Высокая пропускная метод измерения скорости клубочковой фильтрации в сознании Мыши

Резюме

Измерение скорости клубочковой фильтрации (СКФ) является золотым стандартом для оценки функции почек. Здесь мы описываем высокой пропускной метод, который позволяет определить СКФ в сознании мышей с помощью одной инъекции ударной дозы, определение изотиоцианат флуоресцеина (FITC) инулина в плазме и расчета СКФ по двухфазной экспоненциальной модели распада.

Аннотация

Измерение скорости клубочковой фильтрации (СКФ) является золотым стандартом в оценке функции почек. В настоящее время исследователи определения СКФ путем измерения уровня эндогенного креатинина биомаркера или экзогенно прикладной радиоактивного меченого инулин ⁽³ H или ¹⁴ C). Креатинин имеет существенный недостаток, что проксимальных канальцев счетов секреции в течение ~ 50% от общего числа почечной экскреции креатинина и поэтому креатинина не является надежным маркером СКФ. В зависимости от эксперимента, выполненного, инулин зазор может быть определена путем внутривенной инъекции ударной дозы одного или непрерывной инфузии (внутривенно или осмотического мининасоса). Оба способа требуют сбора плазмы или плазме и моче соответственно. Другие недостатки радиоактивного меченого инулин включать использование изотопов, требует много времени хирургической подготовки животных и требование терминал эксперимента. Здесь мы описываем способ, который использует одну инъекцию ударной дозыизотиоцианат флуоресцеина-(FITC), меченого инулин и измерение его флуоресценции в течение 1-2 мкл разведенной плазмы. Применяя двухкамерные модели с 8 крови коллекций на мышь, можно измерить СКФ до 24 мышей в день с помощью специального рабочего процесса протокола. Этот метод требует только краткого изофлурана наркозом, и всем образцы крови собирают в не сдержан и просыпаются мыши. Другое преимущество состоит в том, что можно следовать мышей в течение нескольких месяцев и лечения (т.е. делает парные эксперименты с диетических изменений или лекарственное средство приложений). Мы надеемся, что эта методика измерения СКФ является полезным для других исследователей изучения функции почек и мышь заменят менее точные методы оценки функции почек, такие как плазменные креатинина и азота мочевины крови.

Введение

Скорость образования плазмы ультрафильтрате через клубочки стала основой для оценки функции почек (скорость клубочковой фильтрации, СКФ). Идеальным маркером для определения СКФ следует свободно фильтруется, не секретируется или поглощаться, а не метаболизируется. Такое поведение было обнаружено, что касается инулина и клиренс инулина стала золотым стандартом для определения СКФ ^3. В то время как оформление креатинина широко используется в качестве меры СКФ у людей и животных, креатинин не отвечают требованиям идеального маркером СКФ. Около 10 - 40% от клиренса креатинина в организме человека является следствием активной канальцевой секреции ^{1, 11,} и почечную секрецию креатинина также видное место в мышах и крысах ^{4, 7, 9, 22.} Нарушение функции почек как известно, увеличивает канальцевую секрецию креатинина что ограничивает его значение как маркер СКФ ^{1, 2.} Ранее мы показали, что органические изоформы Transporter аниона3 (OAT3) способствует мышиный почечной секреции креатинина ^22. Тем не менее, инулин зазор обычно требует использования радиоактивных меченых инулина ⁽³ H или ¹⁴ C). Радиоактивных определения инулин может быть использован как в наркоз и сознательный мышей, но таит в себе многочисленные недостатки правил техники безопасности и строгой проблемы обработки присущи с использованием радиоактивных изотопов. В том же ключе, хирургическая подготовка зазор для определения СКФ занимает много времени, а также терминал в природе. В 1999 году Лоренц и соавт. ¹² введен FITC-инулина в качестве маркера одного нефрона СКФ у анестезированных мышах. Пять лет спустя Ци и др.. ¹⁵ определяется целой почки СКФ в сознательном мышей с помощью FITC-инулин. Альтернативные протоколы в настоящее время используют FITC-инулин как экзогенный маркера для измерения СКФ в сознательном и наркозом мышей. Эти протоколы сохранить чувствительность радиоактивных инулина с помощью флуоресценции Детективна обход и недостатки работы с радиоактивными помечены маркером. FITC-инулин анализа была модифицирована другими ^{7, 8} и нам ^{22, 23,} чтобы воспользоваться возможностью микрообъеме NanoDrop 3300 fluorospectrometer. Это позволяет уменьшить общий объем образца, необходимый для <100 мкл крови в СКФ измерения.

