Bilinçli Farelerde Glomerüler Filtrasyon Hızı Ölçümü için bir Yüksek verimli Yöntemi

Özet

Glomerüler filtrasyon hızı (GFR) ölçümü böbrek fonksiyonunun değerlendirilmesi için altın standarttır. Burada iki aşamalı bir üstel bozulma modeli ile plazma ve GFR hesaplanmasında tek bolus enjeksiyon, floresein izotiyosiyanat belirlenmesi (FITC)-inulin kullanarak bilinçli farelerde GFR belirlenmesinde sağlayan yüksek verimli yöntem açıklanmaktadır.

Özet

Glomerüler filtrasyon hızı (GFR) ölçümü böbrek fonksiyonu değerlendirmede altın standarttır. Şu anda, araştırmacılar endojen biyolojik kreatinin veya eksojen uygulanan radyoaktif etiketli inulin ^(3H veya ¹⁴ C) düzeyi ölçülerek GFR belirler. Kreatinin ~ 50 toplam renal kreatinin atılımının% ve bu nedenle kreatinin için proksimal tübüler sekresyon hesapları güvenilir bir GFH belirteç olmadığı önemli dezavantajı vardır. Gerçekleştirilen deney ile ilgili olarak, inülin klirensi intravenöz, bolus enjeksiyonu ya da sürekli infüzyon (damar içine ya da ozmotik mini-pompa) tarafından tespit edilebilir. Her iki yaklaşım sırasıyla, plazma veya plazma ve idrar toplama gerektirir. Radyoaktif etiketli inulin başka dezavantajları izotoplarının kullanımı, hayvanların zaman alıcı bir cerrahi hazırlanması ve bir terminal deney gereksinimi bulunmaktadır. Burada, tek bir bolus enjeksiyon kullanan bir yöntem tariffloresein izotiosiyanat-(FITC) işaretli inulin ve seyreltilmiş plazma 1-2 ul kendi floresans ölçümü. Fare başına 8 kan koleksiyonları ile, iki bölme modeli uygulayarak, özel bir iş akışı protokolü kullanarak günde 24 fareler için GFR ölçmek mümkündür. Bu yöntem, yalnızca sigara ölçülü ve uyanık fare toplanan tüm kan örnekleri ile kısa izofluran anestezi gerektirir. Başka bir avantajı da birkaç ay ve tedaviler (örneğin diyet değişikliği ya da ilaç uygulamaları ile eşleştirilmiş deneyler yaparak) bir süre boyunca farenin takip etmek mümkün olmasıdır. Biz ölçüm GFR bu tekniği fare böbrek fonksiyonu okuyan diğer araştırmacılar için yararlıdır ve bu plazma kreatinin ve kan üre azot gibi böbrek fonksiyonu, tahmin daha az doğru yöntemlerinin yerini umuyoruz.

Giriş

Glomerulus de plazma ultrafiltratında oluşum oranı renal fonksiyon (glomerüler filtrasyon hızı, GFR) değerlendirmek için temel haline gelmiştir. GFH belirlemek için ideal bir işaretleyici serbestçe, filtre salgılanan veya emilir ne ve metabolize olmamalıdır. Böyle bir davranış inulin için doğru bulunmuştur ve inülin klirensi GFR ³ belirlenmesi için altın standart haline gelmiştir. Kreatinin klirensi yaygın olarak, insanlarda ve hayvanlarda GFR bir ölçüsü olarak kullanılır ise, kreatinin ideal GFR marker gereklilikleri yerine getirmemektedir. Yaklaşık 10 - insanlarda kreatinin klirensi% 40 aktif tübüler sekresyon ^{1, 11} sonucudur, ve kreatinin böbrek salgısı da fare ve sıçan ^{4, 7, 9, 22} belirgindir. Böbrek fonksiyon bozukluğu GFR ^{1, 2} bir belirleyicisi olarak değerinin sınırlar kreatinin tübüler sekresyon arttırdığı bilinmektedir. Daha önce organik anyon taşıyıcı izoformu göstermiştir3 (OAT3) faregiller böbrek kreatinin sekresyon ²² katkıda bulunur. Bununla birlikte, tipik olarak inülin klirensi radyoaktif etiketli inulin ⁽³ H ya da ¹⁴ ° C) kullanımını gerektirir. Inulin radyoaktif belirlenmesi anestezi ve bilinçli hem farelerde kullanılan, ancak çok sayıda güvenlik yönetmeliklerine ve radyoaktif izotopların kullanımı ile doğal katı işleme konularda dezavantajları barındırıyor olabilir. Bu doğrultuda, GFH belirlenmesi için cerrahi boşluk hazırlıkları zaman alıcı hem de doğada terminali bulunmaktadır. 1999 yılında Lorenz ve arkadaşları. ¹² anestezi farelerde tek nefron GFR bir göstergesi olarak FITC inulin tanıttı. Beş yıl sonra Qi ve ark. ¹⁵ FITC inulin kullanarak bilinçli farelerde tüm böbrek GFR belirlenir. Alternatif protokolleri artık bilinçli ve anestezi farelerde GFR ölçmek için dışsal belirteç olarak FITC inulin kullanıyorsunuz. Bu protokoller, floresan detecti kullanılarak radyoaktif inulin duyarlılığı korumakve bir radyoaktif etiketli işaretleyici ile çalışma dezavantajları engellemeyi. FITC inulin testi NanoDrop 3300 fluorospectrometer en microvolume yeteneği yararlanmak diğerleri ^{7, 8} ve bize ^{22, 23} tarafından güncellenmiştir. Bu GFH ölçüm başına <100 ul kan için gerekli olan toplam örnek hacmi azaltarak sağlar.

