 7,4 utilizando NaOH 10 N).

2. Preparação de FITC-inulina Injection Solution

1. Pesar com FITC inulina para preparar uma solução a 5% e dissolvido em 0,85% de NaCl (normalmente 100 mg / 2 ml de 0,85% de NaCl) por aquecimento a 90 ° C até estar completamente dissolvido.
2. Pesar dissolvido solução de FITC-inulina e peso nota.
3. Cortar uma 20 centímetros pedaço de membrana de diálise (peso molecular de corte: 1000) e coloca em _ddH2O durante 30 min para remover o residual NaN ₃ a partir da membrana e lave algumas vezes depois.
4. Preencha dissolvido FITC-inulina em membrana de diálise e lacrar com encerramentos.
5. Pese toda membrana de diálise.
6. Colocar a membrana de diálise, em 1 L de solução de NaCl a 0,85% e agita-se lentamente à luz protegida durante 24 horas à rotemperatura om.
7. Pesar inteiro membrana de diálise novo e calcular a nova concentração (a água irá passar para o osmoticamente membrana e FITC não ligado ou ligado de FITC-inulina <1,000 peso molecular irá mover para fora da membrana, assim, a concentração de FITC-inulina diminui substancialmente) .
8. A nova concentração FITC-inulina (c) é calculada utilizando a seguinte fórmula: C = N / V, onde n = quantidade de FITC-inulina inicial, V = novo volume (diferença de peso do tubo de diálise antes e depois da diálise mais o volume inicial de solução de FITC-inulina).
9. Antes de usar esterilizar solução dialisada com FITC inulina por filtração através de um filtro de seringa 0,22.
10. Ficar FITC-inulina protegido da luz (folha de alumínio), a 4 ° C. Dialisadas e esterilizado com FITC inulina pode ser utilizada para um máximo de 2 semanas. Participaram FITC-inulina pode ser re-dissolvido por aquecimento a 90 ° C durante alguns minutos.

Nota: se estiver usandoFITC-sinistrin ^16-18, o qual não necessita de diálise, todos os passos necessários para a diálise pode ser ignorada.

3. Injeção e Coleta de Sangue

1. Tire o peso corporal (pc) dos camundongos antes do experimento.
2. Anestesiar ratos brevemente com isoflurano.
3. Por alto rendimento de 6 ratinhos siga protocolo fornecido na Figura 3.
4. Injetar 2 l / g de peso corporal de dialisado FITC-inulina no plexo retro-orbitária ²⁴ usando um G30 ½ em agulha (remover bolhas de ar de 100 l seringa Hamilton, primeiro usando uma G26 ½ na agulha e, em seguida, mudar para um G30 ½ na agulha para injecção).
5. Corte de 1 mm da cauda do rato com uma tesoura uma vez e coletar sangue em 3, 5, 7, 10, 15, 35, 56 e 75 min após a injeção de Na-heparina minicapillaries. Seal minicapillaries após a coleta de sangue, com Cha-seal.
6. Manter as amostras protegidas da luz.
7. Coloque selado minicapillaries dentro hematocrit capilares e centrifugar durante 5 min.
8. Quebre minicapillaries usando um cortador de diamante e plasma toda transferência por pipetagem em um tubo de 0,2 ml.
9. Fazer uma diluição de 1:10 utilizando 2 ul de plasma e 18 ul de 0,5 mol / L de HEPES (pH 7,4) em 0,2 ml novo tubo (amostras podem ser armazenadas durante a noite a 4 ° C, para medições de fluorescência).
10. Meça 2 mL de amostra diluída com NanoDrop 3300 em duplicatas. A descrição e uso do instrumento é descrito aqui ^5.

4. Elaboração de normas

1. Coleta de sangue de ratos da mesma linhagem fundo em heparina revestido hematócrito capilares, girar e diluir 1:10 com 0,5 mol / L HEPES (pH 7,4), geralmente 80 mL de plasma + 720 ul de HEPES.
2. Diluir solução injeção FITC-inulina com plasma diluído mouse para obter as seguintes diluições padrão:
   01:10: 10 ul solução não diluída de FITC-inulina + 90 ul de plasma diluído rato
   1:100: 10 & mu, Solução l (1.10) + 90 mL de plasma diluído rato
   1:1000: 10 ul (1:100) + 90 ul de solução de plasma de rato diluído
   1:2000: 30 ul (1:1) + 30 ul de solução de plasma de rato diluído
   1:10000: 10 ul (1:5) + 40 ul de solução de plasma de rato diluído
   1:20000: 20 ul (1:1) + solução de 20 ul de plasma diluído rato
   1:100.000: 10 ul (1:5) + 40 ul de solução de plasma de rato diluído
   A concentração dos padrões dependerá da diálise e será sempre diferente para cada preparação de FITC-inulina. É necessário entrar na concentração para a curva padrão novo a cada vez.
3. Analisar os dados para calcular a taxa de filtração glomerular com software apropriado (por exemplo, GraphPad Prism) utilizando uma função de decaimento exponencial de duas fases, tal como descrito aqui ^{15, 20} e mostrado na secção de resultados representativas.