С помощью метода и высокая пропускная способность протокола представленная в данном издании, мы демонстрируем возможность измерения СКФ в 24 сознательным мышей в сутки. Эта техника может быть полезна другим исследователям изучение мышиной СКФ и мы надеемся, что он заменит менее точные методы, показатели функции почек, такие как креатинина и азота мочевины крови.

протокол

1. Решения

1. 0,85% NaCl: 8,5 г NaCl / 1 л Ddh ₂ O (8,5 г / л).
2. 0,5 моль / л HEPES, рН 7,4 (растворить 59,6 г HEPES в 0,5 л DDH ₂ 0 и доведения рН до 7,4 с использованием 10 N NaOH).

2. Подготовка FITC-инулин раствора для инъекций

1. Взвесить FITC-инулин, чтобы подготовить 5%-ным раствором и растворяют в 0,85% NaCl (обычно 100 мг / 2 мл 0,85% NaCl) при нагревании до 90 ° С до полного растворения.
2. Взвесьте растворяется FITC-инулин решения и внимание весу.
3. Отрежьте 20 см кусок диализной мембраны (молекулярная масса отсечки: 1000) и положить в DDH ₂ O в течение 30 мин для удаления остаточных NaN ₃ из мембраны и промыть несколько раз впоследствии.
4. Заполните растворяется FITC-инулина в диализной мембраны и надлежащей герметизации с замыканиями.
5. Взвесьте все мембраны диализа.
6. Поместите диализной мембраны в 1 л 0,85% раствора NaCl и помешивать света защищен в течение 24 ч при роOM температуры.
7. Взвесить всей мембраны диализа снова и расчета нового концентрации (вода осмотически двигаться в мембрану и несвязанного FITC, или связаны FITC-инулин <1000 молекулярный вес будет перемещаться из мембраны и, таким образом, концентрация FITC-инулин будет существенно уменьшаться) .
8. Новый FITC-инулин концентрации (с) вычисляется по следующей формуле: C = N / V, где п = начальный ФИТЦ количество инулина, V = новый объем (разница в весе из диализной трубки до и после диализа плюс объем первичного FITC-Инулин раствора).
9. Перед использованием стерилизовать диализовали FITC-инулин раствора путем фильтрации через 0,22 мкм фильтр шприца.
10. Хранить FITC-инулин, защищенном от света (алюминиевая фольга) при 4 ° С. Диализуют и стерилизовали FITC-инулин может быть использован в течение 2 недель. Участие FITC-инулин может быть растворен путем повторного нагревания при 90 ° С в течение нескольких минут.

Примечание: при использованииFITC-sinistrin ^16-18, который не требует диализа, все шаги, необходимые для диализа может быть пропущен.

3. Инъекций и забора крови

1. Возьмем массы тела (МТ) у мышей перед экспериментом.
2. Обезболить мышей кратко изофлураном.
3. Для высокой пропускной способностью 6 мышей следуйте протоколу представлена ​​на рисунке 3.
4. Введите 2 мкл / г веса тела диализованной FITC-инулина в ретроорбитального сплетения ²⁴ с помощью G30 ½ в иглу (удалить пузырьки воздуха из шприца объемом 100 мкл Hamilton первым использованием G26 ½ в иглу, а затем переходят на G30 ½ в иглу инъекции).
5. Cut 1 мм мышь хвоста с помощью ножниц раз и сбора крови на 3, 5, 7, 10, 15, 35, 56 и 75 мин после введения в Na-гепарин minicapillaries. Уплотнение minicapillaries после сбора крови с ча-ча-уплотнение.
6. Храните образцы защищенном от света месте.
7. Положите внутрь герметичный minicapillaries гематоКритический капилляров и центрифуги в течение 5 мин.
8. Перерыв minicapillaries с помощью алмазным резцом и передачи всей плазмы с помощью пипетки в 0,2 мл трубки.
9. Убедитесь, 1:10 разбавление с использованием 2 мкл плазмы и 18 мкл 0,5 моль / л буфера HEPES (рН 7,4) в новых 0,2 мл трубки (образцы можно хранить в течение ночи при 4 ° С для измерения флуоресценции).
10. Мере 2 мкл разбавленных проб с NanoDrop 3300 в двух экземплярах. Описание и использование прибора описан здесь ^5.