Yöntem ve bu yayında sağlanan yüksek verimlilik protokolü ile, biz günde 24 bilinçli fareler için ölçüm GFR fizibilite göstermektedir. Bu teknik fare GFH okuyan diğer araştırmacılar için yararlı olabilir ve biz bu tür kreatinin ve kan üre azotu olarak böbrek fonksiyonu için endeksleri, daha az doğru yöntemlerinin yerini umuyoruz.

Protokol

1. Çözümler

1. % 0.85 NaCl: 8.5 g NaCl / 1 L GKD ₂ O (8.5 g / L).
2. 0.5 mol / L HEPES pH 7.4 (GKD ₂ 0 0.5 L HEPES 59,6 g çözülür ve 10 N NaOH kullanılarak pH 7.4 ayarlayın).

2. FITC inülin enjeksiyon solüsyonu hazırlanması

1. Tamamen eriyene kadar 90 ° C'ye kadar ısıtma ile% 0,85 NaCl (genellikle 100 mg / 2 ml% 0.85 NaCl) içinde% 5 çözeltisi hazırlamak ve çözünmesi için FITC inülin tartılır.
2. Çözünmüş FITC inulin çözüm ve not ağırlığı tartılır.
3. Diyaliz membran bir 20 cm parça (molekül ağırlığı kesme: 1.000) kesin ve zarından kalan NaN ₃ kaldırmak ve daha sonra birkaç kez temizlemek için 30 dakika GKD ₂ O koymak.
4. Diyaliz membran içine FITC inulin çözünmüş doldurun ve kapakları olan düzgün mühür.
5. Tüm diyaliz membran tartılır.
6. 1 L% 0.85 NaCl içerisinde diyaliz membranı koyun ve Ro, 24 saat süre ile ışıktan korunan yavaşça karıştırınom sıcaklığı.
7. Tekrar tüm diyaliz membran tartılır ve (su ozmotik membran ve ilişkisiz FITC taşımak veya FITC inulin <1.000 molekül ağırlığı membran dışına hareket edecek bağlı olacak, bu yüzden, FITC inulin konsantrasyonunu önemli ölçüde azalacaktır) yeni konsantrasyonu hesaplamak .
8. Yeni FITC inülin konsantrasyonu (c) aşağıdaki formül kullanılarak hesaplanır: C = N / V, burada n = başlangıç ​​FITC miktarda inülin, V = yeni birim (diyaliz artı başlangıç ​​hacmi önce ve sonra diyaliz tüp ağırlık farkı FITC inulin çözeltisi).
9. 0.22 um bir şırınga filtresi ile filtre edilerek diyalizlenmiş FITC inulin çözeltisi sterilize Kullanım öncesinde.
10. FITC inulin 4 ışık (alüminyum folyo) korunmaktadır tutun ° C Diyaliz edilmiş ve FITC inülin sterilize 2 haftaya kadar için kullanılabilir. FITC inülin birkaç dakika boyunca 90 ° C'de yeniden çözdürüldü edilebilir katıldı.

Not: kullanıyorsanızDiyaliz gerektirmez FITC sinistrin ^16-18, diyaliz için gerekli tüm adımları atlanabilir.

