Un metodo ad alta velocità per la misura della velocità di filtrazione glomerulare in topi coscienti

Riepilogo

Misurazione della velocità di filtrazione glomerulare (GFR) è il gold standard per la valutazione della funzione renale. Qui si descrive un metodo ad alta produttività che permette la determinazione di GFR nei topi coscienti utilizzando una singola iniezione in bolo, determinazione della fluoresceina isotiocianato (FITC)-inulina nel plasma e calcolo di GFR da un modello di decadimento esponenziale a due fasi.

Abstract

La misurazione della velocità di filtrazione glomerulare (GFR) è il gold standard nella valutazione della funzione renale. Attualmente, gli investigatori determinano GFR misurando il livello di creatinina endogena o esogena biomarker applicata radioattivo etichettata inulina ⁽³ H o ¹⁴ C). La creatinina ha lo svantaggio sostanziale che prossimali conti secrezione tubulare per ~ 50% del totale della creatinina escrezione renale e quindi la creatinina non è un indicatore affidabile GFR. A seconda del esperimento condotto, la clearance inulina può essere determinato da una singola iniezione di bolo o infusione endovenosa continua (minipump endovenosa o osmotica). Entrambi gli approcci richiedono la raccolta di plasma o plasma e urine, rispettivamente. Altri inconvenienti di inulina radioattivo etichettata comprendono l'utilizzo di isotopi, richiede tempo preparazione chirurgica degli animali, e l'esigenza di un esperimento terminale. Qui si descrive un metodo che utilizza un singolo bolo difluoresceina isotiocianato (FITC) inulina etichettati e la misurazione della sua fluorescenza in 1-2 ml di plasma diluito. Applicando un modello a due compartimenti, con 8 raccolte sangue per topo, è possibile misurare in GFR fino a 24 topi per giorno utilizzando un protocollo flusso di lavoro speciale. Questo metodo richiede solo breve anestesia isoflurano con tutti i campioni di sangue viene raccolto in un mouse non-sobrio e sveglio. Un altro vantaggio è che è possibile seguire i mouse su un periodo di diversi mesi e trattamenti (ad esempio facendo esperimenti in coppia con cambiamenti nella dieta o applicazioni di droga). Ci auguriamo che questa tecnica di misurazione GFR è utile per altri ricercatori che studiano la funzione renale del mouse e sostituirà i metodi meno accurati di stimare la funzione renale, come la creatinina plasmatica e di azoto ureico nel sangue.

Introduzione

La velocità di formazione del plasmatico a livello glomerulare è diventata la base per valutare la funzionalità renale (velocità di filtrazione glomerulare, GFR). Il marcatore ideale per determinare la velocità di filtrazione glomerulare deve essere filtrata liberamente, né secreta o riassorbita e non metabolizzato. Tale comportamento è stato trovato per essere vero per inulina, e la clearance inulina è diventata un gold standard per la determinazione del GFR ^3. Considerando che la clearance della creatinina è ampiamente utilizzato come misura del GFR in esseri umani e gli animali, la creatinina non soddisfa i requisiti di un marcatore ideale GFR. Circa il 10 - 40% della clearance della creatinina nell'uomo è la conseguenza della secrezione tubulare attiva ^{1, 11,} e la secrezione renale della creatinina è anche importante nel topo e nel ratto ^{4, 7, 9, 22.} La disfunzione renale è noto per aumentare la secrezione tubulare di creatinina che limita il suo valore come marker di GFR ^{1, 2.} Abbiamo precedentemente dimostrato che il trasportatore anionico organico isoforma3 (OAT3) contribuisce a murino secrezione di creatinina renale ^22. Tuttavia, la clearance inulina in genere richiede l'uso di radioattivo marcato inulina ⁽³ H o ¹⁴ C). La determinazione radioattiva di inulina può essere utilizzato sia in topi anestetizzati e cosciente, ma ospita gli svantaggi dei numerosi severe norme di sicurezza e maneggiata inerenti all'uso di isotopi radioattivi. Lungo queste linee, preparazioni di liquidazione chirurgici per la determinazione di GFR stanno consumando tempo così come terminale in natura. Nel 1999 Lorenz et al. ¹² introdotto FITC-inulina come marcatore di singolo nefrone GFR in topi anestetizzati. Cinque anni più tardi Qi et al. Determinato ¹⁵ intero rene GFR in topi coscienti utilizzando FITC-inulina. Protocolli alternativi sono ora utilizzando FITC-inulina come marker esogeno per misurare GFR in topi coscienti e anestetizzato. Questi protocolli mantengono la sensibilità di inulina radioattivo utilizzando fluorescenza detectisu e aggirare gli svantaggi di lavorare con un marcatore radioattivo marcato. Il saggio di FITC-inulina è stata modificata da altri ^{7, 8} e noi ^{22, 23} per sfruttare la capacità microvolumi della NanoDrop 3300 fluorospectrometer. Ciò consente di ridurre il volume del campione totale necessario per <100 microlitri di sangue per misurazione GFR.