Resultados

TFG será calculada utilizando a seguinte fórmula:

TFG = n / (+ A/K1 B/K2), onde

n = quantidade injetada (n = c • V, onde c = concentração FITC-inulina, V = volume injetado)
A = amplitude1, y-interceptar de eliminação
K1 = constante de decaimento para a eliminação
B = Span2, y-interceptar de distribuição
K2 = constante de decaimento para distribuição

Nota: A, K1, K2 e B são abreviaturas dadas por GraphPad Prism, cada um software capaz de analisar duas fase de decaimento exponencial pode ser utilizado, no entanto, outro software científica podem usar diferentes abreviaturas.

Ao empregar um ajuste da curva de decaimento exponencial de duas fases, que se baseia no plasma concentrações de FITC-inulina, uma curva similar à mostrada na Figura 1, deve ser obtida. Calculando TFG pela fórmula mostrada acima (e como descrito aqui ^{20) permite detectar perturbações da função renal glomerular, hiperfiltração 15 ou 8, 23, conforme se encontra em ratos com diabetes mellitus tipo 1 (Figura 2).}

Figura 1. Para medir a taxa de filtração glomerular nos ratos conscientes, cinética plasmática do FITC-inulina na sequência de uma injecção intravenosa de uma dose única é usado. Para o cálculo da taxa de filtração glomerular, um modelo de dois compartimentos é empregue. No modelo de dois compartimentos, a fase inicial rápida decomposição representa redistribuição do FITC-inulina a partir do compartimento intravascular para o fluido extracelular. A fase posterior, com uma queda mais lenta em concentração de FITC-inulina, reflecte predominantemente depuração sistémica a partir do plasma.

Figura 2. Detection de hiperfiltração diabética em ratinhos de tipo selvagem. Diabetes mellitus tipo I foi induzida por aplicação intraperitoneal de estreptozotocina (STZ, 50 mg / kg durante 5 dias consecutivos). TFG foi determinada antes (basal) e 5 semanas após a indução do diabetes. Devido ao feedback tubuloglomerular, um aumento primário na reabsorção proximal provoca cedo hiperfiltração diabético ²¹ uma descoberta que é reproduzível em camundongos selvagens (n = 10, p <0,01 vs basal mesmo mouse).

Figura 3. Fluxograma para a medição da taxa de filtração glomerular em um conjunto de seis camundongos. Para medir todo renal TFG pelo método de injeção única em bolus, oito amostras de sangue devem ser coletadas em 3, 5, 7, 10, 15, 35, 56 e 75 min após FITC-inulina injecção. Os números indicam os pontos temporais. Os números entre parênteses indicam o número da amostra. Momentos à esquerda da linha vertical vermelha indica injeçãoOs pontos de tempo (0, 11, 22, 33, 44 e 55 min). Cada rato é marcado com uma cor diferente. Para obter coletas de sangue sequenciais seguir as setas. Caixas cinzentas indicar quando o próximo rato deve estar preparado para anestesia com isoflurano antes da injecção. Usando este protocolo o tempo mínimo entre duas coletas de sangue de diferentes ratos é 1 min.

Discussão

O presente estudo descreve uma técnica para a determinação da taxa de filtração glomerular em ratos conscientes pela injeção single-bolus e análise de fluorescência em oito amostras de sangue por duas fases de decaimento exponencial. A medição da TFG em um rato leva 75 min. Ao utilizar um fluxograma especial, é possível medir a TFG de 6 ratinhos em 130 min. É possível repetir esse protocolo fluxograma até quatro vezes por dia e medir a taxa de filtração glomerular em 24 ratos. Nós este método modificado de modo que seja possível a recolha de sangue a partir de um pequeno recorte da cauda, ​​em vez de punção na veia da cauda, ​​o que é mais rápido e mais fácil para os investigadores a executar em relação ao punção da veia da cauda. Usando 10 ml de hematócrito capilares e uma diluição de 1:10, é possível reduzir a quantidade total de sangue necessário para <100 ul. Finalmente, a fluorescência é medida utilizando um NanoDrop fluorospectrometer 3300, que permite a determinação da fluorescência de 1-2 ul de amostra diluída. Este método vai dar o investigato interessadosra o verdadeiro valor da TFG. Em contraste, as medições de creatinina em ratos têm várias deficiências, incluindo "gama cego creatinina", e dificuldades relacionadas com a determinação específica e sensível. A "escala de creatinina cego" limita a sua função como um marcador para a taxa de filtração glomerular da creatinina sérica, porque permanece na gama normal de até 50% da função renal é perdido ^19. Uma vez que vários investigadores utilizam camundongos geneticamente modificados em suas pesquisas para estudar a fisiologia e fisiopatologia renal, este tem o seguinte problema: supondo que um camundongo knockout do gene X teria um GFR significativamente menor (40%) em comparação com um rato do tipo selvagem, uma triagem simples, comparando creatinina plasmática não detectar essa diferença. A necessidade de um bom método preciso para determinação TFG torna-se mais crítica quanto menor as diferenças na taxa de filtração glomerular se.