3. Enjeksiyon ve Kan Alma

1. Deneyden önce farelerin vücut ağırlığı (va) alın.
2. Izofluran ile kısa bir süre fareler anestezi.
3. 6 farelerin yüksek verimlilik için Şekil 3'te verilen protokol takip edin.
4. (Ilk kez iğne bir G30 ½ geçiş sonra iğne bir G26 ½ kullanarak ve 100 ul Hamilton şırınga içindeki hava kabarcıklarını çıkarmak iğne bir G30 ½ kullanarak retroorbital pleksus ²⁴ içine diyaliz FITC inulin 2 g / ml bw enjekte enjeksiyonu).
5. Bir kez makas ile fare kuyruğu 1 mm kesin ve 35, 15, 10, 5, 3, 7 kan toplamak, 56 ve Na-Heparin minicapillaries enjeksiyon sonrası 75 dk. Cha-mühür ile kan alımından sonra Seal minicapillaries.
6. Işıktan korunmalıdır örnekleri tutun.
7. Kapalı minicapillaries içinde hemato koymakcrit kılcal ve 5 dakika boyunca santrifüj.
8. Bir 0.2 ml tüp içine pipetleme bir elmas kesici ve transfer tüm plazma kullanarak minicapillaries kırın.
9. Yeni bir 0.2 ml'lik bir tüp (numune gece boyunca 4 ° saklanabilir ° C flüoresans ölçümü için) plazma 2 ul ve 18 ul 0.5 mol / L Hepes (pH 7.4) kullanarak, bir 1:10 seyreltme olun.
10. Çiftleri NanoDrop 3300 ile seyreltilmiş numunenin 2 ul ölçün. Aygıtının Gözde kullanım burada ^5'te açıklanmıştır.

4. Standartlar hazırlanması

1. Heparin kaplı hematokrit kılcal aynı arka plan suşu farelerden alınan kan toplayın, aşağı spin ve 0,5 mol / L HEPES (pH 7.4) ile 01:10 sulandırmak; genellikle 80 ul plazma + 720 ul HEPES.
2. Aşağıdaki standart seyreltme almak için seyreltilmiş fare plazma ile FITC inulin enjeksiyon çözümü sulandırmak:
   01:10: 10 ul FITC seyreltilmemiş inulin çözeltisi + 90 ul seyreltilmiş fare plazma
   1:100: 10 ve Mu, L (1:10) solüsyonu + 90 ul seyreltilmiş fare plazma
   1:1,000: 10 ul (1:100) solüsyonu + 90 ul seyreltilmiş fare plazma
   1:2,000: 30 ul (1:1) solüsyonu + 30 ul seyreltilmiş fare plazma
   1:10,000: 10 ul (01:05) çözeltisi + 40 ul seyreltilmiş fare plazma
   1:20,000: 20 ul (1:1) solüsyonu + 20 ul seyreltilmiş fare plazma
   1:100,000: 10 ul (01:05) çözeltisi + 40 ul seyreltilmiş fare plazma
   Standartların konsantrasyonu, diyaliz bağlı olacaktır ve her zaman FITC inülin her hazırlanması için farklı olacaktır. Bu yeni bir standart eğri için her zaman konsantrasyon girmek için gereklidir.
3. Burada ^{15, 20} dahilinde tarif edilen ve Örnek Sonuçlar bölümünde gösterildiği gibi iki aşamalı bir üssel fonksiyon kullanılarak uygun yazılımı (örneğin, GraphPad Prism) ile GFR hesaplamak için veri analiz edin.

Sonuçlar

GFR aşağıdaki formül kullanılarak hesaplanır:

GFH = n / (A/K1 + B/K2), burada

n = enjekte miktarı (n = c • V, burada c = FITC inulin konsantrasyonu, V = enjekte hacmi)
A = Span1, eleme y-kesmek
Ortadan kaldırılması için sürekli K1 = çürüme
B = Span2, y-kesişim dağılımının
Dağıtımı için K2 = çürüme sabit

Not: A, K1, B ve K2 GraphPad Prism, iki fazlı üstel bozulma analiz yeteneğine sahip her yazılım tarafından verilen kısaltmalar kullanılabilir, ancak, diğer bilimsel yazılım farklı kısaltmalar kullanabilirsiniz.

Plazma FITC inülin konsantrasyonu esas iki fazlı bir üssel bir azalma eğri uyum, kullanılarak, Şekil 1 'de gösterilene benzer bir eğri elde edilmelidir. Yukarıda gösterilen formül (GFR tarafından hesaplanması ve burada tarif <)> 20 destek tip 1 diabetes mellitus (Şekil 2) ile farelerde bulunan Böbrek işlevinde ¹⁵ veya glomerüler hiperfiltrasyon ^{8, 23} değer düşüklüğü algılamasını sağlar.