Con il metodo di protocollo e di alta velocità offerto in questa pubblicazione, abbiamo dimostrato la fattibilità della misura GFR in un massimo di 24 topi coscienti al giorno. Questa tecnica potrebbe essere utile ad altri ricercatori che studiano murino GFR e speriamo che andrà a sostituire i metodi meno accurati come indici di funzione renale, come la creatinina e azoto ureico nel sangue.

Protocollo

1. Soluzioni

1. 0,85% NaCl: 8,5 g NaCl / 1 l DDH ₂ O (8,5 g / L).
2. 0,5 mol / L HEPES pH 7,4 (sciogliere 59,6 g di HEPES a 0,5 L di DDH ₂ 0 e regolare il pH a 7,4 con NaOH 10 N).

2. Preparazione di FITC-inulina Injection Solution

1. Pesare FITC-inulina per preparare una soluzione al 5% e sciogliere in NaCl 0,85% (generalmente 100 mg / 2 ml 0,85% NaCl) mediante riscaldamento a 90 ° C fino a completa dissoluzione.
2. Pesare disciolto soluzione FITC-inulina e peso nota.
3. Tagliare un pezzo di 20 centimetri di membrane per dialisi (peso molecolare di cut-off: 1.000) e mettere in DDH ₂ O per 30 minuti per rimuovere residui di NaN ₃ dalla membrana e lavare un paio di volte dopo.
4. Riempire disciolto FITC-inulina in membrana di dialisi e sigillare correttamente con chiusure.
5. Pesare tutta la membrana di dialisi.
6. Mettere la membrana di dialisi in 1 L soluzione 0,85% di NaCl e mescolare lentamente luce-protetto per 24 ore a rotemperatura om.
7. Pesare nuovamente tutta la membrana di dialisi e calcolare la nuova concentrazione (acqua si sposta osmoticamente nella membrana e non legati FITC, o legati FITC-inulina <1,000 peso molecolare si sposterà all'esterno della membrana, quindi, la concentrazione di FITC-inulina diminuirà sostanzialmente) .
8. La nuova concentrazione FITC-inulina (c) è calcolato utilizzando la seguente formula: C = n / V, dove n = quantità iniziale di FITC-inulina, V = volume nuovo (differenza di peso del tubo di dialisi, prima e dopo la dialisi più un volume iniziale di soluzione FITC-inulina).
9. Prima dell'uso sterilizzare dializzato soluzione FITC-inulina per filtrazione con un filtro a siringa da 0,22 micron.
10. Tenere FITC-inulina riparo dalla luce (foglio di alluminio) a 4 ° C. Dializzato e sterilizzata FITC-inulina può essere utilizzato per un massimo di 2 settimane. Partecipato FITC-inulina può essere sciolto da ri-riscaldamento a 90 ° C per alcuni minuti.

Nota: se si utilizzaFITC-sinistrin ^16-18, che non richiede la dialisi, tutte le fasi necessarie per la dialisi possono essere saltati.