4. Подготовке стандартов

1. Сбор крови от мышей того же штамма фона в покрытый гепарином гематокрита капилляров, замедления вращения и разбавленный 1:10 с 0,5 моль / л буфера HEPES (рН 7,4), обычно 80 мкл плазмы + 720 мкл буфера HEPES.
2. Развести FITC-инулин инъекционного раствора разбавленной плазмы мыши, чтобы получить следующие стандартные разведения:
   1:10: 10 мкл неразбавленного FITC-инулин раствор + 90 мкл разведенного плазме мышей
   1:100: 10 & му, L (1:10) раствор + 90 мкл разведенного плазме мышей
   1:1000: 10 мкл (1:100) раствор + 90 мкл разведенного плазме мышей
   1:2000: 30 мкл (1:1) + 30 мкл разведенного плазме мыши
   1:10000: 10 мкл (1:5) раствор + 40 мкл разведенного плазме мышей
   1:20000: 20 мкл (1:1) + 20 мкл разведенного плазме мыши
   1:100000: 10 мкл (1:5) раствор + 40 мкл разведенного плазме мышей
   Концентрация стандартов будет зависеть от диализа и всегда будет различным для каждого препарата FITC-инулин. Необходимо ввести концентрации для стандартной кривой новое каждый раз.
3. Анализ данных для расчета СКФ с соответствующим программным обеспечением (например, GraphPad Prism) с помощью двухфазного экспоненту распада, как описано здесь в ^{15, 20} и показаны на представителя разделе Результаты.

Результаты

СКФ будет вычислено с использованием следующей формулы:

СКФ = N / (A/K1 B/K2 +), где

N = объемы закачки (N = C • V, где с = FITC-концентрация инулина, V = вводимого объема)
= Span1, у-перехват устранения
K1 = константа распада для устранения
B = Span2, у-перехват распределения
К2 = постоянная распада распределения

Примечание: A, K1, K2 и B представляют собой сокращения определяется GraphPad Prism, каждое программное обеспечение, способное анализировать двухфазной экспоненциального затухания могут быть использованы, однако, другие научные программы могут использовать различные сокращения.

При использовании двухфазной кривую экспоненциального распада, который основан на плазму FITC-инулин концентрации, кривая сравнима с одним показано на рисунке 1 должна быть получена. Расчет СКФ по вышеуказанному формуле (и, как описано здесь <вир> 20) позволяет выявить нарушения функции почек или ¹⁵ клубочковой гиперфильтрацию ^{8, 23,} как обнаружили у мышей с сахарным диабетом 1 типа (рис. 2).

Рисунок 1. Для измерения СКФ в сознании мышей, плазменной кинетики FITC-инулин после однократного внутривенного введения используется. Для расчета СКФ, двухкамерные модели используется. В двухкамерной модели, начальная фаза быстрого распада представляет перераспределение FITC-инулин из внутрисосудистого отсек с внеклеточной жидкости. Позднем этапе, с более медленным распадом в FITC-инулин концентрации, в основном отражает системный клиренс из плазмы.

Рисунок 2. Detectioн диабетической гиперфильтрации в мышей дикого типа. I типа сахарный диабет вызывали внутрибрюшинным введением стрептозотоцина (STZ, 50 мг / кг в течение 5 последовательных дней). СКФ была определена ранее (основной) и 5 ​​недель после индукции диабета. Благодаря tubuloglomerular обратной связи, первичный увеличение проксимальных реабсорбции вызывает раннее диабетической гиперфильтрации ²¹ открытие, которое является воспроизводимой в мышей дикого типа (п = 10, р <0,01 по сравнению с базальным же мыши).

Рисунок 3. Блок-схема для измерения СКФ в наборе из 6 мышей. Для измерения целое почек СКФ один метод болюсной инъекции, 8 образцов крови должны быть собраны на 3, 5, 7, 10, 15, 35, 56 и 75 мин после FITC-инулин инъекции. Цифры указывают моменты времени. Цифры в скобках указывают номер пробы. Временные точки слева от вертикальной красной линии указывают инъекцийвременных точках (на 0, 11, 22, 33, 44 и 55 мин). Каждая мышь отмечено другого цвета. Чтобы получить последовательным коллекций крови следуйте стрелкам. Серые блоки указывают, когда следующий мыши должны быть готовы к изофлурана анестезии перед инъекцией. Используя этот протокол минимальное время между 2 коллекции кровь из разных мышей 1 мин.