Şekil 1. Bilinçli farelerde GFR ölçmek için, tek bir doz intravenöz enjeksiyonu takiben FITC inulin plazma kinetiği kullanılır. GFR hesaplanması için, iki bölümlü bir modeli kullanılmıştır. İki bölme modeli olarak, ilk hızlı bir bozulma faz dışı sıvı için intravasküler bölmesinden FITC inulin dağıtılması temsil eder. FITC inulin konsantrasyon yavaş çürüme ile daha sonra faz,, ağırlıklı olarak plazmadan sistemik klirensi yansıtır.

Şekil 2. DetectioN vahşi tip farelerde diyabet hiperfiltrasyonun. diyabet (STZ, birbirini takip eden 5 gün boyunca 50 mg / kg) intraperitoneal uygulaması streptozosin ile indüklendi Tip I. GFR önce (taban) ve 5 hafta diyabet indüksiyon sonrasında tespit edilmiştir. Tübüloglomerüler geri bildirim nedeniyle, proksimal geri emiliminin bir birincil artışın, erken diyabetik hiperfiltrasyon ²¹ vahşi tip farelerde tekrarlanabilir bir bulgu neden olan (n = 10, p <0.01 'e karşı taban aynı fare).

Şekil 3,. 6 farenin bir dizi GFR ölçümü. Tek bir bolus enjeksiyon yöntemiyle tüm böbrek GFR ölçmek için akış şeması, 8 kan örnekleri 10, 15, 35, 56 ve 75 dakika sonra, 7, 3, 5 toplanmalıdır FITC inulin enjeksiyon. Sayılar zamanlarını göstermektedir. Parantez içindeki sayılar örnek sayısını gösterir. Dikey kırmızı çizgi sol zaman noktalarında enjeksiyon gösterirzaman noktalarında (0, 11, 22, 33, 44 ve 55 dakika). Her fare farklı bir renk ile işaretlenir. Ardışık kan koleksiyonları almak için okları takip edin. Gri kutular bir sonraki fare enjeksiyon önce izofluran anestezi için hazırlanmış olması gerekir bunu gösterecek. Bu protokolü kullanarak farklı farelerden alınan 2 kan koleksiyonları arasındaki minimum süresi 1 dk.

Tartışmalar

Bu çalışma, iki fazlı üssel bir azalma 8 kan örneklerinde floresans tek bolus enjeksiyonu ve analiz bilinçli farelerde GFR belirlenmesi için bir yöntem açıklanır. 1 fare bir GFH ölçümü 75 dakika sürer. Özel bir akış şeması kullanılarak, 130 dakika içinde 6 farelerinin GFR ölçmek mümkündür. Bu kadar günde 4 kez bu akış şeması protokolü tekrar ve 24 farelerde GFR ölçmek mümkündür. Daha hızlı ve araştırmacılar kuyruk ven ponksiyon göre gerçekleştirmek için daha kolay olan küçük bir kuyruk kelepir yerine kuyruk ven delinme, kan toplamak mümkün olduğunu bu nedenle bu yöntem değiştirilmiş. 10 ul hematokrit kapiller ve 1:10 seyreltme kullanılarak, <100 ul için gerekli kan toplam miktarını azaltmak mümkündür. Son olarak, floresan seyreltilmiş numunenin 1-2 ul floresan belirlenmesine izin verir NanoDrop 3300 fluorospectrometer kullanılarak ölçülür. Bu yöntem, ilgili investigato verecekra gerçek GFR değeri. Buna karşılık, farelerde kreatinin ölçümleri "kreatinin kör aralığı" ve belirli ve hassas belirlenmesi ile ilgili zorluklar dahil olmak üzere birçok zayıf yönleri vardır. Böbrek fonksiyonlarının 50% ¹⁹ kaybolana kadar serum kreatinin normal sınırlar içinde kaldığından "kreatinin kör aralığı" GFH için bir belirteç olarak işlevini sınırlar. Gen X bir nakavt fare varsayarak bir yabani tip fare ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha düşük GFH (% 40), bir olurdu: bazı araştırmacılar böbrek fizyolojisi ve patofizyolojisi çalışma araştırmalarında genetik olarak değiştirilmiş fareler kullanmak için, bu aşağıdaki sorun taşımaktadır plazma kreatinin karşılaştırarak basit tarama bu fark tespit olmaz. GFR belirlenmesi iyi bir doğru bir yöntem için ihtiyaç GFR'de farklılıklar çok daha küçük daha kritik hale gelmektedir.