3. Iniezione e prelievo di sangue

1. Prendere peso corporeo (pc) dei topi prima dell'esperimento.
2. Anestetizzare topi brevemente con isoflurano.
3. Ad alta velocità di 6 topi si prega di seguire il protocollo previsto in Figura 3.
4. Iniettare 2 ml / g di peso corporeo del dializzato FITC-inulina nella retroorbital plesso ²⁴ utilizzando un G30 ½ a spillo (rimuovere le bolle d'aria da 100 l siringa Hamilton da prima utilizzando un G26 ½ in ago e poi passare a un G30 ½ in ago per iniezione).
5. Tagliare 1 mm coda di topo con le forbici volta e raccogliere il sangue a 3, 5, 7, 10, 15, 35, 56 e 75 minuti dopo l'iniezione in Na-eparina minicapillaries. Seal minicapillaries dopo la raccolta del sangue con Cha-sigillo.
6. Conservare i campioni al riparo dalla luce.
7. Mettere sigillato minicapillaries all'interno hematocrit capillari e centrifugare per 5 min.
8. Rompere minicapillaries utilizzando un tagliatore di diamanti e il trasferimento dell'intera plasma pipettando in una provetta da 0,2 ml.
9. Effettuare una diluizione 1:10 utilizzando 2 ml di plasma e 18 microlitri 0,5 mol / L HEPES (pH 7,4) in una nuova provetta 0,2 ml (campioni potrebbero essere memorizzati notte a 4 ° C per misure di fluorescenza).
10. Misura 2 ml di campione diluito con NanoDrop 3300 a duplicati. La descrizione e l'utilizzo dello strumento è descritto qui ^5.

4. Elaborazione di norme

1. Raccogliere il sangue da topi dello stesso ceppo di fondo rivestito in eparina ematocrito capillari, spin down e diluire 1:10 con 0.5 mol / L HEPES (pH 7,4), di solito 80 ml di plasma + 720 HEPES microlitri.
2. Diluire soluzione iniettabile FITC-inulina con il plasma del mouse diluito per ottenere le seguenti diluizioni standard:
   1:10: 10 microlitri diluito soluzione FITC-inulina + 90 microlitri di plasma topo diluito
   1:100: 10 & mu, L (1,10) soluzione + 90 ml di plasma topo diluito
   1:1.000: 10 microlitri (1:100) soluzione + 90 ml di plasma topo diluito
   1:2.000: 30 microlitri (1:1) soluzione + 30 ml di plasma topo diluito
   1:10.000: 10 ml (1,5) soluzione + 40 ml di plasma topo diluito
   1:20.000: 20 l (1:1) soluzione + 20 ml di plasma topo diluito
   1:100.000: 10 ml (1,5) soluzione + 40 ml di plasma topo diluito
   La concentrazione degli standard dipenderà dalla dialisi e sarà sempre diverso per ogni preparazione di FITC-inulina. È necessario inserire la concentrazione per la curva standard nuovo ogni volta.
3. Analizzare i dati per calcolare GFR con il software appropriato (per esempio Prism GraphPad) utilizzando una funzione di decadimento esponenziale a due fasi, come descritto in qui ^{15, 20} e mostrato nella sezione Risultati Rappresentante.

Risultati

GFR viene calcolato con la seguente formula:

GFR = n / (A/K1 + B/K2), dove

n = quantità iniettata (n = c • V, dove c = concentrazione FITC-inulina, V = volume iniettato)
A = Span1, intercetta y di eliminazione
K1 = costante di eliminazione decadimento
B = Span2, y-intercetta di distribuzione
K2 = costante di decadimento per la distribuzione

Nota: A, K1, K2 e B sono abbreviazioni date da GraphPad Prism, ogni software in grado di analizzare in due fasi di decadimento esponenziale può essere utilizzato, tuttavia, un altro software scientifico potrebbe utilizzare diverse sigle.