Обсуждение

В данной работе описан способ определения СКФ в сознании мышей одной болюсной инъекции и анализ флуоресценции в 8 проб крови на две фазы экспоненциального затухания. Измерение СКФ в 1 мыши занимает 75 мин. С помощью специального блок-схему, можно измерить скорость клубочковой фильтрации из 6 мышей в 130 мин. Вполне возможно, повторить это блок-схема протокола до 4 раз в день и измерить СКФ у 24 мышей. Мы модифицировали этот метод так, что можно собрать кровь из небольшого надреза хвоста, а не прокол хвостовую вену, которая является быстрым и легким для исследователей для выполнения по сравнению с хвостом прокол вены. С помощью 10 мкл гематокрита капилляров и 1:10, можно уменьшить общее количество крови, необходимое для <100 мкл. Наконец, флуоресценцию измеряли с использованием NanoDrop 3300 fluorospectrometer, которая позволяет определять флуоресценцию в 1-2 мкл разбавленного образца. Этот метод даст заинтересованным investigatoРА истинное значение СКФ. В противоположность этому, креатинина измерений на мышах ряд недостатков в том числе "слепой креатинина диапазона" и трудности, связанные с специфичностью и чувствительностью определения. "Слепые креатинина диапазона" ограничивает его функции в качестве маркера для СКФ потому креатинина сыворотки остается в пределах нормы до 50% функции почек не потеряны ^19. Так некоторые исследователи используют генетически модифицированных мышей в своих исследованиях для изучения почечной физиологии и патофизиологии, это несет в себе следующую задачу: если предположить, нокаут мыши ген X будет иметь значительно более низкой СКФ (на 40%) по сравнению с диким типом мышь, простой перебор, сравнивая креатинина плазмы не обнаружить эту разницу. Потребность в хорошем точный метод определения СКФ становится более важным, чем меньше различий в СКФ стали.

Мыши имеют высокие концентрации некреатининовых chromagens в плазме и моче, которые мешают коммерческидоступных анализов креатинина. Как следствие, анализы, основанные на щелочной пикратом Яффе реакции завышение концентрации креатинина в плазме по сравнению с высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) определение ^{6, 13.} Еще одним ограничением является то, что сывороточный креатинин ниже пределов обнаружения нескольких коммерчески доступных анализов по сравнению с определением ВЭЖХ. Однако с помощью ферментативных реакций исследователи смогли определить креатинина в плазме на ^{10 мышей, 22.}

СКФ в аналогичном диапазоне были обнаружены в сознании мышей с использованием сопоставимых одной болюсной инъекции способа, а также мочевой FITC-инулин зазор ^14. В отличие от своих протоколов, наш протокол, используя хвост СНиП не требует специальных мер предосторожности для сохранения целостности судна по сравнению с хвостовой вены или подкожной прокола вены. Для мочевого / плазменный основанный FITC-клиренс инулина необходимо хирургическим путем имплантировать два осмотического миnipumps. Два насоса, которые необходимы для достижения достаточно высокой стационарной плазмы FITC-инулин концентрациях, которые четко отличаться от фона. Это также требует использования метаболические клетки на полную и время образец мочи. Клетки должны быть промыты для учета потери 25-37% от FITC-инулин, который в противном случае происходит без промывки.

Подводные камни использования этого FITC-инулин метода ограничены. Следователи должны быть осведомлены о следующем: (I), уверяют, что нет пузырьков воздуха в шприце для инъекций из FITC-решения, (II) полный ретробульбарная инъекции должна быть достигнута, так как количество вводят определяется расчетным СКФ и ( III) мышей, скорее всего, мочу в течение 75 мин эксперимент СКФ, так что избежать загрязнения пробы крови с мочой, которые имеют очень высокую FITC-инулин концентрации, как следствие способность концентрации почек.

Общие преимущества Oе это FITC-инулин способ включает следующее: (а) они нерадиоактивные техники (II) можно повторить измерения несколько раз в той же мыши, (III), анализ может быть выполнен в сознании мышей ( IV) не сбор мочи не требуется, и (V) с высокой пропускной опции могут быть использованы. Недостатки для одного болюсной инъекции включают необходимость диализа FITC-инулин, которые могут быть преодолены с помощью лучшего FITC-маркер, FITC-sinistrin, которая доступна в настоящее время и может быть измерено чрескожно с помощью специального миниатюрного устройства ^18. Даже если СКФ измеряется, это невозможно измерить дробным выделения жидкости или ионов с этим методом.

Взятые вместе, этот метод обеспечивает возможность высокой пропускной способ измерения СКФ в сознании мышей. Таким образом, эта техника может представлять интерес для других исследователей, которые заинтересованы в определении функции почек у мышей.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
FITC-inulin	Sigma-Aldrich	F3272
HEPES	Sigma-Aldrich	H7706
Isoflurane	Webster Veterinary	78366551
Dialysis membrane (MWCO 1000)	Spectrum Laboratories	132636
Membrane closure	Spectrum Laboratories	132736
80 μl Hematocrit capillaries	Drummond Scientific	22362566
Hematocrit centrifuge	IEC	Micro-MB
10 μl Na+-Heparin minicaps	Hirschmann	9000210
Syringe (100 μl)	Hamilton	80601
Fluorospectrometer	Thermo-Fisher Scientific	NanoDrop 3300
Filter (0.22 μm)	Spectrum Laboratories	880-26464-UE
Sealant	Châ-seal	510
Needles (G26 ½ and G30 ½)	Becton Dickinson	305111 & 305106