Fareler ticari müdahale onların plazma ve idrarda olmayan kreatinin chromagens yüksek konsantrasyonlardaMevcut kreatinin ölçülür. Bunun bir sonucu olarak, plazmadaki alkali pikrat Jaffe reaksiyonu fazla tahmin kreatinin konsantrasyonu dayalı tahliller, yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) tayini ^{6, 13} ile karşılaştırıldığında. Başka bir sınırlama serum kreatinin HPLC belirlenmesi göre aşağıda çeşitli ticari testlerin tespit limitleri olduğunu. Ancak, enzimatik reaksiyonlar araştırmacılar kullanarak fareler ^{10, 22} plazma kreatinin belirlemek başardık.

Benzer bir dizi GFR benzer bir tek bolus enjeksiyon yöntemi hem de idrar FITC inülin açıklık ¹⁴ kullanılarak bilinçli bir farenin bulundu. Kendi protokolünün aksine, kuyruk kelepir kullanarak protokol özel önlem kuyruk ven veya safen ven delinme göre geminin bütünlüğünü korumak için gerektirmez. FITC inulin tabanlı idrar / plazma klirensi için cerrahi iki osmotik mi implant gereklidirnipumps. Iki pompa arka plan açıkça ayırt edilebilir yeterince yüksek sabit-durum plazma FITC inulin konsantrasyonları elde etmek için gereklidir. Bu aynı zamanda, bir tam ve idrar toplanması için metabolik kafesler arasında kullanımını gerektirir. Kafesler aksi durulama olmadan meydana FITC inulin 25-37% arasında bir kayıp hesaba durulanması gereken.

Bu FITC inülin yöntemi kullanmanın tuzaklar sınırlıdır. Müfettişler şu farkında olmalıdır: (i) FITC-çözüm enjeksiyon için kullanılan şırınga içinde hava kabarcığı olduğunu temin ederim, (ii) tam retrobulber enjeksiyon enjekte miktarı hesaplanan GFR belirler çünkü elde, ve olmalıdır ( iii) fareler, böylece böbrekler konsantrasyon yeteneğinin bir sonucu olarak, çok yüksek bir FITC inülin konsantrasyonuna sahip olacaktır idrar, kan örneği ile karışmasını 75 dakika GFR deney sırasında muhtemelen idrar kaçınır.

Genel avantajları oF Bu FITC inülin yöntemi aşağıdakileri içerir: (i) (ii) (III) 'tahlilinde, bilinçli farelerde yapılabilir, aynı fare ölçümler birden çok kez tekrarlamak mümkündür, radyoaktif olmayan bir tekniktir ( iv) idrar toplama gereklidir, ve (v) Yüksek verimli bir seçenek kullanılabilir. Tek bir bolus enjeksiyon için dezavantajlar artık kullanılabilir ve özel bir minyatür cihaz ¹⁸ kullanılarak transkütan ölçülebilir daha iyi bir FITC işaretleyici, FITC sinistrin kullanılarak aşılabilir FITC inulin diyaliz ihtiyacını içerir. GFR ölçülür olsa da, bu yöntem ile akışkan veya iyonların fraksiyonel idrar ölçülmesi mümkün değildir.

Birlikte ele alındığında, bu yöntem, bilinçli farelerde GFR ölçmek için yüksek verimli bir yöntemin uygulanabilirliğini içerir. Bu nedenle, bu teknik farelerde böbrek fonksiyon belirlenmesinde ilgilenen diğer araştırmacılar için ilgi çekici olabilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
FITC-inulin	Sigma-Aldrich	F3272
HEPES	Sigma-Aldrich	H7706
Isoflurane	Webster Veterinary	78366551
Dialysis membrane (MWCO 1000)	Spectrum Laboratories	132636
Membrane closure	Spectrum Laboratories	132736
80 μl Hematocrit capillaries	Drummond Scientific	22362566
Hematocrit centrifuge	IEC	Micro-MB
10 μl Na+-Heparin minicaps	Hirschmann	9000210
Syringe (100 μl)	Hamilton	80601
Fluorospectrometer	Thermo-Fisher Scientific	NanoDrop 3300
Filter (0.22 μm)	Spectrum Laboratories	880-26464-UE
Sealant	Châ-seal	510
Needles (G26 ½ and G30 ½)	Becton Dickinson	305111 & 305106