Impiegando un bifase esponenziale della curva di decadimento, che si basa su concentrazioni plasmatiche di FITC-inulina, una curva simile a quella mostrata in figura 1 dovrebbe essere ottenuto. Calcolo GFR dalla formula mostrato sopra (e come descritto in qui ^{20) permette di rilevare compromissione della funzione renale o 15 glomerulare iperfiltrazione 8, 23 come si trova nei topi con diabete mellito tipo 1 (Figura 2).}

Figura 1. Per misurare il GFR in topi coscienti, cinetica plasmatica di FITC-inulina a seguito di una iniezione endovenosa singola dose viene utilizzato. Per il calcolo del GFR, un modello a due compartimenti è impiegato. Nel modello a due compartimenti, la fase di decadimento rapido iniziale rappresenta la ridistribuzione di FITC-inulina dal compartimento intravascolare al fluido extracellulare. La fase successiva, con lento decadimento della concentrazione FITC-inulina, riflette prevalentemente clearance sistemica dal plasma.

Figura 2. Detection di iperfiltrazione diabetica in topi wild-type. tipo I diabete mellito è stata indotta dalla somministrazione intraperitoneale di streptozotocina (STZ, 50 mg / kg per 5 giorni consecutivi). GFR è stato determinato prima (basale) e 5 settimane dopo l'induzione del diabete. Grazie al feedback tubuloglomerular, un aumento primario nel riassorbimento prossimale provoca presto iperfiltrazione diabetico ²¹ una constatazione che è riproducibile in topi wild-type (n = 10, p <0.01 vs basale stesso mouse).

Figura 3. Flow-chart per la misura del GFR in un set di 6 topi. Per misurare l'intero rene GFR con il metodo di iniezione in bolo singolo, 8 campioni di sangue devono essere raccolti nei 3, 5, 7, 10, 15, 35, 56 e 75 minuti dopo iniezione FITC-inulina. I numeri indicano i punti di tempo. I numeri tra parentesi indicano il numero del campione. Punti temporali sinistra della linea rossa verticale indicano iniezionepunti temporali (a 0, 11, 22, 33, 44 e 55 min). Ogni mouse è contrassegnato da un colore diverso. Per ottenere raccolte di sangue sequenziali seguire le frecce. Caselle grigie indicano quando il prossimo mouse deve essere preparata per l'anestesia isoflurano prima dell'iniezione. Utilizzando questo protocollo il tempo minimo tra due collezioni di sangue da diverse topi è di 1 min.

Discussione

Il presente studio descrive una tecnica per la determinazione di GFR nei topi coscienti mediante iniezione a singolo bolo e l'analisi di fluorescenza a 8 campioni di sangue da due fasi di decadimento esponenziale. Una misura GFR in 1 mouse prende 75 min. Utilizzando uno speciale diagramma di flusso, è possibile misurare la GFR di 6 topi in 130 min. È possibile ripetere questo protocollo flow-chart fino a 4 volte al giorno e misurare GFR in 24 topi. Abbiamo modificato il metodo in modo che sia possibile raccogliere sangue da un piccolo elemento di cattura coda anziché coda puntura venosa, che è più veloce e più facile per gli investigatori di eseguire rispetto a coda vena puntura. Utilizzando 10 microlitri ematocrito capillari e una diluizione 1:10, è possibile ridurre la quantità totale di sangue necessario per <100 microlitri. Infine, la fluorescenza viene misurata utilizzando un NanoDrop 3300 fluorospectrometer, che permette la determinazione della fluorescenza in 1-2 ml di campione diluito. Questo metodo darà il investigato interessatora vero valore GFR. Al contrario, i livelli di creatinina nel topo hanno diversi punti deboli, tra cui "Campo cieco creatinina" e difficoltà legate alla determinazione specifica e sensibile. Il "range cieco creatinina" limita la sua funzione come marker per GFR perché creatinina sierica rimane nel range normale fino il 50% della funzione renale è perduto ^19. Dal momento che molti ricercatori utilizzano topi geneticamente modificati nella loro ricerca per studiare la fisiologia e la fisiopatologia renale, questo porta il seguente problema: ipotizzando un topo knockout del gene X avrebbe un GFR notevolmente inferiore (del 40%) rispetto a un topo wild-type, una screening semplice confrontando creatininemia non rileva questa differenza. La necessità di un buon metodo di determinazione accurata GFR diventa più critica più piccole le differenze di GFR diventano.