Os ratos têm concentrações elevadas de chromagens não creatinina no plasma e na urina que interferem com comercialmenteOs ensaios da creatinina estão disponíveis. Consequentemente, os ensaios que se baseiam na picrato Jaffé reacção alcalina sobreavaliação concentração de creatinina no plasma em comparação com a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) determinação ^{6, 13.} Outra limitação é que a creatinina sérica é inferior aos limites de detecção dos vários ensaios disponíveis comercialmente em comparação com a análise por HPLC. No entanto, através da utilização de reacções enzimáticas investigadores foram capazes de determinar a creatinina no plasma em ratinhos ^{10, 22.}

TFG em uma faixa semelhante foram encontrados em ratos conscientes, utilizando um método comparável de injeção single-bolus, bem como desembaraço FITC-inulina urinária ^14. Em contraste com o seu protocolo, o nosso protocolo usando recorte cauda não exige precauções especiais para preservar a integridade do vaso em relação ao punção da veia da cauda, ​​ou veia safena. Para o apuramento urinária / plasma baseada FITC-inulina é necessário implantar cirurgicamente duas milhas osmóticanipumps. Duas bombas são necessárias para atingir suficientes concentrações plasmáticas no estado de equilíbrio alta FITC-inulina que são claramente distinguíveis do fundo. Isso também requer o uso de gaiolas metabólicas para coleta de urina completo e cronometrado. As gaiolas devem ser enxaguados para ter em conta a perda de 25-37% de FITC-inulina, que de outro modo ocorre sem enxaguar.

Os perigos de usar este método de FITC-inulina são limitadas. Os investigadores devem estar cientes do seguinte: (i) assegurar que não há bolhas de ar na seringa usada para a injeção da solução de FITC, (ii) a injeção retrobulbar completo deve ser alcançado porque a quantidade injetada determina a TFG calculada e ( iii) a ratos vão mais provável urinar durante o 75 min experimento TFG, portanto, evite a contaminação de amostras de sangue com a urina, o que terá uma concentração muito elevada de FITC-inulina, como uma consequência da capacidade de concentração renal.

Vantagens Geral of este método FITC-inulina incluem o seguinte: (i) é uma técnica não-radioactivos, (ii) é possível repetir várias vezes medições no mesmo rato, (iii) o ensaio pode ser realizado em ratos conscientes, ( iv) recolha de urina não é necessário, e (v) uma opção de alto rendimento podem ser utilizadas. As desvantagens para a injecção de bolus único incluem a necessidade de diálise de FITC-inulina, que pode ser ultrapassada pela utilização de um melhor marcador FITC, FITC-sinistrin, que está disponível e pode ser medido usando um dispositivo transcutea miniaturizado especial ^18. Mesmo que a TFG é medida, não é possível medir a excreção fracionada de fluido ou de iões com este método.

Tomados em conjunto, este método oferece a viabilidade de um método de alto rendimento para a medição da TFG em ratos conscientes. Assim, esta técnica pode ser de interesse para outros pesquisadores que estão interessados ​​na determinação da função renal em camundongos.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
FITC-inulin	Sigma-Aldrich	F3272
HEPES	Sigma-Aldrich	H7706
Isoflurane	Webster Veterinary	78366551
Dialysis membrane (MWCO 1000)	Spectrum Laboratories	132636
Membrane closure	Spectrum Laboratories	132736
80 μl Hematocrit capillaries	Drummond Scientific	22362566
Hematocrit centrifuge	IEC	Micro-MB
10 μl Na+-Heparin minicaps	Hirschmann	9000210
Syringe (100 μl)	Hamilton	80601
Fluorospectrometer	Thermo-Fisher Scientific	NanoDrop 3300
Filter (0.22 μm)	Spectrum Laboratories	880-26464-UE
Sealant	Châ-seal	510
Needles (G26 ½ and G30 ½)	Becton Dickinson	305111 & 305106