I topi hanno alte concentrazioni di chromagens non creatinina nel plasma e nelle urine che interferiscono con il commerciodisponibili saggi creatinina. Come conseguenza, saggi basati sulla picrato alcalino Jaffé reazione sovrastima concentrazione di creatinina nel plasma confrontati con cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) determinazione ^{6, 13.} Un'altra limitazione è che la creatinina sierica è al di sotto dei limiti di rilevazione di vari saggi disponibili in commercio rispetto alla determinazione HPLC. Tuttavia, utilizzando reazioni enzimatiche ricercatori potevano determinare plasmatica di creatinina nel topo ^{10, 22.}

GFR in un range simili sono stati trovati in topi coscienti usando un metodo di iniezione a singolo bolo comparabili nonché urinario gioco FITC-inulina ^14. In contrasto con il loro protocollo, il nostro protocollo utilizzando la coda snip non richiede particolari precauzioni per preservare l'integrità del vaso rispetto a vena della coda o di puntura della vena safena. Per la clearance urinaria / plasma basato FITC-inulina è necessario impiantare chirurgicamente due mi osmoticanipumps. Due pompe sono necessarie per raggiungere lo steady-state le concentrazioni di FITC-inulina abbastanza alto, che sono chiaramente distinguibili dallo sfondo. Questo richiede anche l'uso di gabbie metaboliche per una completa raccolta dell'urina e temporizzato. Le gabbie devono essere sciacquati per tenere conto di una perdita del 25-37% di FITC-inulina, che altrimenti si verifica senza risciacquo.

Le insidie ​​di utilizzo di questo metodo FITC-inulina sono limitati. Gli investigatori dovrebbero essere a conoscenza di quanto segue: (i) assicurare che non vi siano bolle d'aria nella siringa utilizzata per l'iniezione del FITC-soluzione, (ii) la completa iniezione retrobulbare deve essere raggiunto, perché la quantità iniettata determina la GFR calcolata, e ( iii) topi molto probabilmente urinare durante l'esperimento GFR 75 min, quindi evitare di contaminare campioni di sangue con l'urina, che avrà una concentrazione molto elevata FITC-inulina come conseguenza della capacità di concentrazione reni.

Vantaggi generali of questo metodo FITC-inulina sono i seguenti: (i) è una tecnica non radioattivi, (ii) è possibile ripetere le misurazioni più volte nella stessa topo, (iii) l'analisi può essere eseguita in topi coscienti, ( iv) nessuna raccolta dell'urina è richiesto, e (v) un'opzione alto-rendimento può essere utilizzato. Svantaggi per l'iniezione in bolo singolo includono la necessità di dialisi di FITC-inulina, che può essere superato utilizzando una migliore FITC-marcatore, coniugati con sinistrin, che è già disponibile e può essere misurato transcutanea mediante uno speciale dispositivo miniaturizzato ^18. Anche se GFR è misurata, non è possibile misurare escrezioni frazionarie di fluido o ioni con questo metodo.

Nel loro insieme, questo metodo fornisce la fattibilità di un metodo ad alta velocità per la misura di GFR in topi coscienti. Così, questa tecnica potrebbe essere di interesse per altri ricercatori che sono interessati nel determinare la funzione renale nei topi.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
FITC-inulin	Sigma-Aldrich	F3272
HEPES	Sigma-Aldrich	H7706
Isoflurane	Webster Veterinary	78366551
Dialysis membrane (MWCO 1000)	Spectrum Laboratories	132636
Membrane closure	Spectrum Laboratories	132736
80 μl Hematocrit capillaries	Drummond Scientific	22362566
Hematocrit centrifuge	IEC	Micro-MB
10 μl Na+-Heparin minicaps	Hirschmann	9000210
Syringe (100 μl)	Hamilton	80601
Fluorospectrometer	Thermo-Fisher Scientific	NanoDrop 3300
Filter (0.22 μm)	Spectrum Laboratories	880-26464-UE
Sealant	Châ-seal	510
Needles (G26 ½ and G30 ½)	Becton Dickinson	305111 & 305106